Протокол заразить<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; С<em&gt; Сальмонелла Typhimurium</em

Резюме

C. Элеганс стала новой генетической модели для изучения хост-патогенных взаимодействий. Здесь мы опишем протокол заразить C. Элеганс с Salmonella Typhimurium в сочетании с техникой помех РНК-интерференции двухцепочечной изучить роль генов хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции.

Аннотация

В последнее десятилетие, С. Элеганс стала беспозвоночных организма для изучения взаимодействий между хозяевами и патогенов, в том числе защите организма против грамотрицательных бактерий Salmonella Typhimurium. Сальмонелла устанавливает хронической инфекции в кишечнике С. Элеганс и приводит к ранней смерти инфицированных животных. Ряд механизмов иммунитета были выявлены в С. Элеганс защититься от сальмонеллы инфекций. Аутофагия, эволюционно консервативными деградация лизосомного пути, как было показано, ограничить репликацию Salmonella в С. Элеганс и у млекопитающих. Здесь, протокол описывается заразить C. Элеганс с Salmonella Typhimurium, в котором черви подвергаются Salmonella в течение ограниченного времени, подобно сальмонеллезной инфекции у человека. сальмонеллы инфекция значительно сокращает продолжительность жизни C. Элеганс </ EM>. Использование основного гена аутофагии ОЦК-1 в качестве примера, мы объединили этот метод инфекции с C. Элеганс РНК-интерференции кормления подход и показал этот протокол может быть использован для изучения функцию C. Элеганс генов хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции. Поскольку С. Элеганс целого генома RNAi библиотеки доступны, этот протокол позволяет всесторонне скрининга С. Элеганс гены, которые защищают от сальмонеллы и других кишечных патогенов с использованием генома RNAi библиотеки.

Введение

Свободно живущих нематод почвы Caenorhabditis Элеганс является простым и генетически послушный модель организма используется для изучения многих биологических вопросы. С. Элеганс преимущественно существует как самоопыляющихся гермафродитов. Самцы спонтанно генерируется нерасхождения Х-хромосомы во время гаметогенеза ^1,2. При наличии обильной пищи, C. Элеганс постоянно развивать через четыре личиночной стадии к взрослым. Температура также влияет на С. развитие Элеганс; быстрое развитие наблюдается при более высоких температурах. В лаборатории С. Элеганс культивируют при стандартной температуре 20 ° С на чашках с сеяной бактерия кишечной палочки (штамм OP50) в качестве пищи ^1,2.

В последнее десятилетие, С. Элеганс стала беспозвоночных организма для изучения хост-патогенных взаимодействий ^3-5. В природе C. Элеганс питается бактериями, как его Нутриэнт Источник ^1,2. Его нормальное бактериальная лаборатория пищевой, OP50, могут быть легко заменены другими патогенами изучить взаимодействие между С. Элеганс и любой выбранной патоген. В этих условиях, кишечник является основной сайт инфекции. В самом деле, широкий спектр бактериальных патогенов, как было показано смертельно заразить C. Элеганс ^3-5.

Грамотрицательная бактерия сальмонелла является желудочно-патогенный микроорганизм, который вызывает человеческую болезней пищевого происхождения во всем мире ^6,7. С. Элеганс является хорошей моделью хост для Salmonella Typhimurium как эта бактерия размножается и имеет постоянные кишечных инфекций ^8-10. С. Элеганс был использован для идентификации как роман и ранее известный Сальмонелла факторов вирулентности ^11. Интересно, что С. Элеганс иммунная система успешно ограничивает Salmonella репликацию. Сообщалось ранее, что inhibition генов аутофагии оказывает повышенную репликацию Salmonella в С. Элеганс, в результате ранней смерти зараженных червями ^10. Macroautophagy (далее по тексту аутофагии) представляет собой динамичный процесс, включающий перестройку субклеточных мембран поглощать цитоплазму и органеллы для доставки в лизосомы для деградации ^12. Аутофагия сообщалось ограничить репликацию Salmonella в С. Элеганс и у млекопитающих ^10,13.

С. Элеганс геном был первый многоклеточный генома эукариот последовательность; это ответ на РНК-интерференции лечения ^14-16. Кроме того, RNAi можно вводить эффективно при условии червей глотать бактерии, содержащие двухцепочечную РНК гена-мишени, известный как RNAi кормления ^16,17. Весь геном РНК-интерференции библиотеки кормления были получены для генома РНК-интерференции скрининга ^16,18. Здесь, сальмонеллы инфекция протокол соединен с РНК-интерференции кормления, чтобы тестирование C. Элеганс гены интереса для их способности защиты от сальмонеллезной инфекции.

протокол

1. XLD (Ксилоза Лизин Дезоксихолат) Агар Плиты

XLD агар является селективным ростовую среду для Salmonella, которая появляется в виде черных колоний на чашках с агаром XLD. Однако, если нет проблем загрязнения, регулярное LB пластины могут быть заменены.

1. Взвесить 5,5 г XLD агар и ресуспендируют в 5 мл деионизированной воды.
2. Тщательно перемешать, пока все агар не мокрая. Добавить 95 мл деионизированной воды, пока все комки не будут удалены и среду полностью ресуспендировали.
3. Кипятите среду до полного растворения (не автоклав).
4. Охлаждают среду при комнатной температуре до 50 ° С
5. Налейте 25 агар мл в каждом 95 х 15 мм (диаметр х высота) пластины (плиты запечатанные парафильмом можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 месяца).

2. Нематода Рост Средний (NGM) РНК-интерференции для кормления Тарелки

Подготовка C. Элеганс NGM пластины была описана ранее ¹9. Здесь процедура кратко описаны добавить ампициллин антибиотиками и RNAi химического индуктора изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в средствах массовой информации NGM чтобы питающие пластинки RNAi.

1. Растворите 3 г NaCl и 2,5 г бактопептон в 1 л деионизированной воды.
2. Добавить 17 г Bacto агар в средствах массовой информации.
3. Автоклав носитель в течение 45 мин и охлаждают носители до 50 ° С на водяной бане.
4. Добавить следующие растворы: 1 холестерина мл (5 мг / мл в 95% этаноле), 1 мл 1 М CaCl _2, 1 мл 1 М MgSO _4, и 25 мл 1 М калий-фосфатного буфера (рН 6,0). Все хорошо перемешать.
5. Добавить 1 мл 1 М IPTG и 500 мкл ампициллин (100 мг / мл в стерильной воде).
6. Смешайте раствор и разлить в 60 х 15 мм (диаметр х высота) чашки Петри с использованием помощь пипетки и 25 мл серологические пипетки следующие стерильных процедур. Заполните каждую тарелку с 12 мл агара. Плиты можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 месяца.

3. Подготовка RNAi-обработанных животных для инфекции

Существенным ген аутофагия ОЦК-1 используется в качестве примера для изучения функции гена хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции. Экспериментальные методики, проиллюстрированы на рисунке 1 и в таблице 1. Протокол для приготовления RNAi-обработанных животных инфекции следует, со дня каждой экспериментальной стадии, приведенной в круглых скобках.

1. Инокулировать ОЦК-1 RNAi подачу и контроль пустой вектор L4440 RNAi кормления бактерии, помещая чешуйчатого -80 ° С замороженных бактерий в 2 мл LB среды с добавкой 100 мг / мл ампициллина (день 1). Повторите этот шаг один раз в неделю в течение всего эксперимента, чтобы иметь свежие бактерии RNAi. Храните культуру в 4 ° C холодильник, когда не используется.
2. Seed 100 мл ночной РНК-интерференции бактериальной культуры на РНК-интерференции пластин. Подготовьте три ОЦК-1 РНК-интерференции и три управления пустой VЭктор RNAi пластины. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи (день 2).
3. Снимите панели RNAi от 37 ° C инкубатора и дайте им остыть до комнатной температуры на скамейке. Возьмите сытых L4 дикого типа N2 гермафродитов и передавать их на BEC-1 РНК-интерференции и контролировать пустой вектор RNAi пластины. Поместите три червей на чашку, на трех экземплярах пластин. В тот же день, подготовить RNAi пластины, как описано в п. 3.2 (День 3).
4. Инкубируйте пластин RNAi с червями в инкубаторе 20 ° C для 36-40 ч и передачи червей в свежих соответствующих РНК-интерференции пластинок, полученных в шаге 3.3. После черви передаются, инкубировать пластин в 20 ° C инкубаторе в течение 64 ч (день 4).

4. Подготовьте сальмонеллы для инфекции

1. Подряд Сальмонелла -80 ° С замороженные товара на складе 1 XLD агар пластины и инкубировать пластины при температуре 37 ° С в течение ночи (5-й день ).
2. Выберите хорошо изолированный черный Salmonella колонию и привить его в 2 мл LB среды при 37 ° С при встряхивании в течение ночи (День 6).
3. Семя 80 мл Сальмонелла ночной культуры на 1 С. Элеганс 60 х 15 мм (диаметр х высота) NGM агар и подготовить 6 пластин в общей сложности. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 6 часов. Бактериальная культура должна высохнуть и образуют газон на тарелке (День 7).

5. Infect РНК-интерференции обработанные черви с сальмонеллой

1. Трансфер ОЦК-1 РНК-интерференции обращению и контролировать пустой вектор RNAi обращению L4 N2 гермафродитов (потомства червей, созданных на шаге 3), чтобы Salmonella пластин. Наведите 40 червей на чашку на 3 пластины для каждой группы. Выдержите червь пластин при 20 ° С в течение 48 ч (День 7).
2. Подготовьте набор свежих RNAi пластин, как описано в шагах 3.1 и 3.2 (День 7 и День 8).
3. Через 48 ч инфекции, трансфер Salmonella-инфицированных червей в соответствующие РНК-интерференции пластинок, полученных в шаге 5.2 и инкубировать при 20 ° C (День 9).

6. Выживание Анализ

1. Оценка выживание червей ежедневно и передать червей к свежим соответствующих РНК-интерференции пластин во время откладки яиц времени. Подготовьте набор свежих RNAi пластин до каждой передаче червя, как описано в шагах 3.1 и 3.2. Прикоснитесь к червя тело (голова, средняя часть и хвост) аккуратно с платиновой проволоки конец плоский. Червь забил, как мертвый, если не наблюдается движение тела червя.
2. Оценка выживание червей ежедневно или через день, и передать червей к свежим соответствующих РНК-интерференции пластин два раза в неделю после черви остановить откладывать яйца.
3. После того как все черви умирают, бассейн данные выживаемости от трех экземплярах пластин, как один набор данных. Входные данные выживаемости каждой группы в соответствующем статистического программного обеспечения, такие как GraphPad PRISM генерировать кривые выживаемости и выполнять анализ выживаемости Каплана-Мейера. Весь эксперимент повторяется по крайней мере один раз, чтобы подтвердить заключение.

Результаты

При 20 ° С, средняя продолжительность жизни дикого типа N2 червей 17 дней (фиг. 2A и таблица 2). Salmonella инфекции значительно уменьшает средний срок службы N2 червей до 10,5 дней (р = 0,0002, лог-ранговый критерий) (Фигура 2А ).

Если С. Ген Элеганс и...

Обсуждение

С. Элеганс является простым генетическая модель организм, который питается бактериями качестве источника питательных веществ. Таким образом, можно легко заменить его нормальной бактериальной пищи с кишечным патогеном исследовать взаимодействие между С. Элеганс и выбрали п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth	Fisher	BP9723-500
XLD agar	EMD Chemicals	1.05287.0500
Bacto Agar	Fisher	DF0140-01-0
Peptone	Fisher	BP1420-500
Sodium Chloride	Fisher	S671-500
Calcium Chloride	Fisher	C69-500
Magnesium Sulfate	Fisher	M65-500
IPTG	Gold Biotechnology	12481C50
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
Ampicillin	Fisher	BP1760-25
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm	Fisher	FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm	Fisher	08-757-13A
Falcon Serological pipet	Fisher	13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid	Fisher	13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE6000-7
Incubator	Percival	I-36DL