O protocolo aqui demonstrado possibilita a marcação e o isolamento de linhagens celulares específicas presentes nos folículos ovarianos a partir dos estágios iniciais do antral, possibilitando a análise e cultura em alta resolução. Esta abordagem altamente precisa utiliza combinações de anticorpos conjugados fluoróforos para marcadores de superfície celular alvo que são robusta e especificamente expressos entre linhagens discretas de granulosa, estroma e teca. Comece colocando o ovário em uma placa de Petri estéril e despeje um meio resfriado com ele para hidratar o tecido, garantindo que o ovário fique semi-submerso no meio.
Remova quaisquer suturas ou outro material e disseque o tecido residual circundante longe do ovário. Para isolar os folículos antrais, identifique folículos individuais e escolha folículos saudáveis. Excluir folículos cheios de sangue, escuros ou não simétricos.
Isolar os folículos antrais escolhidos do ovário com bisturi, mantendo o antro intacto e excisando o tecido cortical que engloba o folículo. Coloque cada folículo antral intacto excisado em um poço da placa de seis poços. Usando uma régua colocada abaixo da placa, determine o diâmetro do folículo para fins descritivos.
Com bisturi, bissetriz o folículo antral intacto para avaliar a cavidade antral e adicionar seis mililitros de meio de descolamento enzimático de células antes de incubar a placa em estufa umidificada por 10 minutos. Após a incubação, adicionar seis mililitros de meio disponível contendo 20% de soro fetal bovino, ou FBS, e lavar com o meio por pipetagem vigorosa repetida sobre os folículos bissectados com uma micropipeta P-1000. Em seguida, colete o meio e passe por um filtro de 100 milímetros.
Depois de centrifugar o sobrenadante filtrado a 300 G e quatro graus Celsius por três minutos antes, aspirar o sobrenadante. Colocar o tecido remanescente em uma mistura de 100 unidades por mililitro de colagenase e uma unidade por mililitro de dispase diluída em solução salina balanceada antes de 30 minutos de incubação. Romper mecanicamente o tecido triturando e pipetando vigorosamente duas vezes após 10 e 20 minutos.
Uma vez feito, recupere o tecido e lave por pipetagem, através de uma ponteira de micropipeta P-1000, e coe através de um filtro de 100 mililitros. Centrifugar o tecido coado a 300 G e quatro graus Celsius por três minutos antes de colocar o pellet de células enriquecido com as células da teca e células do estroma no gelo para marcação e FACS. Para identificar as células da granulosa e as células da teca, ressuspender os pellets celulares em uma solução de bloqueio contendo anticorpos diretamente conjugados e incubar a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Depois de lavar e centrifugar as células, ressuspendê-las em tampão FACS contendo 4-6 diamidino-2-fenilindol, ou DAPI, e executar a suspensão celular através de um instrumento FACS para capturar uma pequena população de células, usando a intensidade fluorescente de anticorpos conjugados fluoróforos para gating. Bissetriz o restante do ovário. Excise a medula usando tesouras finas curvas e bisturis, evitando danos ao córtex ovariano.
Continue o processamento e o afinamento do córtex ovariano raspando suavemente até que a medula mínima permaneça. Divida o tecido cortical em tiras de dois a três milímetros de largura ao longo do comprimento do ovário. Para congelamento do tecido ovariano, colocar uma tira cortical em cada frasco para injetáveis criogénicos refrigerado contendo a solução de congelação.
Agitar os frascos para injetáveis criogénicos que contêm as tiras corticais numa placa giratória durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Nuclear a formação de cristais de gelo tocando cada frasco de crio com uma ponta de algodão brevemente imersa em nitrogênio líquido. As células ovarianas foram coletadas e as frações celulares foram separadas dos folículos antrais FACS com mais de 95% de pureza.
CD99 especificamente marcadas com células granulosas em PVRL1, ou nectina, foi cada vez mais localizada no compartimento celular do oóforo granuloso à medida que os folículos antrais aumentavam de tamanho. Observou-se que os anticorpos contra endoglina ou CD55 demarcavam especificamente todas as células do estroma e da teca e que a alanina aminopeptidase era expressa especificamente pelas células tecais androgênicas. As células foram marcadas com um anticorpo direcionado contra CD99 para identificar células da granulosa e anticorpos contra CD45 foram usados para excluir células hematopoéticas.
Os anticorpos contra PVRL1 separaram a população de células da granulosa em oóforo e compartimentos murais. Após digestão enzimática com colagenase dispase, as preparações celulares marcadas com anticorpos contra CD55, CD34 e alanina aminopeptidase permitiram a captura de todas as células do estroma ou teca ou células tecais androgênicas com a exclusão das células endoteliais das populações das células da teca. Tome especial cuidado para evitar interromper o antro dos folículos durante o isolamento inicial do folículo, cortando dentro de uma margem segura ao redor das bordas do folículo.
A jusante desse procedimento, as células podem ser utilizadas para análise molecular ou diagnóstica ou, alternativamente, cultivadas in vitro para estudos toxicológicos, análises experimentais ou recapitulação do microambiente folicular. Até o momento, esses métodos foram usados para modelar distúrbios endócrinos envolvendo o ovário e para identificar novas subpopulações de células associadas aos folículos.
