Paradigmas de aprendizagem associativa sensorial revelaram muito sobre a função do cerebelo e sua relação com o resto do cérebro, e comportamento. Usando o camundongo como organismo modelo, apresentamos um método com detalhes suficientes para laboratórios ao redor do mundo implementarem esses métodos poderosos de forma eficaz e barata. Nosso protocolo permitirá que os pesquisadores configurem múltiplos comportamentos dependentes de cerebelo.
As funções principais de nossa plataforma de pesquisa podem ser prontamente modificadas para se adequar a uma determinada questão de pesquisa. Para começar, conecte o cabo de interface serial da câmera à câmera e a porta da câmera no SBC. Em seguida, baixe o sistema operacional para o SBC no computador host e crie um arquivo chamado ssh no cartão microSD.
Ejete o cartão microSD da máquina host. Insira-o no slot do cartão SBC microSD e doe o SBC. Em seguida, para preparar o SBC para aceitar uma conexão com fio ao host, abra um terminal, digite o comando ifconfig"" e regise o endereço IP Ethernet do SBC.
Em seguida, vá para a guia Interface da configuração Raspberry Pi e habilite as opções para câmera, SSH e VNC. Para estabelecer a conexão com fio, conecte um cabo Ethernet à porta Ethernet no SBC e um computador host e conecte a outra extremidade desses cabos a um interruptor Ethernet. Em seguida, usando um cliente de computação de rede virtual, como o VNC, acesse a área de trabalho usando o endereço IP SBC e a autenticação padrão.
Em seguida, baixe o software necessário e bibliotecas Python necessárias para o SBC. Para permitir o controle direto sobre o microcontrole, baixe o ambiente de desenvolvimento integrado do microcontrole ou software IDE. Em seguida, abra uma janela do terminal SBC, navegue até o diretório Downloads e instale o IDE.
Depois de abrir o IDE microcontrolador, selecione Ferramentas, seguido de Gerenciar bibliotecas e instale a biblioteca Encoder de Paul Stoffregen. Finalmente, insira um pen drive em uma porta USB no SBC e digite os comandos para a montagem do dispositivo de armazenamento externo USB. Depois de conectar o SBC à porta de programação do microcontrole, abra o esboço de download com o IDE microcontrole e carregue-o para o microcontrole.
Em seguida, baixe e instale a versão apropriada do IDE Arduino no computador host. Em seguida, baixe o DTSC_US. esboço ino para o computador hospedeiro.
Conecte o cabo USB A a USB B ao computador host e ao microcontrole. Abra o esboço e carregue-o para o microcontrole. Conecte fios à prancha do microcontrole, LEDs, codificador rotativo, motor de estepe com motorista e válvula solenoide com motorista.
Em seguida, ligue um canal de uma fonte de alimentação para os pinos positivo-V e GND do motor do estepe. Depois de ligar a fonte de alimentação, defina a tensão do canal anexada para 25 volts. Em seguida, ligue o chumbo positivo de uma fonte de alimentação para o pino de retenção do motorista da válvula solenoide, e o outro chumbo positivo para o pino de tensão de espigão.
Depois de ligar a fonte de alimentação, defina o canal conectado à tensão de espigão a 12 volts, e o canal conectado à tensão de retenção a 2,5 volts. Em seguida, conecte uma fonte de ar regulada a uma pressão de 20 libras por polegada quadrada à válvula solenoide. Em seguida, para fazer a roda de corrida, corte uma roda de três polegadas de um rolo de espuma, e faça um furo de 25 cm no centro exato da roda.
Em seguida, insira um eixo de 25 cm na roda e fixe-o no lugar usando cubos de fixação. Fixar o codificador rotativo a um canal de alumínio de 4,5 polegadas. Em seguida, estabilize o canal de alumínio na tábua de alumínio.
Depois de fixar a roda ao codificador rotativo, estabilize o lado livre do eixo da roda com um rolamento inserido em um grampo final de ângulo reto, instalado em um poste óptico montado em prancha. Em seguida, posicione as amarras da cabeça usando postes ópticos e grampos postais de ângulo reto. Em seguida, posicione o LED de estímulo condicional e a saída da válvula solenoide para o estímulo incondicional dec ao redor da roda montada.
Em seguida, monte o motor de estepe usado para o estímulo incondicional DTSC e Pi Camera em um post óptico. Coloque a matriz de luz infravermelha no mesmo lado da Câmera Pi, ligeiramente acima e diretamente voltada para onde o rosto do animal será posicionado. Faça um estímulo tátil para condicionamento tátil retardado do início, gravando espuma na borda de um pedaço de acrílico.
Monte em um eixo de 25 cm usando um cubo de fixação e, em seguida, conecte o estímulo tátil ao eixo do motor do estepe. Para implantar uma placa da cabeça, anestesiar o rato, em seguida, fazer uma incisão com um bisturi ao longo da linha média do couro cabeludo, da borda traseira dos olhos para o crânio. Espalhe a incisão aberta e aperte ambos os lados com hemostatas para mantê-la aberta.
Usando cola cianoacrilato, conecte a placa da cabeça ao crânio. Em seguida, aplique uma mistura de pó de cimento dental, solvente e catalisador em todas as áreas do osso exposto. Sutura a pele fechada, atrás e na frente da placa da cabeça.
Em seguida, injete analgesia pós-operatória, permitindo que o mouse se recupere por pelo menos cinco dias. Para preparar os ratos para sessões de comportamento, permita que eles se habituam à plataforma, montando-os na contenção da cabeça. Antes da sessão, certifique-se de que a saída da válvula solenoide esteja centrada no olho alvo, posicionada a menos de um centímetro de distância, e o estímulo tátil esteja centrado no nariz do mouse, posicionado a aproximadamente 1,5 centímetros de distância.
Para a preparação da sessão DTSC, inicie a GUI a partir de um terminal SBC. Execute uma sessão de teste de três ensaios e certifique-se de que os dados registrados que imprimem no terminal mostram uma deflexão superior a 20, mas menos de 100 passos. Para executar uma sessão, monte um mouse na contenção da cabeça e inicie a GUI a partir do terminal SBC.
Para salvar gravações da câmera, aperte o botão Transmitir antes de iniciar a sessão. Insira informações de identificação do animal no campo de identificação animal e aperte o botão Definir. Em seguida, insira os parâmetros de experimento desejados e aperte o botão Upload para Arduino".
Finalmente, aperte a Sessão start para começar a sessão. Os resultados do treinamento DEC de uma sessão de gravação com iluminação aceitável são mostrados aqui. As condições aceitáveis de iluminação resultaram em um bom contraste entre o olho e a pele periocular.
O desempenho de um único mouse treinado para oito sessões mostrou traços comportamentais, sem resposta condicionada no mouse não treinado, e respostas robustas condicionadas uma vez que o mouse é treinado. Um vídeo de teste de amostra mostra um mouse treinado fechando seu olho com sucesso em resposta ao estímulo condicional do LED, enquanto o mouse não treinado não pisca até o estímulo incondicional. A resposta condicionada aumenta em tamanho e frequência através de sessões comportamentais realizadas ao longo dos dias.
Condições de iluminação subótima limitam severamente a qualidade dos dados adquiridos. Quando o contraste entre o olho e a pele circundante é baixo, pequenas mudanças na imagem podem alterar significativamente a forma registrada da resposta incondicionada em uma única sessão, e diminuir a relação sinal-ruído para detectar posição das pálpebras. Os resultados de treinamento do DTSC para um mouse treinado para cinco sessões são apresentados aqui.
Um vídeo de teste de amostra mostra um mouse treinado apoiando com sucesso a roda em resposta ao estímulo condicional do LED, enquanto um mouse não treinado não consegue mover a roda até que o estímulo tátil incondicional seja aplicado. A frequência e amplitude da resposta condicionada aumentam à medida que o treinamento prossegue. Em uma coorte de animais treinados com um estímulo incondicional que produziu respostas incondicionadas de baixa amplitude, nenhum animal aprendeu a produzir respostas condicionadas consistentemente após quatro dias de treinamento.
Para um comportamento bem-sucedido, o conforto do animal enquanto corre na plataforma é crítico. É importante garantir que a roda gira livre e uniformemente antes de habituar animais à plataforma. Usando esta plataforma flexível, nós temos conseguido imaginar e perturbado a atividade dos neurônios Purkinje, as células de saída do cerebelo, durante o aprendizado em animais fixos na cabeça.
