Nossa pesquisa envolve o uso de nosso microscópio multimodal para medir diferenças moleculares e metabólicas em várias patologias e visualizar sua heterogeneidade espacial. A abordagem multimodal da imagem óptica nos permite identificar alterações fisiopatológicas de várias perspectivas. A abordagem multimodal da microscopia óptica está continuamente expandindo suas aplicações, particularmente no ambiente clínico, onde o desenvolvimento de microendoscópios abriu um caminho para imagens clínicas.
Os desafios experimentais atuais residem na complexidade de incorporar todo o hardware entre si, o que é parte da razão pela qual utilizamos um sistema de microscópio personalizado. Por meio do uso de nossa plataforma de imagem óptica multimodal, fizemos avanços significativos no estudo de doenças bio-ortogonais sem rótulos, incluindo a classificação de diferentes subtipos de câncer de mama e a análise do metabolismo lipídico na drosófila e no cérebro de camundongos. Usando nossa imagem óptica multimodal sem rótulos, podemos visualizar o metabolismo, a morfologia e a composição molecular simultaneamente, o que é uma ferramenta poderosa para investigar doenças e o processo de envelhecimento.
Para começar, aqueça o laser e aguarde aproximadamente 15 a 20 minutos. Ligue a caixa de controle, seguida pelo controlador do painel de toque, adaptador CA para controle remoto do laser principal e adaptador CA para controle remoto do sublaser e, em seguida, ligue o detector de diodo fotográfico de silício e o amplificador de bloqueio. Configure o sistema de laser com um feixe de bomba ajustável de 780 nanômetros a 990 nanômetros, com uma largura de pulso de cinco a seis picossegundos e uma taxa de repetição de 80 megahertz.
O feixe de laser Stokes deve ter um comprimento de onda fixo de 1031 nanômetros, com um pulso de seis picossegundos e uma taxa de repetição de 80 megahertz. Certifique-se de que os feixes da bomba e dos alimentadores estejam em baixa potência, pelo menos 20 miliwatts visíveis na placa de alinhamento. Aplique óleo no condensador de óleo de alta abertura numérica.
Monte a lâmina do microscópio no condensador de óleo e coloque uma gota grande de água na lâmina do microscópio para a objetiva de água 25X. Ajuste o estágio Z para ajustar o foco até que a imagem de campo claro brilhante da amostra biológica seja visível sob a objetiva de água de 25X. Inicie o processo de imagem na sequência correta para evitar o fotobranqueamento.
Para alternar rapidamente entre MPF e SHG, mude do feixe da bomba para o feixe de stokes fixo. Selecione a resolução da imagem como 512 por 512 pixels. Defina o tempo de permanência como oito microssegundos por pixel para MPF e SHG, com um quadro médio acima de três.
Use 40 microssegundos por pixel com um quadro médio de dois para a modalidade SRS. Para adquirir autofluorescência com MPF, desligue o feixe de laser de stokes. Ajuste o laser da bomba para 800 nanômetros para excitar NADH e flavina.
Adquira o sinal da fibra de colágeno usando SHG. Desligue o feixe de laser da bomba e use apenas o feixe de laser stokes a uma potência de 500 miliwatts. Obtenha a distribuição espacial de proteínas e lipídios usando SRS.
Mantenha os dois feixes de laser ligados e ajuste a frequência do feixe de laser para corresponder ao modo vibracional específico de cada molécula. Para adquirir os conjuntos de dados de imagem hiperespectral SRS, selecione o modo de suíte e defina a faixa de comprimento de onda de 781,3 nanômetros a 806,5 nanômetros. Escolha um número de pilha de pelo menos 60 e capture a pilha de imagens hiperespectrais.
Salve todas as imagens das mesmas regiões de interesse na mesma pasta e certifique-se de que o formato da imagem seja o arquivo OIR da Olympus. A autofluorescência e a imagem SRS capturaram com sucesso informações metabólicas e estruturais do tecido pulmonar humano. A análise raciométrica da razão redox óptica e da razão de insaturação lipídica forneceu distribuições espaciais da atividade metabólica e da composição molecular no tecido pulmonar humano.
A comparação quantitativa do estresse oxidativo e da insaturação lipídica entre tecido saudável e tumoral revela diferenças nos estados metabólicos.
