Biosurfactantes são as moléculas ativas da superfície empática produzidas por microrganismos que têm a capacidade de reduzir a tensão superficial do líquido e a tensão interficial entre duas fases diferentes. A natureza empática dessas moléculas permite que elas se alinhem na interface entre duas fases diferentes, e melhorem a solubilização de uma fase em outra. Os biosurfactantes têm ganhado muita atenção em comparação com suas contrapartes químicas devido às várias vantagens que oferecem.
Estes incluem maior especificidade, menor toxicidade, maior diversidade estrutural, facilidade de preparação, maior biodegradabilidade, maior compatibilidade ambiental e sua atividade em condições extremas de meio ambiente. Neste vídeo, demonstramos os métodos envolvidos na triagem, caracterização e biosurfactantes aplicação, produzidos por diferentes cepas de rodococcus, lysinibacillus e paenibacillus. Ilustramos ainda os métodos para avaliar a aplicação da combinação de biosurfactantes, produzida por essas três cepas microbianas na recuperação de óleo residual por uma técnica de coluna de blocos de areia.
O trabalho foi realizado sob a orientação do Dr. Preeti Srivastava e do Dr. Manoj Kumar. Para o crescimento de micróbios, inocular os frascos contendo cem mililitros de caldo luria autoclaved, adicionando um mililitro de cultura de sementes cultivada durante a noite ao frasco dentro do armário de fluxo de ar laminar. Incubar os frascos em uma incubadora rotativa a 30 graus Celsius e 180 RPM por sete dias.
Após a conclusão do período de incubação, colhe os frascos e transfira o caldo de cultura para os tubos de centrífuga. Centrifugar a cultura a 4.500 G por 20 minutos em uma centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius. Despeje suavemente o supernatante sem células em um béquer fresco, e use-o em ensaios de triagem para produção biosurfactante.
Para triagem da produção biosurfactante por um ensaio de colapso de queda, pegue um escorregador de vidro limpo e cubra a superfície do slide com 200 microliters de óleo. Agora adicione 20 microliters de supernanato livre de células ao centro do óleo, e deixe-o imperturbável por dois a três minutos. Se a queda entrar em colapso, marque o supernatant positivo para a presença de biosurfactante.
Em ensaio de espalhamento de óleo, pegue 20 mililitros de água dupla destilada em uma placa de Petri e adicione 200 microliters de petróleo bruto na superfície da água. Agora adicione 20 microliters de supernanato livre de células ao centro do óleo, e deixe-o imperturbável por um minuto. Se uma zona de desobstrução for formada como resultado do deslocamento do óleo, escore o positivo sobrenatante para a presença de biosurfactante.
No ensaio do índice de emulsão, adicione quatro mililitros de gasolina e supernanato livre de células cada um em um tubo de vidro limpo. Em seguida, o que a mistura vigorosamente por três minutos e deixá-la imperturbável para as próximas 24 horas. Para medir a tensão superficial do supernanato sem células, limpe o recipiente de vidro com o líquido cuja tensão superficial deve ser determinada.
Adicione o líquido no recipiente e monte o recipiente no porta-vasos. Desbloqueie o suporte da sonda e monte a sonda nele. Usando o controlador manual ajuste a altura da plataforma, de modo que a sonda esteja a dois ou três milímetros de distância da superfície do líquido.
Em seguida, vá para os softwares e siga os passos mencionados no papel para medir a tensão superficial. Após a conclusão da medição, baixe a altura da plataforma e desbloqueie e desmonte a sonda e o vaso do instrumento. Para extração de biosurfactante, ajuste o pH do supernanato livre de células para dois, usando dois ácidos clorídricos normais.
Armazene a mistura a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione o volume igual de mistura de metanol de clorofórmio e misture vigorosamente por 20 minutos. Deixe a mistura intacta para que ocorra uma separação gratuita.
Remova a face superior, contendo água e metanol, e deixe a face inferior contendo biosurfactante para evaporar em um capô de fumaça. Após a evaporação da fase orgânica, ressolar o biosurfactante colorido de mel em três mililitros de clorofórmio, e usar essa mistura para caracterização e identificação do biosurfactante. Para caracterização cromatográfica do biosurfactante extraído, local 20 microlitres de biosurfactante em placas TLC.
Depois de secar as placas, coloque a placa TLC dentro da câmara saturada com mistura de metanol clorofórmio e execute o TLC. Para detecção lipídica, adicione alguns grânulos de iodo na câmara fresca e satura a câmara por cinco a 10 minutos. Coloque o TLC dentro da câmara e observe para o desenvolvimento de manchas amarelas.
Para detecção de proteínas e carboidratos, pulverize a placa TLC com não hidrogênio ou anisaldeído, e aqueça a 110 graus Celsius e observe para o desenvolvimento da cor. Para análise de RN, insira o tubo na chave inglesa. Ajuste a altura do tubo usando tubo ajustado.
Coloque o tubo NMR, juntamente com a chave inglesa em uma máquina mr e siga os passos mencionados no papel para obter um espectro NMR. Para um experimento de recuperação de óleo aprimorado, pegue uma coluna de vidro e sele a saída inferior com lã de vidro e contas de vidro. Recue a coluna com solo de Areia de tal forma que algum líquido possa ser adicionado no topo do solo.
Monte a coluna no suporte e adicione algumas contas de vidro em cima do solo. Inundar a coluna com 50 mililitros de solução de salmoura e coletar o fluxo através para determinar o volume ruim. Remova a salmoura da coluna forçando o petróleo bruto a passar por ela.
Colete o volume de salmoura e óleo que sai da coluna para determinar o volume inicial de saturação do óleo. Após 24 horas, alage a coluna com 10 volumes fracos de salmoura, e recolhe o óleo que sai da coluna para estimar a recuperação secundária do óleo. O óleo deixado na coluna após a recuperação secundária do óleo corresponde ao óleo residual.
Agora prepare uma mistura de biosurfactantes adicionando o biosurfactante extraído a um béquer de vidro. E adicione o biosurfactante e a mistura à coluna, e deixe-o imperturbável pelas próximas 24 horas. Após 24 horas, meça a quantidade de óleo e água que tem aludido para fora da coluna para determinar a recuperação adicional ou aprimorada do óleo.
Os supernaentes livres de células das três cepas microbianas foram positivos para a presença de biosurfactantes, pois resultaram em colapso de gota, propagação de óleo e formação de emulsão. A confirmação da produção biosurfactante foi fornecida pela medição da tensão superficial do caldo livre de células. Devido ao crescimento de rhodococcus e lysinibacillus, a tensão superficial do meio reduziu de 59 para 45 mN por metro.
Devido ao crescimento do paenibacillus, a tensão superficial do meio reduziu de 59 para 28,4 mN por metro. Os ensaios de estabilidade da emulsão mostraram que os biosurfactantes produzidos pelas três cepas microbianas apresentaram grande estabilidade em condições diversas e ambientais. Os índices de emulsão não apresentaram nenhuma alteração significativa quando a temperatura de incubação, o pH e a concentração de sal do caldo livre de células foram alterados.
A caracterização do DLC do biosurfactante extraído mostrou que os biosurfactantes produzidos pelas três cepas eram glicóliptos. A identificação química dos biosurfactantes mostrou que rodococcus e lisinbacillus produziram o mesmo biosurfactante, que foi identificado como rhamnolipid, com uma massa de cerca de quatro 80 daltons. Paenibaccilus, por outro lado, produz um rhamnolipid contendo três cadeias lipídicas com uma massa de cerca de 802 daltons.
A combinação de biosurfactantes foi capaz de recuperar 56,5% do óleo residual da coluna de areia. A produção biosurfactante das cepas de rodococcus, iinibaccilus e paenibacillus foi avaliada, e as cepas foram positivas para a produção de biosurfactante. Os biosurfactantes produzidos foram caracterizados e identificados como rhamnolipids.
Como a combinação biosurfactante foi bem sucedida na recuperação de 56% do óleo residual em uma técnica de embalagem de areia, a combinação biosurfactante pode ser usada em aplicações de campo para recuperar o óleo residual preso dentro dos reservatórios de petróleo.
