JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Аннотация

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Введение

В настоящее время размещения отдельных клеток по отдельности в ферментационной пространстве обычно достигается за счет использования ограниченного разведения или флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS). Для многих лабораторий, предельное разведение является удобным методом, так как он требует только пипеткой и тканевые культуры пластины, которые легко доступны. В этом случае суспензию клеток серийно разводили до соответствующей плотности клеток, и затем помещают в культуральные лунки с помощью ручной пипетки. Эти отдельные клетки , разделенные на отсеки, затем используются для анализа клеток, таких как генетической гетерогенности скрининг 1 и колонии образование 2. Тем не менее, этот метод является низкой пропускной способностью и трудоемкий, без использования роботизированную руку за помощью, так как распределение Пуассона характер методом серийных разведений ограничивает события одноклеточных до максимальной вероятностью 37% 3. FACS машины с интегрированной роботизированной рукой может преодолеть ограничение распределения Пуассона путем точного НОАКING один для одной ячейки в культуре также одновременно 4. Тем не менее, высокие механические напряжения сдвига (таким образом, снижение жизнеспособности клеток) 5 и машина покупка и эксплуатационные расходы ограничили его использование во многих лабораториях.

Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения, микромасштабные устройства были разработаны с высокой эффективностью загрузки отдельных клеток в лунках 6. Тем не менее, Микролунки не обеспечивают достаточное пространство для нагруженные клетки к пролиферации, из-за необходимости делать размер каждого микропланештным, близкой к одной ячейке, чтобы максимизировать вероятность загрузки одноклеточных. Как Анализы культуры необходимы во многих приложениях , основанных на клетках (например, клоногенности 7), более крупные Микролунки (от 90 - 650 мкм в диаметре или по длине боковой) также были использованы для обеспечения расширенных клеточных культур. Тем не менее, как и методом серийных разведений, они также обладают низкой эффективностью одноклеточ- погрузочных, в пределах от 10 -. 30% 8, 9

Ранее мы разработали высокой пропускной микрожидкостных платформу для выделения отдельных клеток в отдельных лунках и демонстрируют свое применение в клоногенности из изолированных клеток. 10 Устройство было сделано с поли-диметилсилоксан (PDMS), и включает в себя два набора микролуночные массивов с различными размерами микролуночные, которые могут в значительной степени улучшить эффективность при загрузке одной ячейки в микропланшета размер которого значительно больше, чем клетки. Следует отметить, что это понятие "двойного хорошо" позволяет размер области культуры, чтобы гибко регулироваться без влияния на эффективность улавливания одноклеточных, что делает его простым для регулировки конструкции устройства в соответствии с различными типами клеток и приложений. Этот метод высокой эффективности должно быть полезным для долгосрочных экспериментов на культуре клеток для исследования клеточной гетерогенности и моноклональное создании клеточной линии.

протокол

Примечание: Конструкции фотошаблонов для изготовления нашей микрожидком устройства были сделаны с использованием системы автоматизированного проектирования программного обеспечения (САПР). Проекты были затем использованы для изготовления фотошаблонов хромовые с использованием коммерческих услуг. Эти PDMS устройства были сделаны с использованием мягких методов литографии. 11

