JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Аннотация

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Введение

CF обусловлена мутацией в муковисцидоз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) гена , который кодирует эпителиальный канал анион. CF затрагивает около 85 000 человек во всем мире 1. Более 2000 CFTR мутации были идентифицированы ( www.genet.sickkids.on.ca ). Это разнообразие частично объясняет широкий спектр наблюдаемых болезненных фенотипов ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Шесть классов CFTR мутаций определяются на основе их влияния на экспрессию CFTR белка и функции: (I) не синтеза, (II) нарушение оборота, (III) литниковой дефектный канал, (IV) изменен проводимости, (V) пониженные уровни нормально функционирование CFTR, и (VI) нарушение клеточной устойчивости поверхности 4. Хотя общие мутации CFTR хорошо изучены, функция CFTR и связь с клиническим статусом остаются poorlу понимается на уровне индивидуума, особенно для большой группы редких "бесхозных" мутаций ( www.CFTR2.org ) 1, 3.

В последнее время препараты были разработаны, которые нацелены на белок CFTR в мутации конкретной моды. Два класса CFTR белка таргетирования препаратов в настоящее время используется в клинической практике и имеют различные способы действия. Потенциаторы, такие как VX-770, повышения открытой вероятность апикально локализованной мутантного CFTR и действовать непосредственно после их добавления к клеткам 5. Корректоры, такие как VX-809, восстановить торговлю эндоплазматического ретикулума локализованы неправильно свернутых CFTR и требуют предварительной инкубации с клетками до воздействия наблюдаются 6. CFTR , потенцирующее, VX-770, было зарегистрировано для субъектов с мутацией G551D 7, 8, а также для восьми другихCFTR стробирования мутации, в том числе S1251N 9; вместе, эти мутации переносятся на 5% всех субъектов МВ. Другие клинические испытания показали , что VX-770, в сочетании с корректором VX-809, имеет ограниченную еще значительное влияние на функцию легких и вызывает снижение темпов обострений у субъектов , гомозиготных по мутации F508del переносимой 45-50% пациентов , 10, 11.

Обычные клинические испытания по выявлению субъектов с наркотиками реагировать в течение оставшихся 50% пациентов с МВ являются дорогостоящими и отнимает много времени и не представляется возможным для людей с крайне редкими CFTR генотипов. Роман, экономически эффективные, персонифицированные методы имеют решающее значение, чтобы соответствовать все большее число CFTR модуляторов для лиц, осуществляющих любые виды мутации CFTR. До сих пор суд включение групп пациентов, несущих специфические мутации CFTR не руководствовался исследований с использованием мутантного гена CFTR трансфекции в часeterologous клеточные системы, за которыми следуют электрофизиологических исследований в Ussing камеры 5, 6, 12. Из - за отсутствия адекватных моделей CF животных, исследования эффективности лекарственного средства в воздушно-жидкостным интерфейсными-дифференцированный бронхиальных эпителиальных клеток , полученных из CF легких эксплантов материалов были использованы для разработки лекарственных средств 13, 14, 15. Тем не менее, ограниченная доступность легких тканей эксплантов и инвазивных процедур для получения бронхиальных клеток от субъектов без терминальной стадии болезни затрудняют анализ менее часто встречающихся мутаций CFTR и предотвратить испытывать снадобья в персонализированным способом. Чтобы преодолеть эти ограничения, «легкий доступ» тканей, таких как колоректальный органоидов, назальных клеток в дыхательных путях и клетки дыхательных путей, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые в настоящее время изучаются для персонализированного медикаментозного лечения.

Ранее мы разработали протоколы к культуре эпителиальных стволовых клеток из любого органа желудочно - кишечного тракта в виде 3D органоиды 16, 17. Для толстой кишки человека / прямой кишки, условия культивирования, определенные вовлекают факторы роста (эпителиального фактора роста (ЭФР), гастрин, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), и Noggin) в сочетании с малыми молекулами (никотинамид, A83-01, и SB202190) в матрице базальной мембраны. В этих условиях, одиночные стволовые клетки или фрагменты тканей небольшие вырастают из в закрытые, кистозный, 3D структуры, образованные высоко-поляризованного эпителия с базальной стороне, ориентированной в направлении наружу. Все типы клеток, как правило, появляются в их нормальных соотношениях и положениях. Органоидами может быть расширен в течение длительного периода времени путем еженедельного механического разрушения и повторного покрытия. Они генетически и фенотипически стабильны и могут быть сохранены, что позволяет долгосрочное расширение и био-банкинг 17. Они поддаютсявсе стандартные клеточные биологические / генетические манипуляции и аналитические методы , разработанные для клеточных линий 2D 18.

Недавно мы показали , что функция CFTR , можно легко измерить в колоректальных органоидам в форсколин-индуцированной набухание (ФИС) анализа 19, 20. При воздействии форсколина (FSK) или, в качестве альтернативы, холерного токсина, органоиды быстро увеличить их циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) уровней, что в свою очередь приводит к открытию канала CFTR 19. Органоидам от здоровых людей, или из субъектов с CFTR мутаций , ассоциированных с остаточной функцией, будет впоследствии набухают в результате ионного и водного транспорта к Органоид просветом, эквивалент в пробирке секреторной диареи. Реакция ФИС колоректального органоидам было показано ранее, является полностью CFTR-зависимой, как указано органоидам, полученных из CFTR-нулевые лицами Анаходим путем использования специфических фармакологических ингибиторов CFTR 19. Большие наборы данных по конкретным темам может быть получена в течение нескольких недель после взятия биопсии.

Для анализа ФИС подробно описаны здесь, органоиды культивируют из ректальных биопсий , которые могут быть получены в любом возрасте , и лишь с ограниченным дискомфорта 21. Органоидами пассируют еженедельно механическим разрушением в отдельных склепах, которые легко Reseal и образуют новые органоиды. Для проведения анализа ФиС, ~ 30-80 из этих маленьких разрушенными органоидам высевают в каждую лунку 96-луночного планшета 19. В день анализа, органоидов окрашивают кальцеин зеленый флуоресцентный клеток проницаемой для красителя, который он удерживается в живых клетках, облегчая живых изображений. Затем Fsk, что повышает внутриклеточный цАМФ и тем самым активирует CFTR, добавляется для того, чтобы стимулировать Органоид отек. Потенциаторы которые действуют на апикальной CFTR одновременно добавляют WIth в форсколин, в то время как корректоры, восстанавливающих оборотом CFTR добавляют 24 ч перед добавлением FSK. Органоид набухание количественно с помощью анализа изображения в автоматическом режиме, который вычисляет относительное увеличение общей площади всех флуоресцентных объектов для каждой временной точки при форсколина дополнение.

3D Органоид набухание обеспечивает преимущества и недостатки по сравнению с существующими электрофизиологических CFTR считываниями в 2D-клетках, культивируемых в дыхательных путях Ussing камер. Основным преимуществом является то, пропускная способность набухать анализа. Клетки культивировали и анализировали с использованием одного типа культуральной среды, и опытный специалист может культура до 25 Органоид образцов на еженедельной основе в то время как количественной оценки приблизительно 1200 точек данных в неделю в течение 12 образцов пациентов. Мы условно ввести одну экспериментальную условие по дублированию или трехкратных измерений на пластину и повторить подобные измерения в трех независимых точках времени инкубации. В общей сложности около 300-500 летИнгл Органоид структуры затем измеряются в экспериментальных условиях, что приводит к очень точные измерения функции CFTR с ограниченной технической изменчивости. Такая точность позволяет четко определить различия в остаточной функции и реакции на CFTR модуляторов и позволяет легко подобрать генетические фоновые эффекты между пациентами , несущих идентичные мутации CFTR 19, 22, 23, 24, 25. Качество данных можно легко оценить с микроскопом изображений. В то время как ФИС полностью CFTR-зависимой, это является косвенным мера результата для функции CFTR, ее считыванием, вызванным взаимодействием транспорта ионов к транспортировке жидкости. Это контрастирует с прямых измерений функции CFTR в Ussing камерах, измеряющих трансэпителиальная ионных токов 26. Ussing камеры позволяют выберите стимуляцию апикальной или базолатеральной Compartments (которых Органоид анализ не позволяет); по permeabilizing базолатеральной мембраны, секреция анион верхушечный CFTR-зависимые могут быть выборочно измерены 27.

протокол

Все эксперименты с использованием человеческих тканей, описанных здесь было одобрено этическим комитетом в университетском медицинском центре Утрехта (UMCU; TcBio # 14-008). Информированное согласие на сбор тканей, производства, хранения и использования органоидами была получена от пациентов в Вильгельмины детской больницы (WKZ) -UMCU.

Оборудование потребляемый инструменты
ламинаре 15 и 50 мл конические пробирки Цейсс LSM 800 - Zen 2 (синий издание) программное обеспечение для измерения изображений
CO 2 инкубатор микроцентрифуге трубки Программа Microsoft Excel
Клеточные культуры микроскоп (свет / оптический микроскоп) 0,22 мкм фильтры
центрифуга серологические пипетки
прокатка шейкер советы Микропипетки фильтр
4 ° C комнате или 4 ° C холодильник для инкубатора криопробирок
CoolCell Cell Замораживание контейнера
Серологическое дозаторов
Micropippette (1000, 200 и 20 мкл)
Viaflo Повторите пипетка
(Живая клетка) конфокальный микроскоп
компьютер
резервуар жидкого азота
Многоканальный (200 мкл)

1. Подготовка Реагенты для культуры

Примечание: Все действия выполняются внутри шкафа и биологической безопасности в соответствии со стандартными рекомендации по работе с клеточными культурами. Для того, чтобы облегчить образование хороших капель матрицы базальной мембраны, поддерживать предварительно нагреты запас 96-, 24- и 6-луночные планшеты в инкубаторе при температуре 37 ° С.

  1. Базальной среды Приготовление
    Примечание: базальную среду (БМ) относится к Расширенный Дульбекко в модификации Дульбекко с питательной смесью Ham F-12 (Ad-DF), дополненной 4- (2-hydroxyethil) -1piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES), глутамин и пенициллин / стрептомицин (Pen / Strep).
    1. В средней бутылке 500 мл Ad-DF, добавляют 5 мл 200 мМ глутамина, 5 мл 1 М HEPES, и 5 мл пен / стреп растворов (10000 Ед / мл, 10000 мкг / мл).
    2. Магазин БМ в холодильнике при 4 ° С в течение не менее 4 недель.
  2. Wnt-3A-кондиционированная среда Приготовление
    Примечание: Wnt-3A-кондиционированной среды производится в доме USINг клеточной линии L-Wnt-3A в соответствии с инструкциями изготовителя.
    1. Для уборки Wnt-3A-кондиционированной среды, собирают среду, подверженную клетки в течение одной недели и вращать его вниз в течение 5 мин при 450 мкг для удаления плавающих клеток.
    2. Фильтр Wnt-3A-кондиционированной среды через фильтр 0,22 мкм и разделить его на порции по 40 мл в 50 мл конические пробирки. Хранить их при температуре 4 ° С в течение по крайней мере 4-х месяцев без потери активности.
    3. Тест на активность Wnt-3A-кондиционированной среды в анализе TOP / ФОП с использованием эмбриональной почки человека (HEK) -293 клеток , трансфицированных Топ- и ФОП-люциферазы и TK- рениллы и измерили с рениллы -luciferase набора для анализа в соответствии с инструкции изготовителя.
      Примечание: TOP-люциферазы репортер, который содержит плазмиду дикого типа TCF связывающие регионы. Если Wnt-3A-кондиционированная среда активна, каноническое сигнализации Wnt активируется. Бета-катенин транслоцируется в ядро ​​ассоциировать остроумиеч TCF / LEF транскрипционные факторы, и активирует транскрипцию люциферазы, вызывая увеличение относительной активности люциферазы при добавлении субстрата. ФОП-люциферазы используют в качестве отрицательного контроля, так как ТСФ области связывания выше по потоку от гена люциферазы мутируют.
  3. Colon Средний Приготовление
    Примечание: Подготовка и разбавить все факторы роста и реагентов в соответствии с рекомендациями производителей. Использование малых размеров аликвоты во избежание циклов замораживания-оттаивания. Функциональные факторы роста имеют важное значение для результатов.
    1. Подготовка среды толстой кишки (СМ), дополнив BM с 1x B27, 1,25 мМ N-ацетилцистеин, 50 нг / мл hEGF, 5 нМ гастрина, 10 мМ никотинамида, 300 нг / мл hRspo3, 100 нг / мл hNoggin, 500 мкМ A83-01 , 10 мкМ SB202190, и 100 мкг / мл антимикробного для первичных клеток.
    2. Разделите КМ на аликвоты и заморозить их при температуре -20 ° С в течение до 4-х месяцев. Оттепель аликвот подготовить полный толстой кишкисреда (ТСМ) путем добавления 50% Wnt-3A-conditoned среды в СМ. Магазин ТСМ до 7 дней при 4 ° С без потери активности.
    3. Для создания Органоид культуры из ректальных биопсий, дополняют ТСМ с 50 мкг / мл ванкомицина, 50 мкг / мл гентамицина и 10 мкМ Rho-ассоциированный белок серин / ингибитор киназы суперспирализованный формирования треонин (RhoKi). Используйте эту среднюю, называемую изоляции среды (IM), только в течение первых двух-трех дней в культуре.
  4. ЭДТА Массоподготовка раствор
    1. Готовят 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 8, в сверхчистой H 2 O, стерилизованный с фильтром с размером пор 0,22 мкм.
  5. Манипуляция базальной мембраны Matrix
    1. Подготовьте матрицу базальной мембраны (BMM) в соответствии с рекомендациями производителя.
    2. Оттепель ВММ ночь на льду.
    3. При переводе СМЛ из бутылки в 15 мл коническую пробирку, использование5 мл пипетку, в 15 мл коническую трубку предварительно охлажденный при -20 ° С.
    4. После размораживания хранить СМЛ в холодильнике при 4 ° С и инкубировать на льду в течение по крайней мере, 30-60 мин перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов, СМЛ должен быть холодным и должным образом перемешаны перед вложением крипты или органоиды.

2. Создание Colon органоидами из биопсию CF пациента

Примечание: После сбора ткани, важно , чтобы поддерживать образец на льду в физиологическом растворе, Дульбекко забуференный фосфатом физиологический раствор без Са 2+ и Mg 2+ (DPBS), или БМ. Быстрая обработка биопсий рекомендуется, но она доказала свою возможность установить Органоид культур из биопсий, хранящихся на льду в течение до 7 дней.

  1. Пусть биопсий оседать на дне конической трубки 15 мл и удалить супернатант.
  2. Добавьте 10 мл ДЗФР к биопсий и пипетку вверх и вниз 10-20 раз с помощью 10 мл пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: пипетка должна быть предварительно увлажненный с БМ перед отбором биопсии.
  3. Пусть биопсий оседают на дне и удалить супернатант.
  4. Повторите шаги 2.2 и 2.3 4-5 раз, пока супернатант не станет прозрачным.
  5. Добавляют 10 мл ППД и 200 мкл ЭДТА (0,5 М) в биоптатах и ​​поместите трубку на качающейся платформе трубки в течение 60-120 мин при температуре 4 ° С.
    Примечание: Время инкубации может отличаться в зависимости от пациента. Если крипты освобождаются, DPBS становится мутным. ЭДТА инкубирование может быть завершена, когда крипты можно наблюдать под микроскопом.
  6. Разрешить склепы осесть. Удалите супернатант.
  7. Возьмите 2 мл BM и добавить его в новый 15 мл коническую трубку. Взболтать эту новую трубу вручную таким образом, чтобы внутренняя покрыта БМ.
  8. С помощью пипетки предварительно смачивать BM, добавляют 2 мл ДЗФР в пробирку, содержащую биопсию и пипетку вверх и вниз 10-20 раз.
  9. Дайте биопсий отстояться и передать DPBS с крипт к новомупробирку, содержащую 2 мл БМ, который был подготовлен в шаге 2.7.
  10. Повторите шаги 2.8 и 2.9 пока больше крипты не будут освобождены.
  11. Спин крипты вниз при 130 мкг в течение 5 мин при 8 ° C.
  12. В то же время, передача IM к шкафу безопасности при комнатной температуре (RT).
  13. Удалите супернатант и добавляют 10 мл БМ в склеп окатышей и повторите шаг 2.11.
  14. Ресуспендируют осадок в 1 мл БМ. Возьмите 5-10 мкл и подсчитать количество крипт на глаз под микроскопом.
  15. Спин крипты вниз при 130 мкг в течение 5 мин при 8 ° C.
  16. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 55% ВММ (v ВММ к об IM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: крипты ресуспендируют в соответствующем объеме 55% СМЛ на 1 склепе на мкл. Если не хватает крипты, минимальный объем СМЛ составляет 40 мкл.
  17. Для затравки, пипеткой 35 мкл на лунку (в 24-луночный планшет). Разделить 35 мкл BMM в 3-5 капель по отдельности для того, чтобы улучшить диффузию GROWTH факторов в СМЛ. Не создавать пузыри.
  18. Поместите и оставьте тарелку вверх дном в термостате при температуре 37 ° С в течение по меньшей мере 20 мин для БММ затвердеть.
  19. Добавить 500 мкл на лунку IM и держать его в термостате при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  20. Обновление среды каждые 2-3 дня. Удалите старую среду пипеткой вне с P1000 пипетки, оставляя нетронутыми ВММ капли. Осторожно добавьте FCM пипеткой его в сторону колодца, а не непосредственно на СМЛ капель.
    Примечание: Если никакие крипты не выпускаются в протоколе изоляции, центрифугировать супернатант, Вымойте гранул 2-3 раза с БМ, и ресуспендируют его в СМЛ. Возьмите остатки ткани и разрезать его на маленькие кусочки с бритвой. Собирают их в коническую пробирку на 15 мл, центрифуга их, и ресуспендируют их в том же BMM. Если какие-либо эпителиальные стволовые клетки присутствуют, то они будут также генерировать органоиды.

3. Пассирование толстой кишки органоидами для обслуживания, замораживания, так и дляskolin-индуцированной Отек Анализ (ФИС)

Примечание: Каждый Органоид культура имеет свое собственное время удвоения. Как правило, колоректальный CF органоиды может быть расширен 1: 3-1: 5 раз через каждые 7-10 дней. Это хороший знак, если наблюдаются многообещающий структуры. Колоректальный CF органоиды являются менее кистозным (рис 2А - 2С) , чем колоректального нормальных органоидов (рис 2D). Для создания и поддержания, органоиды культивировали в 24-луночных планшетах; для замораживания, в 6-луночные планшеты; и для анализа ФиС, в 96-луночных паштетов.

  1. Пассажи органоидами
    1. Хранить СМЛ на льду в течение по крайней мере, 30-60 мин перед использованием.
    2. Храните ТСМ при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа перед его использованием.
    3. Добавьте один 15 мл коническую трубку с именем образца и другую пробирку как «промывали».
    4. Тщательно аспирата среду из лунок с использованием P1000 пипетки, не нарушая СМЛ капли.
    5. Добавьте 1 мл BM 1 а и бвверх по рубить ВММ капли с помощью пипетки P1000. Перенести этот 1 мл в 15 мл коническую трубку с названием образца.
    6. Промыть скважину с еще 1 мл БМ и передать его в ту же 15 мл трубки.
    7. Повторите шаги 3.1.5 и 3.1.6 с более 5 скважин (до 6 лунки 24-луночного планшета будут смыты в одном 15 мл коническую трубку).
    8. Заполните трубку до 12 мл с БМ. Пипетка вверх и вниз с использованием предварительно смачивают 5 мл пипетку.
    9. Спин при 85 мкг в течение 5 мин при 8 ° С.
    10. Удалите супернатант и добавьте 1 мл BM к осадку. С тем же самым кончиком пипетки P1000, подними наконечник P10 без фильтра, и пипеткой вверх и вниз 20 раз. Откажитесь как P1000 и P10 советы.
    11. Добавляют 4 мл БМ с 5 мл пипетки и держать трубку наклоненной приблизительно 70 ° от вертикали в одну сторону. Предварительное смачивание новый наконечник P1000 и перемешать энергично 2-3 раза с P1000 (объем 1 мл).
    12. Сосчитайте до 10, оставаясь при этом в наклонном положении, осторожно соберите верхний слой WIth с P1000 пипетки и передачи 4 х 1 мл в пробирку как «промывали».
    13. Обратите внимание на органоиды оседания на дно в наклонном трубки; бесперебойных органоиды и большие куски будут опускаться на дно. Центрифугируйте 15 мл "промывали" трубку в течение 5 мин при 85 мкг до 8 ° C.
    14. Жидкость над осадком сливают и добавляют необходимое количество средних и BMM к Органоид осадку до конечной концентрации 55% BMM. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз , не создавая пузырьков (рис 3B).
      Примечание: Хорошая плотность достигается путем высева 25-30 органоиды в 10 мкл BMM.
    15. Выполните шаги 2.17-2.19.
  2. Пассирование для Замораживание
    1. Хранить БМ во льду в течение по крайней мере, 30-60 мин перед использованием. Хранить ТСМ при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа перед использованием.
    2. Подготовьте ТСМ, дополненную RhoKi (этап 1.3.3).
    3. Возьмите трипсина из холодильника и оставить его при комнатной температуре в течение по крайней мере за 30 минут до использования.
    4. Выполните шаги 3.1.5-3.1.10.
    5. Удалить столько супернатант, насколько это возможно, добавить 4 мл трипсина и вортексе в течение 30 сек.
    6. Поместите трубку в ванну с теплой водой при температуре 37 ° С в течение 1 мин и вортексе в течение 30 сек.
    7. Проверьте раствор в трубке. Если неповрежденные органоиды все еще видны под микроскопом, повторите шаг 3.2.7.
    8. Когда органоиды разрушены, добавляют 8 мл БМ для нейтрализации трипсина и пипетку 10 раз.
    9. Спин в течение 3 мин при 450 х г при 8 ° С.
    10. Жидкость над осадком сливают и добавляют необходимое количество средних и BMM к органелл, чтобы достичь 55% -ного раствора BMM. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, не создавая пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для замораживания, органоиды должны быть посеяны в соотношении 1: 1 после трипсином.
    11. Семенной 250 мкл в одну лунку подогретого 6-луночного планшета для культуры ткани, производя крошечные, разделенных капель ~ 10 мкл. Поместите планшет вверх дном в термостате при температуре 37 ° С и оставляютБММ затвердеть в течение 20-30 мин.
    12. Добавить 2,5 мл свежей ТСМ + RhoKi в каждом 6-луночный планшет хорошо и передавать пластины в инкубатор (рис 3C).
  3. Пассирование органоидами для анализа ФИС
    Примечание: В зависимости от количества и размера органелл, между 4 и 6 лунки 24-луночного планшета достаточно для высева 27 лунки 96-луночного планшета.
    1. Процесс органоидов, как описано на этапах 3.1-3.1.13.
    2. Ресуспендируют осадок в 120 мкл 50% СМЛ.
    3. Проверьте количество органелл (30-50) в 3 мкл ВММ капли под микроскопом.
    4. Тарелка органоидов использованием одной капли 3 мкл, размещенных в середине каждой лунки паштет 96-луночного.
    5. Поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 15 мин для БММ затвердеть; дальнейшие шаги описаны в шаге 6.1.1.

4. Замораживание Colon CF органоидами

Примечание: ОрганOIDs готовы быть заморожены до 1-2 дней после того, как трипсином и культивированием, так что органоиды все еще будет небольшой, что увеличивает эффективность выживания после размораживания.

  1. Добавляют 1 мл БМ и разбить ВММ капли с помощью пипетки P1000. Переложить в 15 мл коническую трубку.
  2. Промыть скважину с еще 1 мл БМ и передачи в той же 15 мл трубки.
  3. Повторите шаги 4.1 и 4.2 со всеми скважинами.
    Примечание: Для того, чтобы избежать избытка ВММ, 3 лунки 6-луночного планшета объединяют в одном 15 мл пробирку.
  4. Заполните 15 мл пробирку, содержащую органоиды 12 мл холодного БМ и пипетку вверх и вниз с 5 мл пипетки. Оставьте пробирку на льду в течение 5 мин.
  5. Спин в течение 3 мин при 450 х г и 8 ° C и удалить супернатант.
  6. Растворить осадок из органоидов переохлажденный среды и пипетку вверх и вниз, чтобы правильно ресуспендирования органоиды.
    Примечание: 500 мкл среды замораживания используют для каждых 100 мкл СМЛ.
  7. С помощью 5 мл пипетку, перенесите 0,5 млорганоиды ресуспендировали в среде замораживания в стерильную криогенных флаконах.
  8. Передача флаконах в контейнер ячейки морозильной камеры и положить его при -80 ° С.
  9. Через 24 часа, передавать чаш для хранения в жидком азоте.

5. Создание культур из замороженных органоидами

Примечание: Оттепель СМЛ на льду и держать его на льду. Пусть БМ достигают RT и утеплить 10 мл аликвоты до 37 ° С перед тем как приступить к процедуре размораживания одного криопробирку.

  1. Оттепель флакон быстро при перемешивании в C водяной бане при 37 ° до тех пор, пока еще немного замороженного материала.
  2. Передача талой органоиды в коническую пробирку 15 мл с помощью пипетки P1000.
  3. Сразу же после того, как, добавляют 1 мл теплой капли БМ за каплей при встряхивании в нижней части трубки. После того, как 1 мл среды добавляют, тщательно перемешать пипетированием вверх и вниз несколько раз, чтобы разбавить морозильную среду.
  4. Медленно (по капле) добавляют 9 мл теплого BM к конической Конта трубкиоцен- ками органоидов. Инверсия несколько раз.
  5. Спин суспензии клеток в течение 3 мин при 85 мкг и 8 ° C.
  6. Удалите супернатант осторожно, не нарушая гранул. Ресуспендируют Органоид в 90 мкл ТСМ, дополненной RhoKi (этап 1.3.3). Затем добавьте 110 мкл СМЛ.
  7. Добавьте 35 мкл в каждую лунку предварительно нагретый 24-луночного планшета, делая крошечные, отделенные капли.
  8. Перенести пластину на 37 ° C инкубаторе, в результате чего пластины вверх дном в течение 20-30 мин.
  9. Добавьте 500 мкл ТСМ с RhoKi в каждую лунку и передавать пластину обратно в инкубатор (рис 4A - 4C).
  10. После того, как органоиды восстановились должным образом из оттаивании, разбавленные более СМЛ, так что каждый 10 мкл СМЛ содержит 25-30 органоиды. Эта процедура может быть сделано через 2-3 дня после разморозки (рисунок 4D - 4G) и обеспечивает надлежащее рост Органоид.

6. форсколин-индуцированной Отек Какговорят (ФИС)

Примечание: FSK титрование позволяет для измерения остаточной функции CFTR. Для CFTR модуляции, органоиды подвержены данной корректора (например, VX-809) и / или потенцирующее (например, VX-770), в зависимости от генотипа. Как правило, VX-809 добавляется 18-24 ч перед измерением, в то время как VX-770 и Fsk добавляют непосредственно перед началом измерений. Имейте в виду, что некоторые модуляторы (корректоры / потенциаторы) может связываться с пластиковой поверхностью планшета для анализа.

  1. Покрытие для анализа
    Примечание: VX-809 запасы аликвоты при 20 мМ и хранят при -80 ° С. При оттаивании, оставьте при комнатной температуре и защищенном от света месте.
    1. Процесс органоидов, как описано в разделе 3.3.
    2. Если тестирование VX-809 корректора, подготовить кривую доза-ответ в трех повторах со следующими концентрациями: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 и 30 мкм. Подготовьте разведений в ТСМ.
    3. К 96-луночного планшета, добавляют либо 100 мкм; Л ТСМ с соответствующими VX-809 концентрации или 100 мкл ТСМ только и инкубировать пластину.
  2. Измерение Пробирной
    Примечание: VX-770 запасы аликвоты при 20 мМ, в то время как ЧМн в 10 мМ; и хранили при -80 ° С. При оттаивании, оставить при комнатной температуре и защищать от света.
    1. Возьмите флакон кальцеина и ДМСО и оставляют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Добавить 5,1 мкл ДМСО во флакон, где кальцеин поставляется в виде порошка, если не открывать крышку. В противном случае, используйте уже ресуспендировали кальцеина флакон, содержащий 2,5 мкл кальцеина.
    3. Добавить 2,5 мкл кальцеина до 580 мкл БМ в 1,5 мл трубки и пометьте его.
    4. Добавьте 10 мкл этого раствора красителя (БМ + кальцеиновой) в каждую лунку с помощью повтора пипетку.
    5. Ресуспендируют один раз с многоканальным, чтобы гарантировать, что краситель смешан хорошо.
    6. Инкубируйте планшет в инкубаторе C 37 ° С в течение 30 мин.
    7. Во время кальцеиновой инкубации начать подготовку FSKи решения VX-770, если это необходимо.
    8. При использовании потенцирующее VX-770, подготовить кривую доза-ответ в трех экземплярах со следующими концентрациями: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 и 30 мкМ. В случае титрования FSK, концентрации являются: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0 и 5,0 мкМ. Подготовить разведений в БМ.
      Примечание: Для FSK, VX-770, или любой другой препарат добавлен на второй день, Разведения должны быть приготовлены на 2х конечной концентрации, так как 100 мкл FSK / титрование раствора наркотиков будет добавлено в каждую лунку, которые уже содержат по 100 мкл ТСМ.
    9. Передача FSK и VX-770 растворов, P200 пипетку, а также советы для микроскопа комнате.
    10. Для визуализации анализа ФИС, использовать живой визуализации клеток конфокальной микроскопии , оснащенный автоматизированной стадии, нагретую камеру и CO 2 потока.
      Примечание: Следующие шаги относятся к конкретному микроскопе. Различные расстановок должны применяться к другим микроскопов следующие производителяинструкции.
    11. Поместите 96-луночный планшет в держателе.
    12. Введите конфокальной настройки для работы с изображениями.
      1. Предустановленные инструмент живого изображения до 37 ° С и 5% CO 2 , и пусть камера предварительно инкубировать в течение как минимум 30 минут до измерения.
      2. Используйте опцию "Смарт настройки", чтобы выбрать трек Alexa Fluor-488.
      3. Установите 5X объектив и область сканирования до 0.6X, чтобы уменьшить масштаб и захватить всю скважину.
      4. Адаптировать мощности лазера и чувствительность детектора, чтобы включить оптимальное обнаружение кальцеиновыми-зеленого меченых органелл над фоном. Обскура может быть увеличена до 130 мкм и усреднение изображения может быть установлен на уровне 2.
      5. Установите битовую глубину в 8 и размер кадра 512 х 512.
      6. Используйте параметр временных рядов, чтобы установить измерение времени, частоты и интервалы.
        Примечание: Рекомендуется для регулярных измерений: 1 час 10 мин Интервал: циклов = 7 (цикл 1 Т = 0). Для измерений, незначительный отек органиnoids могут быть отображены до 3 часов.
      7. Используйте опцию плитки, чтобы вручную определить отдельные позиции так.
    13. Добавьте 100 мкл FSK и / или VX-770 решений в соответствующие лунки, следуя той же порядка, что и измерения. Начните добавлять решения в первой вошедшие в образ хорошо и по-прежнему с порядком формирования изображения.
    14. Начните измерение.
    15. После того, как эксперимент закончен, сохраните файл.
  3. Анализ данных ФИС пробирной
    1. Создание "Органоид анализ" макрос для анализа данных анализа ФИС с помощью инструмента анализа в качестве программного обеспечения для анализа изображений, который распознает все структуры вошедшие в образ через трек Alexa-488 и заполняет выявленные структуры для расчета увеличение общей Органоид площади за разные моменты времени.
    2. Откройте файл данных с полученных изображений в программе анализа изображения.
    3. Выберите макрос для Органоид анализа.
    4. Установите порог, чтобы сбалансировать соотношение сигнал-шум в одной скважине в момент времени 1 и убедитесь, что все Органоид структуры признаются и заполнены.
      1. Проверьте в 4-6 лунок, чтобы увидеть, если все структуры также признаются в момент времени 7. Слегка изменить порог, чтобы гарантировать, что фоновые сигналы в момент времени 7 не признаются в качестве структур (конкретный порог может несколько меняться между экспериментами).
    5. Установить критерии минимального размера площади признанных объектов до 1000 мкм 2.
    6. Нажмите кнопку "анализ", чтобы начать. Анализ занимает примерно 3 мин, в зависимости от используемого программного обеспечения.
    7. Когда программное обеспечение будет завершена, перейдите в раздел "создать таблицу" и выберите следующие данные: а цифры (таблица должна увеличиваться в таком порядке), моменты времени, а общая площадь на лунку.
    8. Сохранить файл как .xlm экспортировать в программу электронных таблиц.
    9. В этой программе вычислить относительное увеличение площади на достл путем установки зоны временной точке 1 на 100%. Вычислить площадь под кривой (AUC) от временных точек 1-7 в состоянии; нижний предел области (Y-значение) устанавливается на уровне 100%. FSK или наркотиков титрование (X-ось) нанесены на график ППК (Y-ось).

Результаты

На фиг.1А показана репрезентативная свежий изоляцию крипт встроено в СМЛ. Крипт взяты из колоректального биопсии CF субъекта. Обычно Органоид генерируется из каждого склепа (рис 1А - С). Из - за дисфункции CFTR, наиболее толстой кишки CF органоидам...

Обсуждение

Здесь мы предоставляем полный протокол для поколения, расширения, замораживания и оттаивания колоректального органоидов человека. В то время как мы установившиеся культуры Органоид людских некоторое время назад 17, это иногда оказалось трудно установить технологию в дру?...

Раскрытие информации

Hans Clevers is an inventor on patents for organoid culture and the Forskolin-induced swelling assay. Jeffrey M Beekman is an inventor on a patent for the Forskolin-induced swelling assay. Sylvia F Boj and Robert Vries are employed by the Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB), which holds the exclusive license to the Organoid Technology. Otherwise, the authors have nothing to disclose.

Благодарности

Эта работа была поддержана программой HIT-CF голландского CF фонда (NCFS), ZonMw (40-00812-98-14103), Вильгельмины Детский фонд научно-исследовательского госпиталя и CZ и Zilverenkruis / Achmea. Мы хотели бы поблагодарить С. Heida-Мишель, М. Geerdink, К. де Винтер-де Гроот и Г. Berkers (кафедра детской пульмонологии, Вильгельмины детской больницы, UMC Utrecht), и RHJ Хоувен (отдел детской гастроэнтерологии, Вильгельмине Детская больница, УМС Утрехт) для приближения к пациентам и получать биопсию для генерации CF Биобанка.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#12634stored at 4 °C
GlutaMaxThermo Fisher Scientific:  Invitrogen#35050stored at 4 °C
HepesThermo Fisher Scientific:  Invitrogen# 15630-056stored at 4 °C
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific:  Invitrogen#15140-122stored at -20 °C
96 well culture plateCellstar#655180
24 well culture plateCellstar#662160
6 well culture plateCellstar#657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)Life Technologies: Gibco#14190-094stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#31966-021For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)Bovogen#SFBS LOT#11113For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell lineATCC#CRL-2647For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmidsMillipore #17-285For measuring Wnt activity
pTK-RenillaPromega #E2241For measuring Wnt activity
HEK-293ATCC#CRL-1573For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromega #E1910For measuring Wnt activity
Zeocin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#R250-01For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen#17504-044stored at -20 °C
N-AcetylcysteineSigma Aldrich#A9165-5Gstored at -20 °C
NicotinamideSigma Aldrich#N0636stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)PrepoTech#AF-100-15stored at -20 °C
GastrinSigma Aldrich#G9145stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) Tocris#2939stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)Selleckchem#S1049stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)Sigma Aldrich#S7067stored at -20 °C
PrimocinInvivoGen#ant-pm-1stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin)PrepoTech#120-10Cstored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3)R&D Systems#3500-RS/CFstored at -20 °C
VancomycinSigma Aldrich#861987- 250mgstored at -20 °C
GentamycinLife Technologies: Gibco#15710-049stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Sigma Aldrich#431788Stored at 4 °C
MatrigelCorning#354230stored at -80 °C
TryplE Express Life Technologies: Gibco#12605-010for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing MediumLife Technologies: Gibco#12648010for freezing
CalceinLife Technologies: Gibco#C3100MPstored at -20 °C
ForskolinR&D Systems#1099-50 mgstored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809)Selleckchem#s1565stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770)Selleckchem#s1144stored at -80 °C
Name of Reagents/MaterialSolventStock ConcentrationFinal Concentration
GlutaMax200 mM2 mM
Hepes1 M10 mM
Penicillin/Streptomycin10K U/ml 10K µg/ml100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin 100 mg/ml 125 µg/ml
B27 supplement 100x1x
N-AcetylcysteineMiliQ H2O500 mM
NicotinamideDPBS1 M10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)DPBS 0.1% BSA0.5 mg/ml50 ng/ml
GastrinDPBS100 µM10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) DMSO5 mM500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)DMSO10 mM10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)DMSO30 mM10 µM
Primocin50 mg/ml 100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin)DPBS 0.1%BSA100 µg/ml100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3)varies per lot300 ng/ml
Vancomycin10 mg/ml50 µg/ml
Gentamycin10 mg/ml50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)MiliQ H2O0.5 M2 mM
CalceinDMSO10 µg/ml3.3 ng/ml
ForskolinDMSO10 mMvariable
Lumacaftor (VX-809)DMSO20 mMvariable
Ivacaftor (VX-770)DMSO20 mMvariable

Ссылки

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112 (2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -. V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84 (2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

120CFTRIvacaftor VX 770Lumacaftor VX 809

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены