Использование двух мерных полу денатурируя стирального геля агарозы подтвердить размер неоднородность волокон амилоида или амилоид как

Резюме

Здесь мы используем двумерных полу денатурируя геля агарозы для подтверждения наличия волокон амилоида как гетерогенной размера и исключить возможность того, что размер неоднородность является диссоциации волокон амилоида при гель Запуск процесса.

Аннотация

Амилоида или амилоид как волокна были связаны с многих заболеваний человека и теперь обнаруживаются имеет важное значение для многих сигнальных путей. Способность легко обнаруживать формирования этих волокон различных экспериментальных условиях существенно важное значение для понимания их потенциальные функции. Многие методы были использованы для обнаружения волокна, но не без некоторых недостатков. К примеру электронной микроскопии (EM), или окрашивание с Конго красный или Тиофлавин Т часто требует очистки волокон. С другой стороны, полу денатурируя стиральный порошок очки геля агарозы (SDD-возраст) позволяет обнаруживать SDS-устойчивостью волокон амилоида как в клеточных экстрактов без очистки. Кроме того он позволяет Сравнение размера разницы волокон. Что еще более важно она может использоваться для выявления специфических белков внутри волокон, Западный blotting. Это менее затратным по времени и более доступными для более широкого числа лабораторий. SDD-возраст результаты часто показывают переменной степени неоднородности. Это поднимает вопрос, ли частью неоднородность результатов от диссоциация комплекса во время электрофорез SDS в присутствии белка. По этой причине мы использовали второй аспект SDD-возраста, чтобы определить размер неоднородность, видели в SDD-возраст действительно результат волокна гетерогенность в естественных условиях и не в результате деградации или диссоциации некоторых белков во время электрофорез. Этот метод позволяет быстрый, качественный подтверждение, что волокон амилоида или амилоид как не отделения частично во время процесса SDD-возраста.

Введение

Формировании амилоидных волокон благодаря сворачиванию белков уже давно известен играть определенную роль в патологических условиях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона¹. Совсем недавно формирования волокон амилоида или амилоид как было показано, быть частью сигнальных путей в организме человека, в том числе во время анти-вирусные врожденный иммунный ответ² и necroptosis^3,4и в нижней организмов такие дрожжи^5,6. Таким образом способность обнаруживать эти волокна в лаборатории имеет важное значение. В настоящее время, существует три основных способа для обнаружения амилоид и волокон амилоида как: использование красителей, EM и SDD-возраста.

Использование красителей, таких как красный Конго или Тиофлавин Т, предлагает преимущество быстро и легко обнаружить с помощью микроскопии и спектроскопии⁷. Однако обнаружение по микроскопии, в случае Конго красный, обеспечивает не специфика, о котором белки составляют волокна, или размер волокон. Аналогично использование спектроскопии для обнаружения Конго красный или Тиофлавин Т привязки белковых комплексов обеспечивает только положительный или отрицательный результат.

ЕТ предоставляет убедительные доказательства наличия волокон, а также количественной информации о волокна длиной и диаметром⁸. Однако этот метод требует очень строгие очистки. Кроме того EM-это специализированная техника, которая использует дорогостоящего оборудования.

SDD-возраст был использован для обнаружения SDS-устойчивостью мега Далтон белковых комплексов, включая амилоида или амилоид как волокна. Она имеет много преимуществ. Во-первых он не требует очистки волокон и легко peform⁹. Во-вторых она обеспечивает качественную информацию о размере волокон, включая относительный размер и количество волокна heterogenicity. И наконец потому что Западный blotting может выполняться после электрофореза, это легко обнаружить присутствие любого белка, для которого есть антитела, хотя следует отметить, что потому что SDD-возраст полу денатурируя, некоторые epitopes могут оставаться скрытым который усложняет обнаружение антителом.

Недавно формы волокон амилоида поступало рецептор взаимодействующих киназу 1 (RIPK1) и 3 (RIPK3) в качестве сигнализации платформ во время necroptosis, форму запрограммированного некроза³. Изучая эти волокна, наши лаборатории показали, что другой necroptosis связанные белком, смешанные линии киназы домена как (MLKL), также формируется амилоид как волокна⁴. Однако после осмотра с SDD-возраст, размер MLKL волокон появился отличаются от RIPK1 и RIPK3 волокон, которые появились идентичны друг к другу (рис. 1). Это было неожиданным, потому что хорошо известно, что MLKL привязан к RIPK1/RIPK3, сформировать necroptosis сигнализации комплекс под названием necrosome¹⁰.

Существует по крайней мере два объяснения. Во-первых два совершенно различных волокон амилоида как может образоваться во время necroptosis, один содержащие RIPK1/RIPK3 и других содержащих MLKL. Во-вторых только один тип волокон амилоида как, содержащие RIPK1/RIPK3/MLKL может образовываться при necroptosis, но Ассоциация MLKL с другими белками является достаточно слабый, которые он разъединяет эпоху SDD.

Для решения этой проблемы, мы предлагаем выполнение двухмерный (2D) SDD-возраст. Амилоид SDD-возраст stable или волокон амилоида как будут иметь один и тот же шаблон миграции во время первой и второй аспект электрофореза. Это будет обнаружить после передачи белки мембраны и проведении западную помарку. Стабильные волокна представят резкий диагональной последовательности. Любое отклонение от этого хотел бы предложить, что волокна претерпевают изменения вследствие SDS-электрофорез.

протокол

1. Подготовка образцов

1. Амилоид⁶ культура 2 x 10, производящ клетки рака толстой кишки HT-29 в 10 см ткани культуры блюдо в 10 мл из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) содержащий 10% плода бычьим сывороточным и пенициллина и стрептомицина. Культура клетки ночь в инкубаторе 37 ° C с 5% CO₂.
   1. После того, как клетки растут до 80% confluency, вымойте клетки с 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS). Добавить 3 мл раствора трипсина и инкубировать при 37 ° C на 3 мин.
   2. После того, как клетки полностью диссоциированных от блюдо, добавляют 10 мл питательной среды и передаче клетки с пипеткой 10 мл 15 мл Конические трубки. Центрифуга клетки на 1000 g x 3 мин при комнатной температуре. Аспирационная среды, Ресуспензируйте клетки в 5 мл питательной среды и подсчитать ячейки, используя счетчик соматических клеток. Пластина 2 х 10⁶ клеток в каждом из двух блюд 10-см.
   3. Позволяют клеткам присоединиться и восстановить всю ночь в инкубаторе 37 ° C с 5% CO₂. Применить лечение к одно блюдо, чтобы вызвать образование Амилоиды с 20 нг/мл фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), 100 Нм Смак подражательный и 20 мкм Пан caspase ингибитор Z-Вад-FMK¹¹. Сочетание сокращенно ВЗБ. Лечить другие блюдо с транспортного средства, как элемент управления.
2. После соответствующей продолжительности времени обычно 6 h, урожай lysate клетки.
   1. Скрип клетки от пластины с пластиковый скребок и для передачи в 15 мл Конические трубки используйте пипетки 10-мл. Центрифуга клетки на 1000 g x 3 мин при 4 ° C.
   2. Вымыть клетки 2 раза resuspending в 10 мл холодного льда PBS и центрифугирование в 1000 g x 3 мин при 4 ° C. Аспирационная PBS решения.
      Примечание: Этот процесс может быть приостановлена здесь путем замораживания Пелле клеток в жидком азоте и хранения в ˗80 ° C сроком до 1 месяца.
   3. Передача ячейки Пелле microcentrifuge 1,5 мл пробирку и инкубировать в 0,3 мл буфера lysis для 30 мин на льду. Центрифуга на 20000 x g 15 мин при 4 ° C. Супернатант является весь lysate клетки.
      Примечание: Этот процесс может быть приостановлена здесь, сохраняя образца при-20 ° C до нескольких месяцев.
   4. Измерьте концентрацию белка assay Брадфорд согласно протоколу от производителя. Добавьте 4 x SDD-возраст загрузки буфера подготовить 20 мкл 3 мкг/мкл пример и инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.

2. подготовить и запустить гели

1. Добавьте 2 g агарозы в 200 мл буфера Tris ацетат 1 x (ТЭ) в стеклянный стакан и тепла в микроволновую печь для плавления агарозы. Добавьте 1 мл 20% SDS для конечной концентрации 0,1% SDS. Тщательно взболтать. Старайтесь не создавать пузыри после добавления SDS.
2. Залейте раствор агарозы в slab гель 15 x 14 см. Используйте 1-ОД пипетки для устранения любые пузыри. Поместите один 20-ну гребень на вершине.
3. Первый аспект: Пипетки 60 мкг клеточных lysate в полосу ультраправых. Побегите гель на 60 V для около 4 часов (до тех пор, пока краска фронт является около ¾ через гель) с использованием ТЭ, содержащие 0,1% SDS как идущий буфер.
4. Второй аспект: тщательно поворота 90° по часовой стрелке (рисA) гель. Побегите гель на 60 V для приблизительно 4 ч.
   Примечание: Общее состояние работает-4 V/см Длина гель. Важно, что выполнение условия одинаковы для первого и второго измерения.

3. Передача прав

1. Используйте метод капиллярного передачи для передачи белки винилидена фторид (PVDF) мембраны (рис. 2B).
   1. Добавьте 500 мл буфера передачи примерно на 20 см х 20 см контейнера. Сделайте 5-cm высокий стек бумажных полотенец рядом с контейнером. Площадь поверхности в верхней части стека должна быть больше, чем размеры гель.
   2. Замочите фильтр бумага 14 x 15 см в буфер передачи и место на вершине стека бумажных полотенец. Позаботьтесь, чтобы разместить на бумаге без морщин и пузырей. Повторите с другой кусок фильтровальной бумаги.
   3. Активировать 14 см х 15 см PVDF мембрану в метаноле 30 s затем слоя на фильтровальной бумаге, заботясь, чтобы использовать валик, чтобы удалить все пузырьки. Промойте гель с передачи буфера и слой поверх мембраны, снова выкатывания любые пузыри.
   4. Обложка край полотенца бумажные, ближайший к контейнеру передачи буфера с пластиковой пленкой. Важно, что бумага мост, построенный на следующем шаге не вступают в непосредственный контакт с стопку бумаги полотенце.
   5. Пропитать кусок фильтровальной бумаги 15 см x 35 см в буфер передачи и поместите его так, что один конец закрывает всю верхнюю часть геля и на другом конце находится в контейнере передачи буфера. Повторите с другой мост.
   6. Покрыть контейнер с полиэтиленовой пленкой и оставить на ночь при комнатной температуре.

4. западный Blotting обнаружения

1. Промойте мембрану с 50 мл PBS, содержащие 0,05% Tween-20 (PBST) в контейнере 20 × 20 см. Добавьте 20 мл 5% молока в PBST. Рок при комнатной температуре за 30 минут, чтобы заблокировать.
2. Пипетка 10 мкл антител анти MLKL кролика в 20 мл 5% молока в PBST и добавить в контейнер. Инкубируйте на рокер на ночь при 4 ° C.
3. Вымойте мембраны в 20 мл PBST для 5 минут Повторите 5 раз.
4. Пипетка 4 мкл анти-rabbit-ПХ в 20 мл 5% молока в PBST и добавить в контейнер. Инкубируйте на рокер при комнатной температуре в течение 2 ч.
5. Вымойте мембраны в 20 мл PBST для 5 минут Повторите 5 раз.
6. Добавьте увеличенная хемолюминесценция субстрата (ЭСЛ) и подвергать рентгеновских снимков, по словам производителя протокол.

Результаты

После индукции necroptosis RIPK1 и RIPK3 показали практически идентичны амилоид подобных моделей (дорожки 2 и 4, рис. 1). Однако MLKL волокон более неоднородны и, казалось, быть меньше чем RIPK1/RIPK3 волокна (переулок 6, рис. 1). Это побудило нас к разработке м?...

Обсуждение

Наиболее важным аспектом SDD эпохи-2D является, что электрофорез условия одинаковы для первого и второго измерения. Способность обнаруживать, что резкий диагональной линии под углом 45 ° (показывая, что произошла не диссоциации или деградации) зависит от волокна, миграции идентичным образ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L