Aqui, fornecemos um fluxo de trabalho que inclui o melhor método bioinforático para conduzir os experimentos para avaliar o efeito do glifosato nos microbiomas. A principal vantagem é que ele fornece uma hipótese testável robusta para futuros experimentos de campo e laboratório. A metodologia descrita pode ser aplicada a uma variedade de sistemas, incluindo plantas, animais e micróbios.
Cada parte da metodologia é bastante simples. Talvez a parte mais desafiadora seja integrar uma equipe multidisciplinar capaz de realizar diferentes partes do trabalho. Demonstrando o procedimento estará Suni Matthew, uma pesquisadora do meu laboratório.
Para começar, comece a experimentar um dividindo o campo experimental em 10 réplicas de controle e tratamento GBP com tiras tampão de vegetação entre as parcelas. Trate os lotes de controle com água da torneira e os lotes GBP com GBP comercial para imitar a dosagem máxima permitida de glifosato nas práticas agrícolas. Prove a microbiota de plantas experimentais.
Colete 10 réplicas das amostras da planta do campo, coloque-as imediatamente no gelo e leve-as ao laboratório para posterior processamento. Para o experimento dois, colete roupas de cama, incluindo aparas de madeira, fezes e alguma ração derramada de codornas alimentadas com rações contaminadas ou de controle de GBP em um experimento aviário de 12 meses. Envie as amostras de cama para um laboratório credenciado para as medidas de concentração de glifosato diretamente após sua disseminação.
Plante plantas perenes de grama e morango em cada parcela para estudar sua microbiota raiz e folha. Identifique e remova os micróbios endofíticos lavando e esterilizando as amostras da planta. Uma vez que as amostras sejam esterilizadas, extraia DNA genômico usando um kit de extração de DNA vegetal comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante.
Utilizando uma abordagem aninhada, amplie as regiões variáveis V6 a V8 do gene rRNA 16S e faça mistura mestre pcr para o número necessário de amostras conforme descrito no manuscrito do texto. Para a primeira rodada de PCR, use primers 799 para a frente e 1492 reverso. Configure o perfil de amplificação no termociclador para 35 ciclos.
Para verificar a amplificação, realize a eletroforese utilizando cinco microlitres do produto amplificado e, em seguida, dilua os outros 25 microliters do produto PCR em água ultrapura autoclavada na proporção de um a 10. Utilizando os primers universais 1062 para a frente e 1390 invertidos, realize a segunda rodada de amplificação com 25 ciclos. Diluir os produtos PCR resultantes em água ultrapura autoclavada em uma proporção igual.
Realize a terceira rodada de amplificação com oito ciclos para marcar os produtos com os códigos de barras e a sequência do adaptador P1. Verifique a concentração na qualidade dos produtos PCR em um bioanalíquio e acumule os volumes que constituem 30 nanogramas de DNA de cada amostra em um tubo de 1,5 mililitro para preparar uma biblioteca equimolar. Selecione os amplicons de tamanho 350 a 550 pares base por fracionamento de tamanho usando um sistema automatizado de seleção de tamanho de DNA em um de gel agarose.
Colete o elto contendo os amplicons do tamanho especificado em um frasco no resultando em uma biblioteca genética de rRNA purificada de 16S. Transfira o eluente coletado em um tubo de 1,5 mililitro e verifique a pureza e concentração no bioanalífero. Diluir a biblioteca de DNA usando água ultrauso autoclavada para uma concentração final de 26 picomolar.
Para amplificar a região DES, após configurar a reação com os primers ITS, defina o perfil de amplificação no termociclador. Em seguida, analise cinco microliters do produto amplificado em gel de 1,5% agarose e dilua os 25 microlitadores restantes do produto na proporção de um a 10 utilizando água ultrapura autoclavada. Faça mix mestre pcr para o número necessário de amostras com primers avançados marcados por código de barras e primers reversos marcados pelo adaptador P1.
Usando o produto PCR diluído como modelo, conduza a segunda rodada de amplificação. Semelhante à preparação da biblioteca para o gene rRNA 16S, prepare a biblioteca para a região ITS purificada. Inicie as análises bioinformáticas da sequência de proteínas EPSPS.
Avalie a sensibilidade potencial da sequência de consulta ao glifosato do servidor fornecido saídas onde a saída mostra a fração de marcadores de aminoácidos presentes nas sequências de consulta e o número de motivos. A saída dois mostra alinhamentos da consulta e sequências de referência baseadas em resíduos de marcadores. A saída três mostra alinhamentos completos em pares das sequências de consulta e referência.
A saída quatro mostra sequências de referência EPSPS de Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis e Streptomyces davawensis. No final da página de saída, encontre links para ferramentas externas como BLASTp e domínios conservados para analisar melhor a sequência de EPS de consulta. Depois de identificar as sequências de EPSPS a partir dos repositórios públicos, acesse esses conjuntos de dados da página principal do servidor da classe EPSPS contendo informações taxonomicas e a classe EPSPS de mais de 50.000 sequências.
Pesar a biomassa acima do solo das plantas no final da temporada de campo para comparar o crescimento das plantas em GBP e parcelas de controle. Em uma planilha, mapeie as OTUs bacterianas para experimentos de microbioma em conjuntos de dados pré-computados. E baseado em um escore probabilístico, calcule a sensibilidade intrínseca ao glifosato.
Este método foi utilizado para quantificar alterações na sensibilidade da proteína EPSPS em um nível micro evolutivo. Identificamos alterações no estado de sensibilidade em 12 dos 32 grupos intimamente relacionados de procariotes analisados. Assim, o uso contínuo contínuo dos produtos à base de glifosato pode produzir disbiose microbiana nos microbiomas vegetais, animais e solo.
Garanta a qualidade dos procedimentos pré e pós-PCR para obter bibliotecas de amplicon ideais. Certifique-se também de que a sequência de proteínas EPSPS não é parcial antes de usar o software. Em experimentos de campo, certifique-se de evitar a contaminação de controles com glifosato.
