Методы экспериментальных манипуляций после оптические Перерезка нерва в ЦНС млекопитающих

Резюме

Оптические перерезки нерва широко используется модель взрослого травмы ЦНС. Эта модель идеально подходит для проведения ряда экспериментальных манипуляций, нацеленных сетчатки глобально или непосредственно целевой ранения нейронов населения ганглиозных клеток сетчатки.

Аннотация

Ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в ЦНС нейроны, которые выводят визуальную информацию от сетчатки в мозг через зрительный нерв. Зрительного нерва могут быть доступны в орбите глаза и полностью перерезана (axotomized), резки аксоны весь РГК населения. Оптические перерезки нерва воспроизводимые модели апоптоза нейронов гибель клеток во взрослом ЦНС ^1-4. Эта модель особенно привлекательна тем, стекловидное камеры глаза действует как капсулы для доставки лекарств к сетчатке, что позволяет с помощью экспериментальных манипуляций внутриглазных инъекций. Диффузии химических веществ через стекловидное жидкости гарантирует, что они действуют на весь РГК населения. Вирусные векторы, плазмиды или короткий вмешательства РНК (siRNAs) также могут быть доставлены в стекловидной камере для того, чтобы заразить или трансфекции клеток сетчатки ^5-12. Высокий тропизм адено-ассоциированные вирус (AAV) векторов выгодно для целевой РГК, с инфекцией ставка приближается к 90% клеток вблизи места инъекции ^{6, 7, 13-15.} Более того, РГК могут быть выборочно трансфекции с применением siRNAs, плазмиды или вирусные векторы, чтобы сократить конце зрительного нерва ^16-19 или инъекционные векторы в своей целевой верхний бугорок ^10. Это позволяет исследователям изучать механизмы апоптоза в поврежденных нейронов населения, не смешивая воздействия на другие нейроны свидетеля или окружающей глии. RGC апоптоз имеет характерное время курс которой гибель клеток задерживается 3-4 postaxotomy дней, после чего клетки быстро вырождается. Это обеспечивает окно для экспериментальной манипуляции направлены против путей, участвующих в апоптозе. Манипуляции, которые нацелены непосредственно на РГК из перерезанного оптических культи нерва выполняются во время axotomy, сразу же после резки нерва. Напротив, когда вещества доставляются внутриглазного маршрута, они могут быть введены до операции или в течение первых 3 дней после операции, предшествующие началу апоптоза в axotomized РГК. В настоящей статье мы покажем несколько методов для экспериментальных манипуляций после перерезки оптический нерв.

протокол

1. Хирургическая техника

1. Эксперименты должны проводиться с использованием асептических условиях и после использования животных протоколов вашего конкретного учреждения. Инструменты и материалы (растворы, испытание веществ, трейсеры, иглы и т.д.) вступления в контакт с живой ткани должны быть стерильными, чтобы предотвратить инфекцию и негативного воздействия на животных и потенциального негативного воздействия на исследование.

2. Анестезия

1. Крысы будут наркозом использованием ветеринарных изофлуран системы испарителем. Использование медицинского кислорода класса со скоростью 0,8 л / мин для испарения изофлуран газа. Место животных в приложенном поле анестезии и набрать в изофлуран концентрации 4% до дыхание замедлилось, и животное степенный.
2. Затем переключатель потока газа в привязанности противогаз для стереотаксической рамы и место животного в стереотаксического аппарата. Включите изофлуран концентрации до 2% и мониторинг анестезии. Большие животные (> 300), может потребоваться более высокая концентрация изофлуран. Анестезия должна контролироваться во время операции и изофлуран дозировка корректируется. Глубина и частота дыхания должна постоянно оцениваться и ног щепотку оценки (каждые 5 минут) за отсутствие глубокой боли должны быть выполнены.
3. Как только операция завершится, выключите изофлуран и позволяют животному дышать кислородом в течение нескольких минут до снятия с стереотаксического устройства. Температура тела должна быть сохранена, покрывая животное с хирургической одеяло и / или с использованием регулируемых одеяло отопления во время операции.

3. Шприц Подготовка к Внутриглазное Инъекции

1. Во-первых, собирать шприц системы для выполнения внутриглазных инъекций. 10 мкл RN Газонепроницаемый 1701 Гамильтон Шприц используется для инъекций. Удалите иглу или RN гайки присутствуют на конец шприца.
2. Вставьте PFA наконечником в чашку PEEK наконечником компрессионный фитинг. Затем вставьте полной установки в конце шприца и свободно винт гайка РН по вершине.
3. Вставьте один конец 1 / 16 дюйма PEEK трубку в резьбовое, через отверстие в гайке RN. Убедитесь в том, PEEK трубки упора. Затяните гайку RN сжать наконечником, запечатывание PEEK трубки.
4. Выполните шаг 3.2 на обоих концах двойной муфты стекла RN. Прикрепите свободный конец трубки PEEK к одному концу Двойная муфта стекла RN, затянув гайки RN.
5. Вытащил стекло микропипетки сформирует иглы и ствол для системы впрыска. Используйте 1,5 мм OD толстостенных стеклянных капиллярных трубок для изготовления стеклянной пипетки и вставить стекла пипетки в свободный конец Двойная муфта стекла RN. Затяните гайку RN исправить пипетки на месте.
6. Штрафа кончике микропипетки вытащил стекло, как правило, слишком малы для выполнения внутриглазного инъекций. Для того чтобы создать кончик соответствующего диаметра, сломать кончик стеклянной пипетки под визуальным руководством, с использованием операционного микроскопа. Замороженный конец слайд образца стекла хорошо подходит для перерыва пипетки. Держите пипетку в угол и втирать наконечник вдоль стеклянной глазурью для создания перерыва. В идеале, последний совет должен быть слегка скошены. Это может занять несколько попыток получить хороший совет, так что тянуть несколько пипеток перед использованием.
7. Система впрыска гидравлический. Таким образом, шприц, компоновщик PEEK трубы, двойные стекла RN муфтой и стеклянные микропипетки должны быть заполнены минеральным маслом перед использованием. Использование Грунтовка комплект из Гамильтона Шприц Ко (PRMKIT), заполните грунтовки шприц с минеральным маслом. Использование большого диаметра иглы, что позволяет легко прохождения вязкого масла. Замените иглу с Гамильтоном 90030 иглы, которая помещается внутрь ствола 10 мкл шприце Hamilton. Далее, поместите резиновую перегородку над Гамильтон 90030 иглы, с тем чтобы обеспечить печать в результате употребления инъекционных нефтепродуктов.
8. Вставьте Гамильтон 90030 иглу шприца грунтовки в заднюю часть ствола 10 мкл шприца Гамильтона системы впрыска. Пресс перегородки вплотную конце шприца для создания уплотнения.
9. Медленно нажмите поршень. Вы увидите проход минеральное масло через стеклянные элементы системы впрыска и, наконец, заполнение стеклянной пипетки. Нажмите все масло через систему впрыска для того, чтобы удалить пузырьки воздуха вдоль тракта. Если заполнение шприца на исходе нефтепродуктов, медленно извлеките иглу, постоянно дозирования масла для предотвращения образования пузырьков воздуха. Пополнить грунтования шприц и вводят снова.
10. Когда вся система заполнена минеральным маслом и пузырь бесплатно, вставить оригинальный поршень шприца 10 мкл Hamilton. Нажмите на поршень до конца своего путешествия, чтобы удалить дополнительные минеральные масла из системы. Протрите стекло микропипетки чистой и конец шприца чистой с 70% этанола.
11. Withdraш поршень шприца на 2 мкл отпечаток на баррель. Конец стеклянной микропипетки будет наполнить воздухом обеспечения буферной зоны между нефтепродуктов и желаемую жидкость для инъекций. Баррель пипетки теперь может быть заполнена путем размещения конце микропипетки в искомое решение и снять поршень шприца Гамильтона. Не вводить более 4-5 мкл раствора в глаза взрослой крысы.

4. Внутриглазное Процедура инъекции: Ориентация Retina Глобально

1. С животных под наркозом и закреплены в стереотаксической рамы (как описано в разделе 2), воспользуйтесь Alcaine глазные капли, чтобы местно обезболить роговицы. Открытые веки пальцами и место одна капля анестетика раствора на поверхности роговицы.
2. Инъекция требуется два человека: один, чтобы вставить стекло пипетки в полости стекловидного тела и поддерживать позицию пипетки, а другой опускают поршень шприца на который доставляет искомое решение.
3. Под операционного микроскопа, сцепление стеклянной микропипетки и двойного стекла RN ответвитель пальцами. Распространение веки пальцами свободной руки, образуя "V" формы противоположном месте инъекции. Применяя тяги к веки, глаза будут повышенные из орбиты, подвергая задней поверхности за лимба. Создавая "V" формы с пальцами противоположной месте инъекции, колыбель формируется для глаз обеспечение стабильности при внутривенном введении.
4. Осторожно введите кончик стеклянной микропипетки через конъюнктиву, в области, лишенной кровеносных сосудов, и через склеру, в нисходящий угол. Вы должны почувствовать небольшую "поп", когда пипетки проникает склеры. Вставка пипетки на немного вниз угол уменьшает шансы попасть объектив при установке иглы.
5. Лицо, занимающее шприц должен теперь вводят 4 мкл раствора, нажав на поршень 2 мкл след в шприц. Инъекция должна примерно от одного до двух секунд, в общей сложности. Потребители инъекционных на очень медленном темпе> 3 секунды уменьшает первоначальное распространение раствора через стекловидное камеры. Вы сможете увидеть введенного раствора промывки через стекловидное камере под микроскопом, тем самым проверки успех процедуры.
6. Держите микропипетки устойчивый в течение примерно 5 секунд, а затем снять, в том же направлении, что и вводилась игла. Конъюнктивы будет лоскут назад на небольшое отверстие, помогая уплотнения склеры прокол.
7. Обложка поверхности роговицы глаз глазной мазью (Слезы Naturale PM), чтобы предотвратить высыхание роговицы во время восстановления, и вернуть животное к восстановлению клетки.
8. Послеоперационные анальгетики следует назначать в соответствии с руководящими принципами вашей власти по уходу за животными, а животные должны быть тщательно проверены после операции.

5. Выборочно Ориентация ганглиозных клеток сетчатки с оптической Пень Нервные

1. Применение индикаторов, наркотики, плазмиды, siRNAs или вирусных векторов зрительного нерва пень, после axotomy, непосредственно цели ганглиозных клеток сетчатки через ретроградного транспорта. Это достигается за счет выполнения первого оптического перерезки нерва в соответствии с "Оптик протокол Перерезка Нервные" ^22.
2. Есть два основных метода для выполнения этой процедуры: с помощью gelfoam, или прямой инъекции в зрительный нерв.
3. Метод gelfoam похож на ретроградной трассировки, однако при доставке экспериментального лечения в глазной нерв желательно предварительно этикетке ганглиозных клеток сетчатки путем введения ретроградной трейсеров в верхний бугорок за 1 неделю до axotomy. Это важно для мобильных трассировки, поскольку в некоторых случаях нейронов индикаторов может помешать ретроградного транспорта экспериментальных веществ или наоборот.
4. Сразу же после зрительного нерва режется, маленький кусочек пропитанной gelfoam экспериментального решения находится над пересекаются оптические культи нерва. Орбитальной содержимое затем вернулись в свои предыдущие места. Когда глаз возвращается в нейтральное положение, необходимо использовать щипцы подтолкнуть часть gelfoam вниз на орбиту, гарантируя, что он остается на конце зрительного нерва.
5. Техника инъекции является более эффективным для доставки веществ, которые должны получить доступ к цитоплазме аксона, чтобы быть ретроградно транспортируется axoplasmic потока. Это включает в себя siRNAs и плазмиды, а в некоторых случаях вирусных векторов. 5-10 мкл шприца Гамильтона для инъекций искомое решение в перерезанного зрительного нерва.
6. Возьмитесь за края зрительного нерва с тонкой наконечником Дюмон щипцами. Вставьте конец иглы в зрительный нерв, параллельно с нервом, пока конических больше не видна. Вставляется игла будет заключенный со всех сторон нерва. Игла с коротким конических желательно.
7. Как только яeedle вставляется в нерв, слегка сжать стороны нерва с тонкой пинцетом и вводят наконечник четверть решение, одновременно вращая шприц на четверть оборота по часовой стрелке или против часовой стрелки.
8. Продолжить повторять Шаг 5,7 до завершения полного вращения иглы и вводят все содержимое шприца. Для достижения наилучших результатов вводят в общей сложности 10 мкл раствора с использованием газонепроницаемый шприц 10 мкл Hamilton.
9. Удалите наконечник шприца от нервов. Оставьте избыток вводимой жидкости, которое кипятят с нерва в пределах орбиты так как это форма дополнительного бассейн для поглощения концах аксонов.
10. Вернуться орбитальной содержания в исходное положение, закройте рану, и позволяют животному, чтобы оправиться.
11. Послеоперационные анальгетики следует назначать в соответствии с руководящими принципами вашей власти по уходу за животными, а животные должны быть тщательно проверены после операции.

6. Представитель Результаты:

Внутриглазное инъекции цель всех клеток в сетчатке в глобальном масштабе, и хорошо подходят для доставки веществ пострадавшим РГК с ганглиозные клетки находятся в самом внутреннем слое нейронов сетчатки, прилегающей к полости стекловидного тела. РГК также может быть непосредственно направлены на доставку веществ пересекаются оптические культи нерва. Fluorogold ретроградно меченых РГК могут быть направлены использованием пептидов, наркотики, векторы, плазмиды или siRNAs от нервов культи, как показано на рисунке 1. Рисунок 1А-C демонстрирует локализацию Cy3 меченых пептидов в somata из РГК, которые были предварительно помечены инъекционных Fluorogold в верхний бугорок. Cy3 меченых пептидов вводили в зрительный нерв сразу после axotomy, и сетчатка отображаемого в живых, чтобы предотвратить пептидов в результате вымывания из ткани во время фиксации. Рис. 1D-F демонстрирует локализацию Cy3 помечены siRNAs и ретроградной трассирующими Fluorogold в axotomized РГК. Cy3 помечены siRNAs вводили в зрительный нерв пень сразу после axotomy, и сетчатка отображаемого жив.

Рисунок 1. Epifluorescence микрофотографии РГК в flatmounted сетчатки на 1 день после axotomy и инъекция либо меченых пептидов или siRNAs в зрительном культи нерва. (А) Fluorogold ретроградной маркировки в axotomized РГК на 1 день postaxotomy (B) Cy3 флуоресценции в РГК следующие ретроградной транспорта меченых пептидов, 1 день после axotomy и пептид инъекции в зрительный нерв. (C) Наложение (А) и (Б) демонстрации селективной локализации Cy3 меченых пептидов в Fluorogold помечены РГК. (DF) клеточных тел Fluorogold помечены РГК (D) также заполнены Cy3 помечены siRNAs (E) вводится в зрительный нерв пень 24 часов раньше, как показано на оверлей (F). Шкала бар в переменного тока составляет 50 мкм. Шкала бар в DF составляет 20 мкм.

Обсуждение

Оптические перерезки нерва высокой воспроизводимостью модель взрослого апоптоза нейронов ЦНС. Экспериментальных манипуляций продемонстрировали в этой рукописи позволяют изучить механизмы апоптоза РГК после травмы.

Внутриглазное инъекции полезны для глобальной ори...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT