Este protocolo propôs um modelo de epilepsia com amígdala como origem. Ele abre o caminho para a investigação das estruturas do lobo temporal mesial. Esse modelo pode ser interpretado como a base do experimento.
Como este protocolo é um método de baixo custo e eficiente, pode ser realizado rapidamente na maioria dos laboratórios. Demonstrando o procedimento estará Yongchang Lu, uma pós-graduada em nosso laboratório. Comece por reunir os componentes pré-preparados, começando com pedaços de dois centímetros de comprimento de fio de tungstênio revestido de Teflon com um diâmetro de urso de 76,2 micrômetros.
Um pedaço de fio de prata com um diâmetro de urso de 127 micrômetros do mesmo comprimento e um conjunto de dois por dois pinos de corda calibrados. Use um isqueiro para queimar uma extremidade de cada fio de tungstênio para remover cinco milímetros do revestimento de isolamento. Descasque uma seção de fio multi-fio ultrafino.
Desembrulhe da parte inferior para a extremidade superior, onde começa a escurecer continuando até o topo. Combine este fio super fino e o fio de tungstênio apertando uma extremidade e torcendo suavemente a outra, permitindo que os dois materiais sejam facilmente entrelaçados. Puxe suavemente para garantir que os fios estejam bem enrolados e corte o excesso de fio super fino.
Tente manter o fio de tungstênio reto durante todo o processo. Fixe o pino da corda na braçadeira na mesa de soldadura com o lado mais longo dos pinos virado para fora. Use a agulha da seringa para pegar um pouco de pasta de solda e aplicá-la aos pinos.
Aqueça a tocha de soldagem a 320 graus Celsius. Derreta e espalhe um fio de estanho sem chumbo com a ponta da tocha. Sobreponha a extremidade superior do fio de tungstênio com uma agulha dos pinos da corda e use a solda na tocha para ligar o fio de tungstênio ao pino.
Solde outro fio de tungstênio e outro fio de prata no pino da corda da mesma maneira para que cada fio corresponda a uma agulha. Corte dois tubos termoencolhíveis um pouco mais longos do que a extremidade superior do fio de tungstênio. Coloque-os na junta de solda de dois fios de tungstênio, garantindo que a parte condutora esteja totalmente coberta no tubo para que o circuito dos dois fios de tungstênio não seja colocado em série.
Remova o eletrodo da braçadeira da mesa de soldagem e segure o eletrodo suavemente com um alicate grande, pois é fácil que os eletrodos percam sua forma ao aquecer o tubo encolhível. Use uma boa braçadeira de condutividade térmica com um pouco mais de força. Ligue o duto de ar e aqueça até que uma temperatura de 320 graus Celsius seja atingida.
Sopre o tubo termoencolhível por vários segundos até que ele esteja apertado. Reforce o eletrodo com adesivo hot melt. Segure os dois fios de tungstênio e torça-os juntos, mantendo suas extremidades separadas.
Aparar os fios de tungstênio torcidos para aproximadamente 10 milímetros de comprimento para que a separação nas extremidades não exceda 0,5 milímetros. Verifique os eletrodos com um multímetro, colocando uma barra do multímetro no lado não soldado dos pinos da corda e tocando suavemente a extremidade do fio de tungstênio ou fio de prata na outra barra. Verificar se o circuito está liso.
Certifique-se de que as linhas não sejam colocadas em série. Descasque cinco milímetros da pele de isolamento em cada extremidade para expor o fio de metal no interior. Adicione uma seção de tubulação termoencolhível a cada fio de partida.
Solde cada fio com o plugue do conector do dispositivo EEG. Reduza o tubo termoencolhível com ar quente. Adicione uma seção de tubo termoencolhível a cada fio do rotor.
Parafuse as partes condutoras dos fios vermelho e laranja e solde-as a uma junta e ao cabeçalho para encaixar o pino da corda. Solde os outros dois fios no conector a cada junta. Pese o mouse.
Quando o rato estiver totalmente anestesiado, raspe o cabelo do olho para a área da orelha com uma navalha. Corrija o mouse no quadro estereotáxico. Coloque os dentes superiores da frente na barra incisiva e insira ambas as barras auriculares com profundidades iguais nas orelhas.
