A inclinação do estágio do espécime fornece uma maneira simples e generalizável de aumentar a distribuição de orientação das partículas durante a coleta de dados crio-EM de partícula única. A distribuição uniforme das partículas obtidas devido à inclinação do estágio do espécime permite a melhoria da qualidade geral do mapa e da interpretabilidade. Comece alinhando o microscópio para garantir a iluminação paralela do espécime e minimizar as aberrações do coma.
Para identificar os quadrados adequados para a coleta de dados, registre um atlas de grade sem inclinação do estágio ou com inclinação do palco, que fornece uma visão geral da qualidade geral da grade e uma indicação inicial de áreas adequadas para a coleta de dados. Inspecione os quadrados manualmente na ampliação usada no nó de aquisição de quadrados. Procure os quadrados onde a folha está intacta, não parece desidratada e tem espessura de gelo ideal, e mova o estágio do espécime para um quadrado de interesse.
Determine a altura eucêntrica para a posição do estágio usando um wobbler alfa em torno de 15 graus de inclinação do estágio e ajuste a altura Z para levar o estágio à altura eucêntrica usando o painel do teclado para o microscópio. Certifique-se de que a mudança de imagem seja mínima durante a rotina de oscilação alfa. Para encontrar uma altura Z mais precisa, estime no nó focalizador na ampliação usada no nó de aquisição quadrado.
Ajuste as configurações do nó do focalizador e ative ou desabilite a opção de foco Z fino durante a fila inicial de quadrados. Em seguida, pressione Simular. Inclinar o estágio do espécime para o ângulo de inclinação desejado para a coleta de dados na altura eucêntrica verdadeira e recentralizar o estágio, se necessário.
Pressione Simular no nó de aquisição quadrado para iniciar a fila de destinos para exposições inteiras do nó de aquisição. Em seguida, selecione um alvo de foco Z e regiões com furos adequados para exposições de alta ampliação e envie os alvos para a fila de geração de imagens. Traga o estágio do espécime de volta ao seu estado não inclinado e, em seguida, mova para o próximo quadrado.
Repita essas etapas até que um número adequado de exposições inteiras tenha sido enfileirado. Depois que todos os quadrados estiverem na fila, vá para todo o nó de direcionamento e pressione Enviar destinos em fila. Selecione Permitir a verificação pelo usuário de alvos selecionados nas configurações do nó e inspecione manualmente os alvos selecionados pelo nó de aquisição de alta exposição à ampliação para testar se o localizador de furos EM automatizado pode identificar com precisão as regiões adequadas para aquisição de imagem quando o estágio da amostra é inclinado.
Quando o usuário estiver satisfeito com a precisão da segmentação, desmarque a opção Permitir a verificação do usuário de destinos selecionados para coleta automatizada de dados. As imagens representativas da grade em ampliação quadrada com diferentes ângulos de inclinação coletados perto e longe da altura Z eucêntrica são mostradas aqui. O centro do feixe é indicado pelo centro dos anéis concêntricos vermelhos e a seta verde indica o quadrado de interesse.
Há um recurso de grade quebrada adjacente ao quadrado de interesse para referência. Aqui são mostradas as exposições representativas de furos e médias de classe 2D coletadas em ângulos de inclinação de 0 graus, 30 graus e 60 graus. Embora a concentração de proteína seja inalterada nos diferentes ângulos de inclinação, um ângulo de inclinação mais alto faz com que a área fotografada pareça mais lotada em termos de concentração de partículas.
As médias de classe 2D afetadas pela superlotação são mostradas nesta caixa vermelha. A simplicidade do protocolo permite que qualquer usuário padrão do microscópio adapte facilmente uma estratégia de coleta de dados inclinada.