1. Изготовление пресс-форм Мастер литографией

  1. До начала процесса 12 фотолитографии используют 4- х дюймовых кремниевых пластин в качестве подложки и обезвоживают пластин в обычной печи при 120 ° С в течение 10 мин.
  2. Очистите обезвоженные кремниевых пластин с помощью плазменной обработки кислорода при 100 Вт в течение 30 секунд в очистителя плазмы.
  3. Разогреть две конфорки при 65 ° C и 95 ° C, соответственно, для последующего процесса выпечки.
  4. Coat 5 г негативного фоторезиста (PR) на очищенную кремниевых пластин спиновой для нанесения покрытий; спина при 1200 оборотов в минуту (SU-8 50) в течение 30 секунд, чтобы произвести Микроканал слой.
  5. Поместите PRс покрытием пластины на предварительно нагретую плитке при 65 ° С в течение 12 мин, и передать его на другой предварительно разогретой конфорке при 95 ° С в течение 33 мин (за толщиной 100 мкм узоров), чтобы выполнить мягкий процесс выпечки.
  6. После выпечки, поместите PR покрытием кремниевой пластины на держателе полуавтоматической маски выравнивателя и выровнять его фотошаблона прозрачности в 25400 точек на дюйм разрешение.
  7. Проэкспонируйте PR покрытием кремниевой пластины , УФ - излучения (365 нм) в дозе 500 мДж / см 2 , чтобы создать шаблон PR на кремниевой пластине.
  8. Удалите пластину из выравнивателя и поместите его на плитке для пост-термообработки при температуре 95 ° С в течение 12 мин.
  9. Замачивание вафель в СУ-8 разработчик раствора (монометилового эфира пропиленгликоля, ацетат PGMEA), чтобы смыть несшитый PR в течение 12 мин и осторожно сухой газообразным азотом, чтобы выставить меток выравнивания.
  10. Опять же, пальто 5 г негативного фоторезиста на пластинах спиновой для нанесения покрытий; спина при 700 оборотах в минуту (SU-8 100) в течение 30 сек и 1200 оборотов в минуту (SU-8 10) в течение 30 секунд на 300 &# 181; м толстый образец и 27 мкм соответственно модели, чтобы сделать микролуночные слой.
  11. Поместите пластину PR, нанесенными на плитке при 65 ° С в течение 4 мин и при 95 ° С в течение 8 мин (в течение 27 мкм глубокий слой снимаемого хорошо); и при температуре 65 ° С в течение 40 мин и при 95 ° С в течение 110 мин (для глубокого слоя культуры, а 300 мкм).
  12. После охлаждения поместите PR покрытием кремниевой пластины на маске выравнивателя, оборудованного УФ-светом.
  13. Проэкспонируйте PR покрытием кремниевой пластины для УФ - света (365 нм) в дозе 250 мДж / см 2 (для 27 мкм толщиной образца) и 700 мДж / см 2 (для 300 мкм толщиной образца).
  14. Испечь вафли при температуре 95 ° С в течение 5 мин (27 мкм толщиной образца) и 30 мин (300 мкм толщиной образца), соответственно.
  15. Смыть несшитый PR в PGMEA в течение 6 мин (27 мкм толщиной образца) и 25 мин (300 мкм толщиной образца), соответственно, а затем высушить их газообразным азотом.
  16. Измерьте высоту модели функции навафля с помощью сканирующего лазерного профилометра путем размещения пластины на ху стадии сканирующего лазерного профилометра.
    1. Регулировка фокальной плоскости, чтобы четко показать рисунок особенности на пластине с помощью режима наблюдения "обзора камеры" под 20X объектива.
    2. Переключение режима наблюдения с "точки зрения" камеры для "лазерного зрения", и установить верхние и нижние положения особенностей.
    3. Установите режим измерения, площадь, качество и Z-поле вплоть до прозрачного (сверху), 1 линия (1,024 х 1), высокой точностью и 0,5 мкм соответственно, а затем нажмите нижнюю Старт, чтобы начать измерение.