Aplique pomada ocular eritromicina nos olhos para evitar a secura e cegueira causada pela luz brilhante durante a cirurgia. Desinfetar a área cirúrgica pelo menos três vezes com swabs alternados de iodóforo e álcool a 75%. Faça uma incisão longitudinal para expor totalmente a área cirúrgica ou faça uma incisão triangular, desde que exponha as fontanelas anteriores e posteriores e os locais de implantação de eletrodos.
Enrole um pequeno pedaço de algodão em uma bola e molhe-o com 3% de peróxido de hidrogênio. Remova o tecido mole ligado ao crânio esfregando suavemente a área exposta com uma pequena bola de algodão até que a fontanela anterior e posterior seja vista. Ajuste as alturas anterior e posterior para que a fontanela anterior e posterior fique horizontal.
Considere a posição da fontanela anterior como a origem dos eixos. Fixe um parafuso de aço inoxidável no crânio cerebelar esquerdo. Defina as coordenadas para a amígdala que se acende a partir do bregma e ajuste o dispositivo estereotáxico para localizar esse ponto e marcá-lo.
Faça um furo no local da marcha com uma broca de crânio de 0,5 milímetro de diâmetro. Fixe os eletrodos na haste de localização do dispositivo estereotáxico. Coloque o eletrodo verticalmente acima do orifício e solte a posição para menos 4,9 milímetros lentamente.
Enrole o fio de prata ao redor do parafuso três vezes. Tomando cuidado para não agitar o corpo do eletrodo durante a operação. Misture o cimento dentário e aplique-o suavemente na superfície do eletrodo e do crânio.
Quando o cimento dentário endurecer, modifique o exterior até que o cimento que envolve o eletrodo fixo se transforme em um cone. Em seguida, solte o eletrodo do dispositivo estereotáxico. Remova o mouse e coloque-o de volta na gaiola.
Mantê-lo separado dos outros ratos. Coloque o mouse em uma caixa personalizada com cabos deslizantes conectando o eletrodo na cabeça do mouse e o dispositivo de EEG. Passe o cabo através de um orifício na tampa da caixa e ajuste o comprimento deixado na caixa para permitir que o mouse se mova livremente.
Ligue o dispositivo EEG e verifique se ele funciona corretamente. Defina os parâmetros do estimulador para fornecer pulsos de onda quadrada monofásicos de um milissegundo a 60 hertz para uma duração de trem de um segundo por 10 ciclos de estimulação. Comece com uma intensidade de corrente de 50 microamperes para a primeira estimulação.
Monitore o EEG para após a descarga caracterizada por picos de alta frequência. Se não for observada uma descarga após a descarga, adicione 25 microamperes ao próximo estímulo e continue este processo a cada 10 minutos até que uma descarga após a descarga seja observada e dure cinco segundos. Estimule o rato com a intensidade de corrente determinada a cada 15 minutos, não mais do que 20 vezes por dia.
Monitore as respostas comportamentais ao estímulo. A cirurgia de implantação de eletrodos foi realizada em seis camundongos adultos saudáveis C57 black 6 e a estimulação elétrica foi realizada duas semanas após a cirurgia. O nível de convulsão comportamental aumentou gradualmente com o aumento do número de estímulos e o número de estímulos necessários para o acendimento completo foi registrado.
O EEG após as descargas durou de cinco a 15 segundos. Em seguida, as descargas espontâneas intracranianas se intensificaram e os sintomas comportamentais começaram. A duração da convulsão foi geralmente inferior a um minuto, o que reduz o risco de morte por convulsões graves, resultando em apneia.
A expressão de c-Fos no tecido cerebral foi detectada por imuno-histoquímica duas horas após o acendimento completo. Os resultados mostram que a expressão de c-Fos na amígdala ipsilateral aumentou significativamente verificando a viabilidade deste modelo. A separação das extremidades do fio de tungstênio não deve exceder meio milímetro, caso contrário, não passará pelo orifício do cérebro.
O comprimento do eletrodo não deve ser muito longo, caso contrário, afetará a atividade dos camundongos.
