A RNAi tornou-se um método eficaz para identificar a função dos genes em nematoides e são propostas como uma nova maneira de controlar efetivamente nematoides patogênicos. RNAi está absorvendo nematoides no dsRNA pode ser suficiente para o procedimento. Para começar, colete os nematoides pelo método do funil Baermann.
Para isso, coloque um tubo de borracha preso abaixo de um funil e coloque duas camadas de papel filtro na boca do funil. Transfira as culturas fúngicas botrytis cinerea para o funil e adicione água para imergir o tapete fúngico. Quando os nematoides forem coletados, adicione 500 microliters de reagente de extração e 100 microliters de contas magnéticas a um tubo de centrífuga de dois mililitros.
Aspire 20 microliters dos nematoides e triture as amostras a 9.000 x g durante 30 segundos. Incubar por cinco minutos e centrífuga a 12.000 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um tubo de centrífuga fresco.
Adicione 100 microliters de clorofórmio e misture invertendo o tubo várias vezes. Incubar por três minutos e depois centrífuga a 12.000 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Novamente, transfira o supernatante para um tubo de centrífuga fresco.
Adicione 250 microliters de álcool isopropílico e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 12.000 x g por 10 minutos e vórtice. Descarte o supernatante e adicione 500 microliters de 75% de etanol para lavar o RNA.
Vórtice a amostra seguida de centrifugação a 12.000 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Seque a pelota de RNA por cinco minutos e resuspense-a em 30 microliters de água livre RNase. Calcule a concentração de RNA usando esta fórmula e calcule a razão A260 a A280.
Em seguida, use um par de primers para amplificar a sequência de codificação parcial do gene BX ppm-1 do B.xylophilus. Em seguida, clone as sequências genéticas ppm-1 em um vetor pGEM-T Easy contendo o promotor T7. Recupere o fragmento genético ppm-1 do par base 894 usando o plasmídeo clonado como modelo para pcr.
Em seguida, use um kit de transcrição in vitro para sintetizar o dsRNA. Analise a qualidade do dsRNA usando um espectotômetro e visualize os produtos em um gel de 1%agarose. Adicione quatro microliters de tampão de imersão 5X e compõe o volume para 20 microliters com água dupla destilada para obter uma concentração final de RNA de 0,8 microgramas por mililitro.
Em seguida, coloque os nematoides no prato por 30 minutos e espere os ovos aderirem ao fundo. Remova cuidadosamente a água e os nematoides sem perturbar os ovos até que apenas os ovos permaneçam no prato. Eclode os ovos coletados no escuro a 25 graus Celsius durante 24 horas para obter larvas J2.
Recolhe as larvas em um tubo e lave-as três vezes com água dupla destilada. Em seguida, transfira as larvas para o tubo contendo a solução dsRNA. Para isso, adicione solução resorcinol para obter uma solução de 1%.
Coloque as larvas sobre uma mesa de agitação para garantir a absorção suficiente de dsRNA nas larvas. Para controles, mergulhe a mesma quantidade de nematoides no buffer de imersão sem a sonda dsRNA ou com uma sonda DSRNA GFP. Realize um qPCR usando os genes actB e tbb-2 como referências internas para avaliar as mudanças no nível de expressão genética.
Use o método delta delta ct para estimar o nível relativo de expressão genética da curva de dissolução e do valor de TC. Depois da RNAi, cultura as larvas J2 até a idade adulta em gramados de Botrytis cinerea em placas PDA. Colete os adultos usando o método do funil Baermann, conforme mostrado na seção um.
Adquira imagens dos nematoides adultos sob um microscópio e use o software ImageJ para medir o comprimento corporal de 50 nematoides masculinos e 50 fêmeas. Analise os dados calculando a média e o desvio padrão de cada amostra. Aplique o teste do aluno para comparar os meios das amostras dos diferentes grupos.
A análise relativa da expressão genética após o RNAi indicou que o ppm-1 dsRNA pode efetivamente inibir a expressão do ppm-1 um gene de B.Xylophilus. Considerando que o exógeno GFP dsRNA não teve efeito na expressão ppm-1. Após a RNAi, o tamanho dos adultos diminuiu acentuadamente, apesar de atingir a maturidade sexual resultando no fenótipo mutante de pequeno tamanho corporal.
O comprimento médio do corpo das fêmeas mutantes e machos foi de 544 e 526 micrômetros em comparação com 971 e 912 micrômetros para o grupo controle O mais importante é transferir os nematoides para a solução de RNA de dois fios e adicionar outro reagente para estimular os nematoides a se alimentarem. Este método é adequado para tela genética em grande escala e é comumente usado em pesquisas celulares. Estudar a função genética de B.Xylophilus por este método tem valor norteador para o controle biológico de B.Xylophilus.