2. Подготовка PDMS устройств для изоляции одноклеточные

  1. Перед тем как литье PDMS, silanize мастер-формы с трихлорсилана, чтобы создать гидрофобную поверхность, что делает его легче слезть PDMS реплики из основных форм.
    1. Поместите мастер-формы и весовой лодку, содержащую200 мкл трихлорсилана в эксикаторе и применять вакуум (-85 кПа) в течение 15 мин.
    2. Прекратить вакуум, а затем оставить мастер формы в эксикаторе до silanize мастер-формы при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
    3. Удалите мастер-формы из эксикаторе и поместить каждую основную форму в 10 см чашку Петри.
  2. Смешайте общее количество 17.6 г ПДМС полимерного комплекта, содержащего основание и отвердитель в соотношении 10: 1, а затем залить PDMS на мастер-формы в чашке Петри.
  3. Поместите чашку Петри в эксикаторе и применять вакуум (-85 кПа) в течение 1 ч для удаления пузырьков воздуха в PDMS.
  4. Удалите чашку Петри из эксикаторе и поместить его в обычной печи при температуре 65 ° С в течение 3 - 6 ч, чтобы вылечить PDMS.
  5. Удалите отвержденного PDMS реплики из основных форм и пробивать два отверстия как вход и выход на обоих концах микроканала на захвате ну массива PDMS реплики с помощью перфоратора с внутренним диаметром-0.75 мм для струйного канала (фиг.2А).
  6. Используйте ленту, чтобы очистить поверхность реплик PDMS, а затем поместить реплики PDMS в очистителя плазмы для кратковременного лечения кислородной плазмы (100 Вт в течение 14 секунд).
  7. Удаление реплик PDMS из кислородной плазмы машины.
  8. Совместите верхнюю часть (содержащую миропланшет захвата) и нижний слой PDMS (содержащие лунках культура) реплику вручную под стереомикроскопа и привести их в контакт.
  9. Поместите выровненные PDMS репликами в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 24 часов для достижения постоянного сцепления между PDMS репликами с образованием конечного устройства.
  10. Замочите устройство PDMS в деионизированной (DI) -Water заполненного контейнера и поместите контейнер в эксикаторе под вакуумом (-85 кПа) в течение 15 мин, чтобы удалить воздух из микроканала устройства PDMS.
  11. Поместите DI заполненный водой устройство PDMS в капот культуры ткани и использовать УФ-излучения (длина волны света: 254 нм), чтобы стерилизовать устройства для 30 мильп.
  12. Заменить DI воды в устройстве PDMS с 5% бычьего сывороточного альбумина в (BSA) в растворе 1X PBS и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин, чтобы предотвратить клетки от прилипания к поверхности PDMS.
    Примечание: Покрытие БСА имеет решающее значение для повышения эффективности передачи изолированных клеток от захвата-хорошо к культуре-хорошо.
  13. Заменить 5% раствор БСА в устройстве PDMS стерильным раствором 1x PBS.

3. Получение одноклеточные Подвеска

  1. Культура нейрональных стволовых клеток KT98 и А549 карциномы человека клеток и MDA-MB-435 у нас в чашке Петри в обычных клеточных культур инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 и 95% влажности) для подготовки клеток для эксперимента ПДМС клеточного устройства ,
  2. Удаляют использованную питательную среду (DMEM базальной среды, подаваемой с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотиков) из культуральной чашки с клетками, выращиваемых до 70 - 80% слияния.
  3. Осторожно промыть клетки с стерилизованных PBS три раза.
  4. Удаляют PBS, и добавьте 2 мл рекомбинантного фермента смеси с протеолитическими, коллагенолитических и деятельности ДНКазы (смотрите в список материалов для получения подробной информации).
  5. Выдержите культуры блюдо при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем нажмите культуры блюдо для облегчения открепления клеток.
  6. Добавляют 4 мл стерилизованного PBS, чтобы разогнать клетки, а затем передачи клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку.
  7. Центрифуга трубки при 300 х г в течение 3 мин и удалить супернатант.
  8. Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 1 мл стерилизованной PBS и подсчитать количество живых клеток с использованием стандартного трипанового синего метод исключения 13.
    Примечание: Этот шаг взмучивания имеет решающее значение для подготовки хорошо диссоциирует одной клеточной суспензии для повышения эффективности изоляции одноклеточных.

4. Изоляция Одноклеточный и Клональный Культура

  1. Нагрузка 50 мкл суспензии клеток в концентрации 2,2 - 2,5 х10 6 клеток / мл в микроканале устройства PDMS через выходное отверстие устройства с портативным пипеткой.
    Примечание: клеточная суспензия загрузки пипетка должна быть остановлена ​​и удерживается в первом положении остановки, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в микроканале.
  2. Загрузить еще 50 мкл клеточной суспензии через входное отверстие, чтобы равномерно заполнить весь микроканал с клетками.
  3. Уплотнение выходное отверстие с пробкой (длинный 3 мм, 1 мм в диаметре вырезать нейлоновой леской), чтобы избежать потока, индуцированный гидростатическим давлением из капель на впускных и выпускных отверстий.
    Примечание: Пробки были УФ стерилизовать внутри тканевой культуры капот перед использованием.
  4. Залить 1 мл стерильного шприца с культуральной средой, извлечь пузырьки воздуха из него, и установить его на шприцевой насос.
  5. Подключение носителя загружен шприц к впускному отверстию устройства PDMS через 23 G тупой иглой и поли-tetrafluoroethene (PTFE) трубки.
  6. Выньте вилку из выпускного отверстия и всевл интервал времени 2-мин, чтобы позволить клеткам оседать в одноклеточных захвата скважин под действием силы тяжести.
  7. Смывают Неуловленные клетки с 300 мкл культуральной среды, при скорости потока 600 мкл / мин с приводом от шприцевой насос.
  8. Подождите в течение 2 мин, чтобы стабилизировать устройство, и уплотнение впускного и выпускного отверстия с заглушками, чтобы сформировать замкнутую систему культуры.
  9. Переверните устройство вручную, чтобы передать захваченные одиночные клетки в лунках культуры.
  10. Поместите устройство PDMS в 100-мм блюдо культуры ткани в, и добавляют 10 мл стерильного PBS вокруг устройства, чтобы избежать культуральной среде испарения с микроканала.
  11. Перемещение культуры блюдо с обычной клеточной культуры инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 и 95% влажности) для клональной культуры одноленточного клеток.

5. Культура Средняя Пополнение запасов

  1. После того, как 1 г культуры, заменить культуральную среду, в устройстве PDMS со свежей средой для улучшения клеточной PRoliferation.
  2. Место две капли культуральной среды на верхней части устройства PDMS вблизи впускного и выпускного отверстий областей, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в микроканале при выполнении следующего шага.
  3. Удар два отверстия из верхней части устройства PDMS вблизи двух концов микроканала в качестве впускного и выпускное отверстие для микроканала.
    Примечание: Не пробивать целых два слоя PDMS устройства; вместо этого, просто удар через верхний слой из PDMS.
  4. Подключите пластиковый шприц, содержащий 1 мл свежей среды на входе через 23 G тупой иглой и PTFE трубки.
  5. Поток 120 мкл свежей среды в устройство в течение 5 мин, чтобы заменить старый носитель.
  6. Вставьте две заглушки для герметизации впускных и выпускных отверстий, и вернуть устройство в культуре клеток инкубатора.
  7. Обновить культуральной среды каждые 2 D в течение периода культуры путем удаления заглушек, а затем, повторяя шаги 5.4 до 5.5.

Результаты

Микрожидкостных платформа для изоляции и культуры одноклеточной содержит микроканале (200 мкм в высоту) с двумя наборами микролуночные массивов (рис 2А). Два набора микролуночные массивов, называются захвата-луночные (25 мкм в диаметре и 27 мкм по глубине) и культ...

Обсуждение

Системы устройств Микропланшетные на основе 6,14 были использованы для манипулирования одноклеточных и анализа, такие как крупномасштабной одной клетки захвата 6 и пролиферации одного гемопоэтических стволовых клеток 15. Несмотря на то, также размер, количество и форм?...

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AutoCAD softwareAutodeskAutoCAD LT 2011Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer Eltech corperationSPE0039
Conventional ovenYEONG-SHIN companyovp45
Plasma cleanerNordsonAP-300Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresistMicroChemY131269
SU-8 100 negative photoresistMicroChemY131273
Spin coaterSynrex Co., Ltd.SC-HMI 2" ~ 6"
HotplateYOTEC companyYS-300S
Msak alignerDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
SU-8 developerGrand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GCPropylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometerKEYENCEVK-X 100
TrichlorosilaneGelest, IncSIT8174.0Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
DesiccatorBel-Art ProductsF42020-0000Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kitDow corningSylgard 184
Harris Uni-Core puncherTed Pella Inc.15072with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape3M CompanyScotch Removable Tape 811
StereomicroscopeLeica MicrosystemsLeica E24
Bovine serum albumin (BSA)Bersing TechnologyALB001.500
DMEM basal mediumGibco12800-017
Fetal bovine serumThermo HycloneSH30071.03HI
AntibioticsBiowestL0014-100Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixtureInnovative cell technologyAM-105Accumax
DiIC12(3) cell membrane dyeBD Biosciences354218Used as a cell tracker
Syringe pumpHarvard Apparatus703007
Plastic syringe (1 ml)BD Biosciences309659
23 gauge blunt needlesEver Sharp Technology, Inc.TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubingEver Sharp Technology, Inc.TFT-23Tinner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm

Ссылки

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
  3. Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
  4. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
  5. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  6. Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
  7. Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
  8. Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
  9. Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
  10. Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
  11. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
  12. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
  14. Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
  15. Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
  16. Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
  17. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
  18. Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
  19. Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены