Препарирование, MicroCT Сканирование и морфометрические Анализы бакулюм

Резюме

Многие биологические структуры испытывают недостаток легко определяемых ориентиров, что делает его трудно применять современные методы морфометрические. Здесь мы проиллюстрируем методы для изучения бакулюм мыши (кость в половом члене), в том числе рассечение и сканирования microCT, а затем вычислительные методы для определения полуприцепы ориентиры, которые используются для количественной оценки размера и формы вариации.

Аннотация

Современные морфометрии предоставляет мощные методы для количественного определения размера и формы вариации. Основным требованием является список координат, которые определяют ориентиры; Однако такие координаты должны представлять собой гомологичные структуры по образцов. В то время как многие биологические объекты состоят из легко выявляемых ориентиров для удовлетворения предположение о гомологии, многие из них не таких структур. Одним из возможных решений является математически место полу-ориентиров на объекте, которые представляют один и тот же морфологический область через образцов. Здесь мы проиллюстрируем недавно разработанной трубопровода математически определить полу-ориентиров от мыши бакулюм (пениса кости). Наши методы должны быть применимы к широкому кругу объектов.

Введение

Поле морфометрии включает в себя разнообразие методов количественной оценки размера и формы биологической формы, фундаментальный шаг в научном исследовании ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Традиционно, статистический анализ размера и формы начинается с определения ориентиров на биологическую структуру, а затем измерения линейных расстояний, углов и отношения, которые могут быть проанализированы в многомерном рамках. Ориентир на основе геометрической морфометрии является подход , который сохраняет пространственное положение ориентиров, сохранение геометрической информации из систем сбора данных на основе анализа и визуализации ^5. Обобщенный анализ Procrustes (GPA) может быть применен, чтобы удалить изменение местоположения, масштаба и вращения ориентиров для получения соответствия между образцами, что мinimizes их квадратов разностей - что остается форма несходство ^7.

Важным понятием любого морфологического анализа гомологии, или идея, что можно надежно определить ориентиры, представляющие биологически значимые и дискретные функции, которые соответствуют между образцами или структурами. Например, человеческие черепа имеют гомологичные процессы, отверстий, швов, а также каналы, которые могут позволить морфометрического анализа. К сожалению, определение соответствующих ориентиров сложно во многих биологических структур, особенно тех , с гладкими поверхностями или кривыми ^{8, 9, 10.}

Мы подходим к этой проблеме ниже с использованием вычислительной геометрии. Общая схема работы заключается в создании трехмерного сканирования объекта, который может быть представлен в виде облака точек, а затем повернуть и трансформировать эту облако точек, так что все Specimens ориентированы на общей системе координат. Тогда мы математически определить полу-ориентиры из конкретных областей объекта. Дискретные полуприцепы ориентиры , размещенные на таких регионах , являются биологически произвольный ^11. Проведение ГПД и последующего статистического анализа могут привести к нежелательным артефакты ^{8, 12} , поскольку произвольно расположенные ориентиры не могут быть биологически гомологичны. Таким образом, мы позволяем эти полу-ориентиры математически "слайд". Эта процедура минимизирует разность потенциалов между структурами. Как было сказано в другом месте скользящий алгоритм , используемый здесь уместно дать количественную оценку подобных анатомических областей , лишенные легко определить соответствующие ориентиры ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} Эти методы имеют свои Limitations ^13, но они должны быть адаптированы к объектам различного размера и формы.

Здесь мы покажем , как этот метод был применен в недавнем исследовании бакулюм ¹⁴ мыши, кость в половом члене , которые были получены и потеряли несколько независимых раз в процессе эволюции млекопитающих ^15. Мы обсуждаем Вскрытие и подготовка конкретной кости, бакулюм (Протокол 1), генерация microCT изображений (Протокол 2), и преобразование этих изображений в формат, который позволяет все вниз по течению вычислительной геометрии (протоколы 3 и 4). После выполнения этих шагов, каждый образец представлен координатами ~ 100K XYZ. Затем мы пройти через ряд преобразований, которые эффективно выравнивают все образцы в общей ориентации (протокол 5), а затем определить полу-ориентиры из выровненных образцов (протокол 6). Протоколы 1-4 должны быть похожи, независимо от анализируемого объекта. Протокол 5 и Протокол 6 являются спеcifically предназначен для бакулюм, но мы надеемся, что эти шаги подробно, исследователи могут представить себе изменения, которые будут иметь отношение к их интересующего объекта. Например, были применены модификации этих методов для изучения китов тазовые кости и реберные кости ^16.

протокол

Все процедуры и персонал были одобрены университета Института Южной Калифорнии по уходу и использованию животных комитета (IACUC), протокол # 11394.

1. бакулюм Вскрытие и подготовка

1. Эвтаназии сексуально зрелого самца мыши с помощью углекислого газа переэкспонирования, в соответствии с протоколами, изложенными в соответствующих институциональных животных по уходу и использованию комитета (IACUC) путем.
2. Положите животное в положении лежа на спине, и растягивать пенис, применяя давление с пальцами сбоку от препуциального отверстия.
3. После того, как пенис растянуто, продлить ткани через крайней плоти, насколько это возможно.
4. С помощью ножниц обрежьте пениса проксимальный тела к головке полового члена, где бакулюм проживает.
5. Передача расчлененный пенис в 1,7 мл трубки и добавляют 200 мкл водопроводной воды. Убедитесь, что пенис полностью погружен в жидкость.
6. Инкубируйте ткани в воде при температуре ~ 50 ° С в течение 3-5 дней.
7. После надлежащей инкубации удалить окружающие ткани из бакулюм, с помощью пинцета под микроскопом рассечение. Аккуратно впрыскивают 70% этанола оттолкнуться остальные ткани и очистить кости.
8. Поместите расчлененный бакулюм в новую пробирку микроцентрифужных с крышкой открытой. Оставьте колпачок открытым O / N, чтобы высохнуть кости.

2. MicroCT Сканирование

1. Нажмите на microCT держатель цилиндрического сканирования в кирпич из цветочной пены, чтобы создать цилиндр цветочном пены.
2. Извлечь цилиндр цветочном пены и нарезать ломтиками толщиной ~ 2-5 см.
3. Нажмите сушеные Bacula в цветочном пены, по периметру отдельного среза, чтобы свести к минимуму помехи во время сканирования. Точная ориентация костей Следует отметить, что позволяет должным образом идентификации отдельных образцов в Протоколе 4.
4. Аккуратно поместите кусочек с заделанными костей в держатель microCT.
5. Приобретать microCT сканирования. В случае мыши Bacula ¹⁴ Мы использовали uCT50 сканер (Scanco Medical AG, Brüttisellen, Швейцария) в ОСК молекулярной визуализации центра при следующих параметрах: 90 КВП, 155 мкА, 0,5 мм Al фильтр, 750 выступов на 180 (360 покрытия), время экспозиции 500 мс, а размер воксела 15,5 мм.

3. MicroCT обработка: Преобразование .DCM стека к одному .xyz файла

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый microCT сканирования производит стек .DCM, или "DICOM", файлы, которые представляют собой кусочки изображения, сделанные с помощью объекта. Все ниже по течению вычислительной геометрии требует плоских .xyz файлов, что это просто текстовый файл, который содержит четыре столбца - х, у, г координаты каждого пикселя, а интенсивность пикселя, начиная от -5,000 (черный) до +5,000 (белый). Пороговое пикселей выше 3000, как правило хорошо работает в качестве порогового значения для определения костей.

1. Установить Python (www.python.org) и питон модули КОМАНДЫ, DICOM, PYLAB, SYS и Numpy.
2. Открыть "01_process_dicom.py "{Figshare} с помощью любого текстового редактора. В разделе Переменные, изменение пути, пороговые значения пикселов и имена каталогов по мере необходимости.
3. Запуск "питона 01_process_dicom.py". Прогресс будет выведено на экран. В каждом каталоге, указанном в шаге 3.2, новый файл производится по имени; например, directory_name.PT3000.xyz, где PT3000 указывает порог пикселя указано на этапе 3.2.

4. Обработка MicroCT: Сегментирование-индивидуальные Specimen .xyz Файлы

1. Установить R (https://www.r-project.org/) с библиотекой RGL.
2. Откройте файл '02_segment_dicoms.r' {Figshare} с помощью любого текстового редактора. В разделе Переменные, измените путь, чтобы указать на файл .xyz, созданный в Протоколе 3 выше.
3. Изнутри R, запустите команду "источник (" 02_segment_dicoms.r ")" (без двойных кавычек).
4. После трехмерного изображения файла .xyz, созданного в Протоколе 3 появляется, введите Numbeг образцов в общем файле .xyz. Затем ярлык и выбрать точки из каждого образца с помощью функции прокрутки и масштабирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На заднем плане, отдельные .xyz файлы будут сделаны для каждого образца. Они появляются в каталоге с именем, например, XYZ_FILES_PT3000, где PT3000 указывает пороговое значение пикселя используется.

5. "Выравнивание" Образцы .xyz файлов в общей системе координат.

1. Откройте Python скрипт "03_transform.py" {Figshare}, что требует дополнительного модуля mattdean_modules.py {Figshare}, а также две самостоятельные приложения стоя: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) и "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm), которые используются этим сценарием.
2. В разделе Переменные определить полные имена путей к mattdean_modules.py, rotate_path и qconvex_dir. Кроме того, определить полный путь к каталогу, содержащему индивидуальную .xyZ-файлы, созданные на шаге 4.
3. Запуск 03_transform.py, который создает новый файл для каждого образца с суффиксом .TRANSFORMED.xyz.

6. "дележ" Унифицированные образца .xyz Файлы для идентификации Semi-ориентиры.

1. Открыть и запустить Python скрипт "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. В разделе Переменные определить полные имена пути к каталогу, содержащему файлы .TRANSFORMED.xyz. Этот сценарий идентифицирует 802 полу-ориентиры, которые могут быть использованы для количественного определения размеров и формы конструкции.

Результаты

Хуг координаты полуосей ориентиров , производимых в Протоколе 6 могут быть непосредственно импортированы в любой анализ знаковой на основе геометрической морфометрии ^17. Вычислительный трубопровод выше, был применен для изучения мыши Bacula ^14, ?...

Обсуждение

Критические шаги в приведенном выше протоколе являются: 1) рассекает Bacula, 2) собрать microCT изображения, 3) преобразования выходного сигнала microCT в плоский файл АБВ координат, 4) сегментирования из облака точек каждого образца, в 5) преобразование каждого образца стандартизированная система ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland