Este trabalho foi financiado pelo Programa da Juventude da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82304670).

1. Preparação experimental
<ol><li>Certifique-se de que, durante o crescimento das plantas, a umidade relativa da estufa seja de 75%, as temperaturas dia/noite sejam de 20 °C/10 °C, o fotoperíodo seja composto de 12 h de dia e 12 h de noite e a intensidade da luz seja de 100 μmol·m-2·s-1. Forneça irradiância por meio de lâmpadas de diodo emissor de luz (LED), mantendo uma distância de 30 cm entre a lâmpada LED e a copa da planta. NOTA: O fotoperíodo e a intensidade da luz estão de acordo com o número de horas de sol durante o período de crescimento em Yunnan. A irradiância é medida rotineiramente por um sensor quântico (consulte a Tabela de Materiais). Faça as alterações necessárias nos parâmetros ambientais de acordo com as características da planta medicinal. Uma vez que essas condições ambientais tenham sido cuidadosamente calibradas com base nas características da planta e no perfil regional da luz solar, é fundamental manter a consistência nessas configurações durante todo o experimento. Alterações arbitrárias nos parâmetros ambientais após seu estabelecimento inicial podem comprometer a integridade do experimento e a confiabilidade dos resultados.</li>
	<li>Use uma abordagem hidropônica18 para garantir a precisão e especificidade de nosso experimento. Certifique-se de que as mudas de PPY lavadas de 2 anos (colhidas em Wenshan, província de Yunnan (104 ° 11′E, 23 ° 04′N) sejam imersas em uma concentração padrão de 1/4 da solução nutritiva de Hoagland por 3 dias para adaptação.<ol><li>Prepare a solução nutritiva de Hoagland (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções; adicione 1,26 g de pó de Hoagland e 0,945 g de pó de nitrato de cálcio em 4 L de água purificada. Preparar a solução de 13C6-glicose (ver quadro de materiais) conforme descrito no manual normalizado; adicione 0,2 g de pó de 13C6-glicose em 100 mL de água purificada ou solução nutritiva de Hoagland.</li>
		<li>Prepare o tanque hidropônico e a bomba de oxigênio (Figura 2; consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Na configuração hidropônica, a utilização de uma solução de 13C6-glicose para rotulagem contorna a influência dos microrganismos do solo, garantindo assim que a solução contribua diretamente para a rápida síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais. Para otimizar as condições de absorção de 13C6-Glicose pelas plantas, é imprescindível regular a vazão da bomba de oxigênio entre 4 e 8 L/min. Essa taxa de fluxo controlada é crucial para evitar que as mudas flutuem sobre a superfície da água, o que pode prejudicar significativamente sua capacidade de absorver o 13C6-Glicose de forma eficaz. Manter as mudas submersas na profundidade correta permite a absorção eficiente do composto de rotulagem, garantindo assim o sucesso do processo de síntese de metabólitos no sistema hidropônico.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Operação de experimento de rotulagem de carbono
<ol><li>Configure quatro tratamentos e rastreie os órgãos de síntese e as vias de PS VII e PS II em PPY para demonstrar que as folhas são o principal órgão de síntese de PS.<ol><li>No Tratamento 1, a muda de PPY não se alimenta; no Tratamento 2, pulverize as folhas da muda de PPY com 0,2% de 13C6-Glicose; no Tratamento 3, alimente os rizomas de mudas de PPY com 0,2% de 13C6-Glicose; no Tratamento 3, alimente a muda de PPY na incisão do caule com o 0,2% de 13C6-Glicose (Figura 2A). NOTA: O tratamento 1 é definido como um grupo de controle. O tratamento 2 é configurado para demonstrar que as folhas podem sintetizar o PS. Os tratamentos 3 e 4 são configurados para demonstrar que os rizomas podem absorver 13C 6-glicose.</li>
		<li>Nos Tratamentos 1 e 2, cultivar as mudas de PPY em solução nutritiva normal de Hoagland. Pulverize 5 mL de solução de 13C6-glicose a 0,2% uma vez pela manhã, tarde e noite nas folhas do Tratamento 2.</li>
		<li>Nos Tratamentos 3 e 4, cultivar as mudas de PPY em solução nutritiva de Hoagland contendo 0,2% de 13C6-Glicose. No Tratamento 4, use um bisturi (ver Tabela de Materiais) para cortar os caules das mudas de PPY do meio, mas mantenha os feixes vasculares presos.</li>
		<li>Deixe cada tratamento ser rotulado por 3 dias e troque a solução nutritiva a cada 1,5 dias. Conduza o experimento usando um delineamento de blocos casualizados e repita cada tratamento 3x. NOTA: Ao pulverizar as folhas, é importante colocar um papel absorvente atrás das folhas pulverizadas. Isso evita que gotículas de água caiam na solução nutritiva abaixo, o que poderia afetar os resultados do experimento. Os cortes nas hastes não são todos removidos, mas têm conduítes presos que são visíveis a olho nu.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Métodos de amostragem e preparação
<ol><li>Colete folhas, caules, rizomas e raízes de cada tratamento separadamente no final do experimento de 3 dias com 13C6-glicose. Lave bem os órgãos vegetais coletados para remover as impurezas da superfície. NOTA: A ausência de abundância de 13C pode ser encontrada pela análise LC-MS da solução de lavagem, o que prova que a lavagem está limpa19.</li>
	<li>Use um forno elétrico de secagem por explosão de temperatura constante (consulte a Tabela de Materiais) para secar os órgãos da planta lavados. Comece a 105 °C por 30 min e depois ajuste a 60 °C até peso constante. Esmague os órgãos da planta seca em pó usando um moedor rápido de amostra totalmente automático (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: O pó é usado para análise quantitativa das proporções PS VII, II e 13C / 12C em diferentes órgãos da planta.</li>
	<li>Use uma balança analítica eletrônica (consulte a Tabela de Materiais) para pesar com precisão 30 mg de pó para cada amostra e coloque-a em 2 mL de etanol-água a 75% v/v. Use um limpador ultrassônico CNC (consulte a Tabela de Materiais) e execute a extração ultrassônica a 25 °C por 20 min (60 kHz), repita 2x; Juntar as soluções de extracção e preparar três amostras paralelas20. NOTA: Erros no peso da amostra devem ser minimizados.</li>
	<li>Use nitrogênio para secar a solução de extração e, em seguida, dissolva em metanol cromatográfico até um volume de 1 mL. Antes da injeção, use um filtro de fase orgânica de 0,22 μm (consulte a Tabela de Materiais) para filtração (Figura 2B). NOTA: Não sopre o extrato ao secar com gás nitrogênio; O extrato deve ser passado através de uma membrana microporosa para garantir que as impurezas interfiram minimamente.</li>
</ol>4. Configuração e operação de LC-MS
<ol><li>Configuração MS<ol><li>Ative a bomba de vácuo girando o interruptor para a posição ligado. Abra a válvula principal no cilindro de gás argônio e, em seguida, ajuste a válvula de pressão parcial para atingir uma pressão alvo de cerca de 0,3 MPa. Em seguida, certifique-se de que a válvula de gás nitrogênio também esteja aberta.</li>
		<li>Inicie o software de controle MS (consulte a Tabela de Materiais). Clique na fonte de ionização por eletrospray aquecida (Fonte HESI) no painel do software e insira os parâmetros, incluindo a tensão capilar (3.0 kV para modo negativo), a temperatura capilar (350 °C), vazão do gás da bainha (N2) (35 unidades arbitrárias), vazão do gás auxiliar (N2) (15 unidades arbitrárias)), por meio de varredura completa com base na massa molecular do PS (operado de m/z 100-1.500). Clique no botão Aplicar para ativar a fonte de íons. NOTA: Aguarde pelo menos 8 h para garantir um grau de vácuo suficiente para as condições experimentais. Verifique se a pressão do gás de argônio e nitrogênio é alta o suficiente antes da análise.</li>
	</ol></li>
	<li>LC pré-corrida<ol><li>Prepare a fase móvel A misturando ácido fórmico a 0,1% com água e use acetonitrila para a fase móvel B (consulte a Tabela de Materiais). Desgaseifique ambas as fases em um sonicador de banho de ultrassom por 15 minutos para eliminar os gases dissolvidos. Em seguida, conecte a fase móvel A à sua respectiva passagem de fluido e faça o mesmo com a fase móvel B. Finalmente, misture uma solução de metanol-água 1:9 v / v para o fluido de limpeza e encha a bomba e os frascos injetores manualmente. NOTA: A frequência do sonicador do banho de ultrassom é de 40 kHz.</li>
	</ol></li>
	<li>Estabelecimento do método LC<ol><li>Selecione o botão "Configuração do instrumento" para acessar a janela de edição de método.</li>
		<li>Pressione o botão "Novo" para iniciar a criação de um novo método de instrumento LC-MS.</li>
		<li>Defina o tempo total de execução para o método LC. Em seguida, insira os valores necessários para o limite de pressão, vazão total, gradiente de fluxo, temperatura da amostra, temperatura da coluna e delta de temperatura pronta na janela de edição do método. NOTA: As configurações do método do instrumento LC-MS são adaptadas ao analito de interesse e ao tipo de coluna de cromatografia líquida utilizada. Para obter os melhores resultados, use uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min com uma coluna BEH C18 mantida a 40 °C (consulte a Tabela de Materiais). A eluição do gradiente é configurada da seguinte forma: comece em 10% B, aumentando linearmente para 30% B ao longo de 8 min, depois para 45% B de 8 a 16 min, para 50% B de 16 a 24 min e para 70% B de 24 a 30 min. Imediatamente após isso, reverta o gradiente para a condição inicial de 10% B dentro de 0,1 min, mantendo-o lá por mais 2,9 min. Injetar um volume de amostra de 5 μL para cada análise. As configurações do método do instrumento LC-MS dependem da substância específica a ser analisada e do tipo de coluna de cromatografia líquida usada21.</li>
	</ol></li>
	<li>Aquisição de MS<ol><li>Na guia Configurações , escolha o tipo de experimento MS geral ou MSn para a configuração do método MS. Insira os valores necessários para configurar o tempo de aquisição, polaridade (positiva ou negativa), faixa de massa, número da válvula de desvio e duração da válvula de desvio. Depois de inserir esses detalhes, clique no botão "Salvar" para finalizar e salvar essas configurações como um método de instrumento. NOTA: As configurações padrão sem coluna de cromatografia são as seguintes: tempo de aquisição, 2 min; polaridade, positiva ou negativa; faixa de massa, 100 a 1.500.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar espectrometria de massa de múltiplos estágios de acordo com métodos convencionais.<ol><li>Sempre empregue o modo de aquisição dependente de dados (DDA) para coleta de dados em espectrometria de massa de vários estágios. No modo DDA, o espectrômetro de massa identifica os cinco íons mais intensos durante cada varredura no primeiro estágio da esclerose múltipla em tandem, que são posteriormente fragmentados e examinados no segundo estágio da espectrometria de massa em tandem. NOTA: Os dados coletados de MS e MS/MS podem ser usados para análise subsequente e pesquisa em banco de dados.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Aquisição, análise e cálculo manual de dados
<ol><li>Aquisição e análise dos dados<ol><li>Clique duas vezes nos arquivos brutos para abrir todos os espectros de massa do MS. Calcule manualmente os valores de diferença m/z entre o íon e os íons de fragmento correspondentes.</li>
		<li>Importe os arquivos de dados brutos dos tratamentos de controle e amostra e brancos para o software de análise de espectrometria de massa para identificar PSs calculando com precisão a massa e os fragmentos de PS. NOTA: PS VII e PS II são identificados por comparação com os tempos de retenção e a cooperação de soluções-padrão autênticas. LC-MS detecta uma série de pequenos picos nas posições dos picos de íons moleculares. A proporção de cada série de picos de íons isotópicos é constante. Quando os isótopos exógenos de 13C são administrados, a abundância total de 13C na planta aumenta e as proporções da série de picos de íons isótopos de metabólitos secundários da planta mudam. A tolerância máxima de erro de massa é definida em 5 ppm.</li>
		<li>Digitalize a faixa de massa m/z 500-1.500 para identificar o pico básico. Determine o peso molecular preciso com 4 casas decimais, de acordo com o peso molecular preciso e o tempo de retenção da molécula alvo. Procure a área de pico do fluxo de íons isótopos seriais e derive valores para M−, (M+1) −, (M+2) −, (M+3) − e (M+4) −. Quando a fase móvel contém ácido fórmico, os íons negativos também incluem (M+COOH) −, (M+COOH+1) −, (M+COOH+2) −, (M+COOH+3) − e (M+COOH+4) −. NOTA: A seleção de picos dentro da faixa de massa m/z 500-1.500 melhora a precisão da identificação de picos de íons moleculares para PS VII e PS II. Por exemplo, o espectro de massa de íons negativos do PS VII (C51H82O21, 1030.5349) ioniza principalmente com íons COOH− em mistura de ácido fórmico e água. Os íons isótopos seriais observados incluem 1029.53−, 1030.54−, 1031.54−, 1032.55−, 1033.55− e estendendo-se até 1079.56−.</li>
	</ol></li>
	<li>Cálculo de dados<ol><li>Para reduzir o efeito da abundância natural de 13C, calcule as proporções de correntes de íons marcadas e não marcadas para cada órgão sob diferentes tratamentos, concentrando-se especificamente nas proporções (M + 1) - / M −, (M + 2) - / M −, (M + 3) - / M − e (M + 4) - / M −. Para diferenciar entre isótopos marcados e naturais para uma avaliação precisa da incorporação de 13C, calcule essas proporções para n = 1, 2, 3, 4 usando a equação (1). Razão = A (M+2) −/ AM− (1) PS: (M+2) − inclui (M+2+COOH) − e (M+2) −; M− inclui (M+COOH) - e M−. NOTA: Aqui, M− refere-se às áreas de pico combinadas de correntes iônicas para (M+COOH) − e M −, principalmente ionizadas com COOH− em ácido fórmico-água. A representa a área do pico. Por exemplo, as fórmulas para calcular as proporções PS VII são ilustradas da seguinte forma: Relação + 1 = (A1030,54 + A1076,55) / (A1029,53 + A1075,55) Relação + 2 = (A1031,54 + A1077,55) / (A1029,53 + A1075,55) Relação+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55) Relação+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)</li>
	</ol></li>
</ol>

Identificação de órgãos primários em plantas medicinais usando marcação de 13C6-glicose

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+developments+in+medicinal+plant+genomics+enabled+the+diversification+of+secondary+metabolites'+biosynthesis.">The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites' biosynthesis.</a> Int J Mol Sci. 23 (24), 15932 (2022).</li><li>Wen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+paris+saponin+vii+mainly+occurs+in+leaves+and+is+promoted+by+light+intensity.">The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity.</a> Front Plant Sci. 14, 1199215 (2023).</li><li>Siadjeu, C., Pucker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medicinal+plant+genomics.">Medicinal plant genomics.</a> BMC Genomics. 24 (1), 429 (2023).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+phenomics+of+arabidopsis+thaliana:+Metabolic+profiling+by+one-+and+two-dimensional+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+and+transcriptome+analysis+of+albino+mutants.">Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants.</a> J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).</li><li>Masakapalli, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+phenotype+of+tobacco+hairy+roots+engineered+for+increased+geraniol+production.">Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production.</a> Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).</li><li>Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flux+model+of+glycolysis+and+the+oxidative+pentosephosphate+pathway+in+developing+brassica+napus+embryos.">A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos.</a> J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A implementação bem-sucedida deste protocolo depende de pesquisas abrangentes sobre propriedades fisiológicas de plantas, tecidos, órgãos e metabólitos secundários. A abordagem de design experimental descrita no protocolo estabelece uma base robusta para investigar as vias biossintéticas dos metabólitos secundários das plantas. Os fatores críticos neste experimento são (1) determinar a idade das mudas perenes e (2) escolher o tempo correto de detecção de marcação de isótopos. As plantas medicinais são c...

As vias biossintéticas dos metabólitos secundários nas plantas são intrincadas e diversas, envolvendo órgãos de acumulação altamente específicos e diversos1. Atualmente, os locais de síntese específicos e os órgãos responsáveis pelos metabólitos secundários em muitas plantas medicinais não estão bem definidos. Essa ambigüidade representa um obstáculo significativo para o avanço estratégico e a implementação de métodos de cultivo projetados para otimizar o rendimento e a qualidade dos materiais medicinais.
Técnicas de biologia molecular, bioquímica e marcação de isótopos são amplamente empregadas para desvendar as vias de síntese e locais de metabólitos secundários em plantas medicinais 2,3,4,5, e cada uma dessas metodologias exibe pontos fortes e limitações únicas, como diferenças de eficiência e precisão. As abordagens de biologia molecular, por exemplo, oferecem alta precisão na identificação dos locais dentro das vias biossintéticas, mas são notavelmente demoradas. Sua utilidade é ainda mais restrita para espécies sem sequências genômicas disponíveis publicamente, tornando essas técnicas menos viáveis para esses casos6. Em contraste, as técnicas de marcação de isótopos, empregando razões isotópicas como 3C / 12C, 2H / 1H e 18O / 16O, fornecem um meio rápido e acessível para investigar os mecanismos de síntese, transporte e armazenamento de metabólitos secundários 7,8. Eles podem revelar a distribuição espacial de compostos orgânicos e isótopos estáveis nas folhas, permitindo assim a reconstrução das condições ambientais experimentadas pelas folhas ao longo de seu ciclo de vida9. Além disso, a aplicação de marcadores isotópicos externos, como 13C6-Glicose 10 e 13C 6-Fenilalanina11, permite a geração de metabólitos secundários marcados com carbono, melhorando nossa compreensão de sua produção e função.
As técnicas tradicionais de marcação de isótopos de carbono encontram desafios para identificar os órgãos específicos responsáveis pela síntese de metabólitos secundários devido à natureza altamente específica de suas vias biossintéticas e mecanismos de transporte. A cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) ganhou destaque como um instrumento analítico fundamental nessa área, oferecendo um método robusto para rastrear isótopos exógenos na síntese química de medicamentos e investigar processos in vivo, como absorção, distribuição, metabolismo e excreção12. A sensibilidade, franqueza e confiabilidade superiores do LC-MS o tornam a escolha ideal para monitorar a produção de metabólitos secundários em plantas13. Nos últimos tempos, a LC-MS tornou-se cada vez mais favorecida por sua aplicação em técnicas externas de marcação de isótopos, o que permite a avaliação da eficiência da marcação em diferentes amostras. Essa metodologia fornece informações críticas sobre os órgãos primários envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais, servindo como um complemento inestimável aos métodos biológicos para identificar os órgãos de síntese desses compostos14,15. Consequentemente, essa abordagem não apenas facilita a comparação das eficiências de marcação entre vários espécimes, mas também lança luz sobre os principais órgãos implicados na geração de metabólitos secundários de plantas, melhorando assim nossa compreensão de sua biossíntese.
Introduzimos um novo método que combina a marcação de isótopos de carbono com a detecção de LC-MS para identificar os órgãos primários responsáveis pela síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais. A saponina parisiense (PS) tem uma variedade de atividades farmacológicas, como anticâncer, imunomodulação e anti-inflamatória16, e o PPY está em demanda crescente17. Portanto, usamos mudas de PPY como sujeitos de pesquisa e deciframos que as folhas são o órgão primário para sintetizar a saponina Paris VII (PS VII) (Figura 1B) usando a marcação de 13C6-glicose associada ao método LC-MS. Nossa abordagem incluiu quatro tratamentos diferentes envolvendo 13C6-Glucose alimentando feixes foliares, rizomáticos e vasculares do caule, bem como um controle não alimentar. A escolha da 13C6-Glicose é estratégica, pois é rapidamente metabolizada em acetil coenzima A via respiração, o que facilita a síntese de PS. Empregando a abundância natural de 13C, utilizamos um sistema de espectrômetro de massa de razão isotópica estável por cromatografia gasosa (GC-IRMS) para avaliar as razões de 13C / 12C em vários órgãos da planta e para analisar as razões de pico de íons isotópicos em moléculas de PS VII e saponinas Paris II (PS II) (Figura 1B). Nossa metodologia, que aproveita 13precursores de metabólitos secundários de plantas marcados com C e técnicas de espectrometria de massa de ponta, oferece uma alternativa mais simples e precisa aos métodos convencionais de marcação de isótopos de carbono. Essa nova abordagem não apenas aprofunda nossa compreensão dos órgãos envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais, mas também estabelece uma base sólida para futuras explorações nas vias biossintéticas desses compostos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 % Formic acid water</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose powder</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>110187-42-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTOSAMPLER VIALS</td>
			<td>Biosharp Biotechnology Company</td>
			<td>44866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEH C18 column</td>
			<td>Waters,Milfor,MA</td>
			<td>1.7&#956;m,2.1*100 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNC ultrasonic cleaner</td>
			<td>Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd</td>
			<td>KQ-600DE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound DiscovererTM&#160; software</td>
			<td>Thermo Scientific, Fremont,CA</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound DiscovererTM&#160; software&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific,Fremont,CA</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric constant temperature blast drying oven</td>
			<td></td>
			<td>DHG-9146A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic analytical balance</td>
			<td>Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd</td>
			<td>SOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory</td>
			<td>44955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully automatic sample rapid grinder</td>
			<td>Shanghai Jingxin Technology</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Delta V Advantage</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoagland solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2295-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroponic tank</td>
			<td>JRD</td>
			<td>1020421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isodat software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry</td>
			<td>Agilent Technology&#160;</td>
			<td>Agilent 1260 -6120&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen manufacturing instrument</td>
			<td>PEAK SCIENTIFIC</td>
			<td>Genius SQ 24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organic phase filter</td>
			<td>Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen pump</td>
			<td>Magic Dragon</td>
			<td>MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum sensor</td>
			<td>Highpoint</td>
			<td>UPRtek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Handskit</td>
			<td>11-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprinkling can</td>
			<td>CHUSHI</td>
			<td>WJ-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur&#160; software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

13c6&#45;glucose labeling associated with lc&#45;ms&#58; identification of plant primary organs in secondary metabolite synthesis

Este trabalho apresenta um método novo e eficiente para certificar órgãos primários envolvidos na síntese de metabólitos secundários. Como o metabólito secundário mais importante em Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mão. -Mzt. (PPY), a saponina de Paris (PS) tem uma variedade de atividades farmacológicas e o PPY está em demanda crescente. Este estudo estabeleceu quatro tratamentos com folhas, rizoma e feixes vasculares do caule 13C6-Glicose alimentando e não alimentando para certificar com precisão os órgãos primários envolvidos na síntese de saponinas Paris VII (PS VII). Ao combinar cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), as razões 13C/12C de folha, rizoma, caule e raiz em diferentes tratamentos foram calculadas com rapidez e precisão, e quatro tipos de razões de pico de íons isotópicos PS (M−) foram encontrados: (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− e (M+4) −/M−. Os resultados mostraram que a relação de 13C/12C nos rizomas dos tratamentos caule-vascular-feixe e alimentação do rizoma foi significativamente maior do que no tratamento não alimentar. Em comparação com o tratamento não alimentar, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) −/M− nas folhas aumentou significativamente sob os tratamentos de alimentação com feixe vascular foliar e caule. Simultaneamente, em comparação com o tratamento não alimentar, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) −/M− nas folhas sob tratamento com rizoma não apresentou diferença significativa. Além disso, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) −/M− no caule, raiz e risoma não mostrou diferenças entre os quatro tratamentos. Em comparação com o tratamento não alimentar, a razão da molécula de saponina Paris II (PS II) (M+2) −/M− nas folhas sob tratamento de alimentação foliar não mostrou diferença significativa, e a razão (M+3) −/M− das moléculas de PS II nas folhas sob tratamento de alimentação foliar foi menor. Os dados confirmaram que o órgão primário para a síntese do PS VII são as folhas. Ele estabelece as bases para a futura identificação dos órgãos e vias primárias envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais.

The biosynthetic pathways of secondary metabolites in plants are intricate and diverse, involving highly specific and diverse accumulation organs1. At present, the specific synthesis sites and responsible organs for secondary metabolites in many medicinal plants are not well-defined. This ambiguity poses a significant obstacle to the strategic advancement and implementation of cultivation methods designed to optimize both the yield and quality of medicinal materials.
Molecular biology, biochemical, and isotope labeling techniques are extensively employed to unravel the synthesis pathways and sites of secondary metabolites in medicinal plants2,3,4,5, and each of these methodologies exhibits unique strengths and limitations, such as differences in efficiency and accuracy. Molecular biology approaches, for instance, offer high precision in pinpointing the sites within biosynthetic pathways but are notably time-intensive. Their utility is further constrained for species lacking publicly available genomic sequences, rendering these techniques less viable for such cases6. In contrast, isotope labeling techniques, employing isotopic ratios like 3C/12C, 2H/1H, and 18O/16O, provide a rapid and accessible means to investigate the synthesis, transport, and storage mechanisms of secondary metabolites7,8. They can reveal the spatial distribution of organic compounds and stable isotopes in leaves, thereby allowing the reconstruction of environmental conditions experienced by the leaves throughout their life cycle9. Furthermore, the application of external isotopic labels, such as 13C6-Glucose10 and 13C6-Phenylalanine11, enables the generation of carbon-labeled secondary metabolites, enhancing our understanding of their production and function.
Traditional carbon isotope labeling techniques encounter challenges in pinpointing the specific organs responsible for the synthesis of secondary metabolites due to the highly species-specific nature of their biosynthetic pathways and transport mechanisms. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) has risen to prominence as a pivotal analytical instrument in this arena, offering a robust method for tracking exogenous isotopes in the chemical synthesis of drugs and investigating in vivo processes such as absorption, distribution, metabolism, and excretion12. The superior sensitivity, straightforwardness, and reliability of LC-MS make it an ideal choice for monitoring the production of secondary metabolites in plants13. In recent times, LC-MS has become increasingly favored for its application in external isotope labeling techniques, which enables the evaluation of labeling efficiency across different samples. This methodology provides critical insights into the primary organs engaged in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants, serving as an invaluable complement to biological methods for identifying the synthesis organs of these compounds14,15. Consequently, this approach not only facilitates the comparison of labeling efficiencies among various specimens but also sheds light on the key organs implicated in the generation of plant secondary metabolites, thereby enhancing our understanding of their biosynthesis.
We introduced a novel method that combines carbon isotope labeling with LC-MS detection to identify the primary organs responsible for synthesizing secondary metabolites in medicinal plants. Paris saponin (PS) has a variety of pharmacological activities such as anticancer, immunomodulation, and anti-inflammation16, and PPY is in increasing demand17. Therefore, we used PPY seedlings as research subjects and deciphered that leaves are the primary organ to synthesize the Paris saponin VII (PS VII) (Figure 1B) by using the 13C6-Glucose labeling associated with the LC-MS method. Our approach included four different treatments involving 13C6-Glucose feeding to leaf, rhizome, and stem-vascular bundles, as well as a non-feeding control. The choice of 13C6-Glucose is strategic, as it is swiftly metabolized into acetyl coenzyme A via respiration, which then facilitates PS synthesis. Employing the natural abundance of 13C, we utilized a Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer (GC-IRMS) system to assess the 13C/12C ratios across various plant organs and to analyze the isotopic ion peak ratios in PS VII and Paris saponins II (PS II) (Figure 1B) molecules. Our methodology, which leverages 13C-labeled plant secondary metabolite precursors and cutting-edge mass spectrometry techniques, offers a simpler and more accurate alternative to conventional carbon isotope labeling methods. This novel approach not only deepens our comprehension of the organs involved in secondary metabolite synthesis in medicinal plants but also lays a solid groundwork for future explorations into the biosynthetic pathways of these compounds.

Autor em destaque: Perfil de órgãos primários de plantas usando marcação de 13C6-glicose e LC-MS

13C6-Marcação de glicose associada a LC-MS: Identificação de órgãos primários de plantas na síntese de metabólitos secundários

We aimed to devise a universal and descriptive method for identifying the organs responsible for producing cyclical metabolics in medicinal plants. This method integrates certain carbon six glucose labeling with LC-MS indices, offering a process and accessible way to determine where these important compounds are synthesized. Most recent developments focus on the metabolite dynamics, protein quantification, and their exploration of complex biological matrices.Multi spectrometry analysis methods, nuclear magnetic lances, spectral copy, bioinformatics, and the data analysis tools can promote the development of chemical isotope labeling methods. The main challenge of this experiment is metric effects. The presence of other elements or compounds in the sample can interfere with the curate measurement of carbon isotopes, leading to metric effects that can skew results.Our results open avenues for several new scientific inquirers, including mechanisms of metabolic synthesis, genetic regulation, impact of environment factors, cross organ transport, and lecture practices.

Para confirmar que o fornecimento de 13C6-Glucose em rizomas foi bem-sucedido, analisamos ainda mais as razões isotópicas de 13C / 12C em rizomas. As razões isotópicas de 13C / 12C dos tratamentos 3 e 4 foram muito maiores do que as do tratamento 2 (Figura 1A). Os resultados indicaram que a 13C6-Glicose dos tratamentos 3 e 4 entrou nos rizomas por ingestão.
As proporções...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Plant Primary Organs Profiling Using 13C6-Glucose Labeling and LC-MS at JoVE.com

O método desenvolvido de marcação com 13C6-glicose combinado com espectrometria de massa de alta resolução por cromatografia líquida é versátil e estabelece as bases para estudos futuros sobre os órgãos e vias primárias envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais, bem como a utilização abrangente desses metabólitos secundários.

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary ...

Nosso objetivo foi conceber um método universal e descritivo para identificar os órgãos responsáveis pela produção de metabólicos cíclicos em plantas medicinais. Este método integra certa marcação de glicose de carbono seis com índices LC-MS, oferecendo um processo e uma maneira acessível de determinar onde esses compostos importantes são sintetizados. Os desenvolvimentos mais recentes se concentram na dinâmica dos metabólitos, quantificação de proteínas e sua exploração de matrizes biológicas complexas.Métodos de análise multiespectrométrica, lanças magnéticas nucleares, cópia espectral, bioinformática e ferramentas de análise de dados podem promover o desenvolvimento de métodos de marcação de isótopos químicos. O principal desafio deste experimento são os efeitos métricos. A presença de outros elementos ou compostos na amostra pode interferir na medição de isótopos de carbono, levando a efeitos métricos que podem distorcer os resultados.Nossos resultados abrem caminhos para vários novos pesquisadores científicos, incluindo mecanismos de síntese metabólica, regulação genética, impacto de fatores ambientais, transporte de órgãos cruzados e práticas de palestra.

13c6-glucose-labeling-associated-with-lc-ms-identification-plant

Research

JoVE Journal

Chemistry

13C6&#45;Glucose Labeling Associated with LC&#45;MS&#58; Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis

381 visualizações.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Nosso objetivo foi conceber um método universal e descritivo para identificar os órgãos responsáveis pela produção de metabólicos cíclicos em plantas medicinais. Este método integra certa marcação de glicose de carbono seis com índices LC-MS, oferecendo um processo e uma maneira acessível de determinar onde esses compostos importantes são sintetizados. Os desenvolvimentos mais recentes se concentram na dinâmica dos metabólitos, quantificação de proteínas e sua exploração ...