Este protocolo fornece configurações experimentais para realizar co-culturas 2D e 3D controláveis em micro-dispositivos para visualizar e monitorar crosstalks tumor-imune celular e analisar os efeitos de tratamentos anti-câncer. Essa tecnologia fornece visualização fácil e em tempo real do recrutamento e interações de células imunes e pode ser empregada para amostras humanas e derivadas de pacientes. É compatível com a maioria das microscopias de última geração.
Quem demonstrará o procedimento será Francesco Noto, estudante de doutorado do Departamento de Oncologia e Medicina Molecular, Istituto Superiore di Sanita, e Nicoleta Manduca e Esther Maccafeo, estudantes de doutorado na Università Cattolica del Sacro Cuore, Departamento de Medicina e Cirurgia Translacional. Os chips são previamente ativados por plasma em um limpador de plasma ou máquina de gravação de ferro reativo em sala limpa. Células murina-esplênicas e uma linhagem de células tumorais são utilizadas aqui para mimetizar os protocolos descritos no texto.
Antes de carregar as suspensões das células, retire os meios de todos os seis reservatórios. Em seguida, carregue lentamente 1 x 10 até a 5ª célula tumoral ressuspensa em 10 a 50 microlitros de meio de crescimento no reservatório superior esquerdo e no poço inferior. No lado direito, pipetar suavemente 1 x 10 para a 6ª célula imune flutuante ressuspensa em 50 microlitros de meio de crescimento em dois poços.
Quando todas as células tiverem sido adicionadas, preencha todos os seis reservatórios de cada chip com até 100 a 150 microlitros de meio de cultura e verifique se as células foram corretamente distribuídas dentro de cada compartimento de cultura. Incube o chip por uma hora para permitir que o sistema se estabilize antes da gravação em time-lapse. Para imagens de células vivas, monte o tumor imune na placa de chip no estágio do microscópio.
Personalize a configuração do fluxo de trabalho de aquisição na interface do software do microscópio, como o Incucyte Live-Cell Analysis Software. Selecione janelas de observação, a taxa de quadros ideal e a duração do tempo, dependendo dos parâmetros apropriados para o experimento e os tipos de células em estudo. Imagem das células para o período de tempo experimental apropriado.
Preparar duas alíquotas de matrigel diluídas com meio contendo um fármaco ou uma combinação de fármacos para as duas condições experimentais utilizando pontas frias. Pipetar suavemente células tumorais coradas por corante fluorescente, compatíveis com vivo, suspensas em solução matricial sobre gelo para obter uma distribuição homogênea das células. Com a placa de chip em um bloco de resfriamento ou em uma cesta com gelo, injete lentamente a solução de matriz de células tumorais tratadas com drogas nas portas de gel esquerda e direita usando pontas frias de micropipeta de 10 microlitros.
Aplique uma pressão suave para empurrar a solução matricial de um lado para o outro do canal. Quando todas as células tumorais tiverem sido carregadas, coloque o dispositivo na incubadora na posição vertical por 30 minutos. Ao final da incubação, uma vez concluída a gelificação da matriz, preencher os canais médios de todos os seis reservatórios com 50 microlitros de meio de cultura.
Verificar a integridade do gel polimerizado e a distribuição das células tumorais ao microscópio. Em seguida, coloque os chips em uma incubadora até que a preparação das células imunes esteja completa. Após a incubação, aspirar o meio de cada poço.
Coloque a ponta perto da entrada do canal médio médio e use pressão moderada para injetar suavemente 10 microlitros de 10 às 6ª células imunes marcadas com um corante fluorescente contrastante. Injetar 50 a 100 microlitros do meio em cada um dos quatro poços de canais laterais, 40 a 90 microlitros do meio no poço central superior e 50 a 100 microlitros do meio no poço central inferior. Quando todos os poços tiverem sido carregados, use um microscópio para confirmar que a distribuição das células imunes permaneceu confinada à câmara central.
Em seguida, coloque cuidadosamente o dispositivo em uma superfície nivelada na incubadora de cultura de células até a obtenção de imagens. Para calcular a extensão das células imunes vivas coradas fluorescentemente infiltrando os compartimentos tumorais, obtenha imagens do dispositivo em pontos de interesse de tempo específicos por microscopia de fluorescência e defina os parâmetros apropriados da câmera no software de imagem do microscópio, como o Nikon NIS-Elements. Também definir os parâmetros para células imunes marcadas.
O movimento dos leucócitos através de pontes microcanais adequadamente construídas na plataforma microfluídica em direção às células-alvo pode ser rastreado por microscopia de vídeo. Nesta análise de rastreamento, PBMCs individuais foram desafiados com células cancerosas mortas tratadas com doxorrubicina ou PBS vivas. Valores relevantes de quimiotaxia e gráficos de migração foram gerados automaticamente, e um perfil migratório diferente para as células imunes foi observado quando co-carregado com células de câncer de mama expostas à doxorrubicina ou PBS.
Quando os PBMCs foram confrontados com células cancerosas apoptóticas, eles cruzaram microcanais em direção às células moribundas e mortas, mas não cruzaram para células vivas não tratadas. Uma fração de leucócitos com densidade crescente ao longo de 24 a 48 horas exibiu contatos de longo prazo com células cancerosas tratadas com doxo. Nesta análise, um novo modelo de tumor imunocompetente 3D foi usado para quantificar o recrutamento de células imunes em resposta a combinações anticâncer de drogas epigenéticas.
PBMCs marcados com corante vermelho foram então distribuídos homogeneamente na câmara fluídica central. A capacidade das duas massas tumorais de atrair as CMSP foi então comparada, com as CMSP sendo recrutadas de forma robusta neste experimento para o microcanal direito. Para o modelo 3D, misturar a solução com hidrogel e células sobre gelo, evitando bolhas e pré-polimerização.
Injete lentamente sem pressão excessiva. Ajustar as etapas de polimerização de acordo com a matriz utilizada. Ensaios de células vivas/mortas e perfil de secreção de citocinas a partir de sobrenadantes podem ser implementados.
A imunofluorescência para imagens confocais pode ser realizada para classificar os subtipos imunes e para marcadores de expressão de ativação e exaustão da maturação.
