Este método pode ser utilizado para a avaliação quantitativa da maturação de sarcomere em cardiomiócitos derivados do iPSC. Usando essa abordagem baseada em super resolução, é possível detectar até mesmo alterações sutis na organização sarcomere, o que não é possível com imagens confocal convencionais. Pelo menos três horas antes do uso, ligue o microscópio e leve a amostra à temperatura ambiente.
Quando o microscópio estiver pronto, adicione 300 microlitros de tampão de imagem PALM a um poço de células rotuladas e insira o slide da câmara no suporte do estágio do microscópio. Selecione o objetivo do óleo 1.57 NA 100X e use o modo PALM no software de imagem e ative as configurações de TIRF. Defina o número de quadros para 5.000 a 10.000, a potência laser UV para 0,1% e o laser de 647 para 0,2% e o nível de ganho para 50 a 100.
Quando todos os parâmetros de aquisição tiverem sido definidos, ligue a iluminação do laser e selecione uma célula alvo. Para adquirir uma imagem, aumente a potência laser 647 para 100% e reduza o ganho a zero. Alvejar a célula alvo por cerca de cinco segundos, depois aumente o ganho para 50 e inicie a aquisição de imagem PALM.
Para reconstrução dos dados palm, no final da aquisição, abra os dados no ImageJ e abra o plugin Thunderstorm. Selecione a análise de execução no plugin e abra o menu de configuração da câmera. Digite o tamanho do pixel e o ganho eletromagnético.
No menu de análise de execução, defina a ordem B-spline para três, a escala B-spline para dois, o limiar de intensidade máxima para stfwave. f1, o raio de montagem para três, o sigma inicial para 1.6, a ampliação para cinco, a frequência de atualização para 50, e o lateral muda para dois, e clique em OK. Após a reconstrução, selecione sigma no menu histograma de enredo e use a ferramenta retângulo para selecionar uma região de interesse, excluindo possíveis artefatos. Adicione a região de interesse ao filtro e adicione e incerteza menos de 25 à região dos valores de juros.
Na guia remover duplicatas, digite um limiar de distância de 10 nanômetros. Na aba de fusão, defina a distância máxima para 20, os quadros máximos por molécula a zero, e o máximo off frames para um. Na guia de correção de deriva, selecione a correlação cruzada e defina o número de lixeiras e a ampliação para cinco, em seguida, salve a imagem PALM final e exporte os dados pós-processo.
Para analisar o comprimento do sarcomere, importe a imagem de interesse reconstruída da PALM no ImageJ e use a ferramenta de linha para desenhar uma linha entre as estruturas de sarcomere selecionadas perpendiculares ao disco Z para medir a menor distância entre os filamentos de actin. No menu de análise, selecione o perfil do enredo e adquira o comprimento entre os dois picos. Para analisar a espessura do disco Z, converta a imagem PALM reconstruída em uma imagem de modo de oito bits e abra o plugin Ridge Detection.
Defina a largura da linha para 20, o contraste alto para 230, o baixo contraste para 10, o sigma para 0,79, o limiar inferior para 25,84, e o comprimento mínimo da linha para 20. Selecione a largura de estimativa, amplie a linha e exiba resultados, em seguida, clique em OK e use a largura média da linha da tabela de resultados para análise posterior. Cardiomiócitos derivados do iPSC e células neonatais apresentam um padrão de atoinina alfa semelhante com estruturas irregulares de sarcomere desápsia.
A avaliação quantitativa demonstra que o comprimento e a espessura dos filamentos alfa actinin são quase idênticos entre os dois grupos de células que indicam um estado de desenvolvimento prematuro de cardiomiócitos derivados do iPSC. Em contraste, os cardiomiócitos maduros adultos exibem uma rede regular de sarcomere com um comprimento de sarcomere ligeiramente aumentado e espessura reduzida do disco Z. Uma comparação entre imagens confocal convencionais e PALM não revela diferença significativa no comprimento do sarcomere.
No entanto, uma profunda espessura reduzida do disco Z é detectada quando os cardiomiócitos iPSC são submetidos à imagem PALM. Observa-se um ganho de resolução quando o PALM é aplicado, que é suportado pelas parcelas de intensidade correspondentes. Notavelmente, as estruturas de sarcomere adquiridas usando um buffer de baixa qualidade parecem ser mais espessas em comparação com estruturas capturadas em condições ideais de imagem.
Essa falta de precisão dos dados deve-se às propriedades piscando reduzidas do fluoróforo, resultando em menos fótons detectados por evento de localização. Além disso, a precisão de localização é diminuída, diminuindo a resolução geral da imagem PALM reconstruída. Além disso, a deriva da amostra pode afetar a localização precisa das moléculas fluorescentes, resultando em imagens embaçadas.
Para adquirir imagens palm adequadas, é muito importante permitir o equilíbrio térmico de todo o sistema de imagem para evitar o excesso de deriva da amostra durante a imagem. Após esse procedimento, outras estruturas celulares, como mitocôndrias, podem ser imagens pelo PALM para adquirir parâmetros adicionais de maturação do cardiomiócito.
