JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы облегчить изучение NMDA-рецепторов (NMDAR) в большем масштабе и позволить изучение модулирующее влияние малых молекул и их терапевтического применения.

Аннотация

N-метил D-аспартат (NMDA) рецепторы (NMDAR), классифицируются как ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов и важнейшую роль в учить и память. NMDAR неисправность, выраженные как либо над - или под - activity вызванных мутациями, измененное выражение, торговлей или локализации, может способствовать к многочисленным заболеваниям, особенно в центральной нервной системе. Таким образом понимание биологии рецепторов, а также облегчение открытия соединений и малых молекул имеет решающее значение в продолжающихся усилиях по борьбе с неврологическими заболеваниями. Нынешние подходы к изучению рецептор имеют ограничения, включая низкую пропускную способность, высокая стоимость и невозможность для изучения его функциональные возможности из-за необходимости присутствие блокаторы кальциевых каналов для предотвращения NMDAR-опосредованной Эксайтотоксичность. Кроме того существующие системы пробирного чувствительны к стимуляции от глутамата только и отсутствие чувствительности к стимуляции, глицин, другой сопредседатель лигандом NMDAR. Здесь мы представляем первый на основе плиты пробирного с высок объём мощности для изучения NMDA-рецептора с чувствительностью к совместно лигандов, глутамата и D-Серин/глицина. Этот подход позволяет изучение различных композиций субъединица NMDAR и позволяет функциональные исследования рецептора в глицин и/или глутамат чувствительных режимах. Кроме того этот метод не требуется присутствие ингибиторов во время измерений. Эффекты положительных и отрицательных аллостерический модуляторы могут быть обнаружены с этот assay и известных фармакологии NMDAR была воспроизведена в нашей системе. Эта техника преодолевает ограничения существующих методов и экономически эффективным. Мы считаем, что эта технология будет ускорить открытие терапии для NMDAR-опосредованной патологий.

Введение

С текущих достижений в области медицины продолжительность жизни возросла значительно; Однако так что имеет распространенность заболеваний, связанных с возрастом. Заболевания центральной нервной системы (ЦНС), таких, как шизофрения, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, среди прочих, не являются исключением и были предполагается увеличить в течение следующего десятилетия1, 2 , 3. неисправности ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов, известный как N-метил D-аспартат рецепторы (NMDAR) был связан с болезни Альцгеймера, шизофрении, черепно-мозговой травмы, инсульта, диабета и глаукомы, среди прочего, который гарантирует необходимо изучать их биологии для развития эффективных, Болезнь модифицирующие терапии4,5,6,7.

NMDARs состоят из четырех мономеров или подразделения4,8,9. Структурный состав NMDAR показывает развития и региональной изменчивости в мозг7,10. NMDARs участвуют в синаптической пластичности, познания и генерации ритмов для дыхания и локомоции11,12,13. Как напряжения закрытый канал, это во многом непроводящую на мембранного потенциала покоя (-70 mV) и блокируется магния, чтобы предотвратить дальнейшее проникновение ионов. Канал активируется путем связывания двух лигандов, глутамата и глицина/D-Серин, и одновременное деполяризации в синаптических мембран при посредничестве АМПА рецепторов, другой подкласс ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов. Скорость деполяризации удаляет блокировку магния NMDAR, позволяя приток катионов, особенно кальция14,,1516. Несмотря на то, что активация NMDAR имеет важное значение для выживания клетки, чрезмерное активации может привести к ячейке смерти17,18,19 через Эксайтотоксичность. Это, помимо сложного характера рецептора, делает его сложным для выполнения исследования необходимых для разработки эффективных терапевтических методов.

Различные методы были разработаны для изучения NMDAR. Однако каждый из них имеет, сопровождающих предостережений. Например один широко используемый метод — на основе флуоресценции assay который измеряет NMDAR-опосредованной изменения в внутриклеточного кальция в стабильной клеток линии под контролем промотора тетрациклин индуцибельной (тет-на)20. Однако в этой системе, supramaximal концентраций лигандов, которые необходимы и требование, что ингибиторы NMDAR присутствуют во время измерения делает его почти невозможным для обнаружения деятельности конкурентным антагонистом. В других подобных системах выражение функциональных рецепторов вызывает токсичности, требующих блокаторы кальциевых каналов, такие как кетамин21,22 для сохранения культур клеток. Эти блокаторы кальциевых каналов сидеть в ядре рецептора и трудны для того промыть, особенно в формате на основе плиты, так что они мешают функциональных исследований рецептора. Наконец в электрофизиологические измерения например патч зажима, ограниченной пропускной способности, и крупномасштабные исследования являются очень дорогими23. Несмотря на это перечисленных выше систем нечувствительны к стимуляции глицин; Следовательно изучение деятельности глицин зависимой NMDAR становится проблемой.

Здесь мы опишем новый подход для изучения NMDAR, который преодолевает обсудили ограничения. Наша методика основывается на системе выражение бакуловирусы выразить рецептор на функциональных уровнях с оптимальным соотношением подразделений в качестве лишь 16 часов. Кроме того использование бакуловирусы позволяет для простой и комбинаторные подход, который обеспечивает широкую характеристику различных подтипов рекомбинантных NMDAR. В отличие от других анализов этот протокол не требует блокаторы кальциевых каналов из-за использования слабых противников. Сильным преимуществом метода является что после вымывания слабым антагонистом, рецептор чувствителен к модуляции отдельных глицин и глутамата привязки сайтов в дополнение к двойной модуляции глицин/D-серина и глутамата лиганд привязки сайтов. Assay резюмирует известных фармакологии рецептора NMDAR и последствия его известных положительные и отрицательные модуляторов. Наконец поколение этот в vitro сотовой assay преодолевает сотовой токсичности, вызванные чрезмерным кальция приток и позволяет для функциональных исследований рецептора в высок объём моды, которые могут ускорить открытий NMDAR модуляторы в положениях заболеванием.

протокол

1. Подготовка клеток

Примечание: Этот протокол, включая генерации данных, использует HEK293 клетки преобразованы с бакуловирусы кодирования NR1 и NR2A клетки.

  1. Семя соответствующее количество клеток HEK293 и добавьте NR1 и/или NR2A вируса в соответствующие окончательные концентрации (по 1,00 мкл). Для 384-ну плиты используйте 10 000 клеток/хорошо в окончательный объем 30 мкл.
  2. Кроме того семена HEK293-NR1-NR2A клетки в соответствующую ячейку число и объем (для 384-ну плита, использование 10 000 клеток/колодец в окончательный объем 30 мкл). Добавить Тетрациклин в концентрации 2 мкг/мл, чтобы побудить NR2A выражение и добавить защиту соединения (100 мкм MDL105, 519 или 5 мкм CGP07066724).
  3. Примечание: Бакуловирусы кодирования NR1 и NR2 должны иметь приблизительное титр между 5 х 109 - 10 х 109 инфекционные единицу в миллилитр24.

2. измерение активности NMDA-рецептора

  1. Подготовьте 384-ну плиты с HEK293 клетками преобразованы с NR1/NR2 или HEK293-NR1-NR2A клеток присутствии либо защитного соединения. Используйте ясно снизу, черная рамка, поли D-лизин покрытием плиты.
    Примечание: Защита с 100 мкм MDL105, 519 используется для того, чтобы придать чувствительность к глицин, в то время как 5 мкм CGP070667 используется для того, чтобы придать чувствительность к глутамата.
  2. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2 16 часов (на ночь).
  3. Удалить пластину из инкубатора и аккуратно Выбросьте ячейки СМИ путем замедления, перевернув контейнер совместимый биоотходов пластину. Аккуратно нажмите пластину на бумажное полотенце, чтобы очистить СМИ края пластины и слейте любых оставшихся средств массовой информации.
  4. Подготовьте calcium6-краска, растворяющие один флакон calcium6 краска (1 Размер плиты) в 10 мл инкубации буфера (HBSS рН 7,5, 20 мм HEPES, 1 MgCl2, пробенецид 1 мм). Проинкубируйте 2 часов при 37 ° C и 5% CO2пластины.
  5. Снять пластину из инкубатора и пусть клетки приспособиться к комнатной температуре в течение 10 минут.
  6. Осторожно вылейте calcium6-краска, как описано в шаге 2.3 и добавьте 30 мкл аналитического буфера (HBSS рН 7,5, 20 мм HEPES, 1.8 мм2CaCl, пробенецид 1 мм).
  7. Повторите шаг 2.6 дважды для всего 3 стирок. После последнего стирки оставьте 30 мкл аналитического буфера на клетки.
  8. Пусть на 5 минут при комнатной температуре клетки.
  9. Подготовьте пластину лиганд, делая 4-кратный запас 400 мкм глицин и 400 мкм глутамата (конечная концентрация 100 мкм; оптимальная концентрация лигандов определяется как описано ниже). Передача минимум 25 мкл акций лиганд в V-днище 384-хорошо.
  10. Загрузите лигандом пластины и ячейки пластины в FDSS (функциональная система скрининга наркотиков).
  11. Измерьте базовые флуоресценции (oF) клетки пластины на 30 секунд. Передача 10 мкл акций лиганд в пластину ячейки, используя дозирования функции FDSS и измерения потока кальция при записи calcium6-краска флуоресценции для 5 минут.
  12. Вычислить коэффициент максимального флуоресценции путем деления максимального флуоресценции, получаемая базовой флуоресцирования (FМакс/fo).

3. Оптимизация NMDAR выражение уровней

  1. Чтобы определить оптимальное количество бакуловирусы использовать, выполните титрования NR1 и NR2A вирусов. Подготовить 384-ну плиты с HEK293 клетками (рекомендация 10 000 клеток/Ну, 30 мкл СМИ) и включают в себя защиту соединений, как описано в шаге 2.1.
  2. Добавить различные количества NR1 вируса в разных строках пластины (например: добавить 0 мкл, 2 мкл, 1 мкл, 0.5 мкл, 0,25 мкл в строк Е соответственно). Добавление дубликатов для точности данных.
  3. Добавить различные количества вируса NR2A в разных столбцах пластины (например: добавить 0 мкл, 2 мкл, 1 мкл, 0.5 мкл, 0,25 мкл в строк Е соответственно). Добавление дубликатов для точности данных.
  4. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2 16 часов (на ночь).
  5. Определите оптимальное соотношение и количество вирусов NR1 и NR2A, выполняя измерения потока кальция на FDSS (см. выше).

4. лигандом титрования

  1. Подготовка клетки, как описано в шаге 2.3.
  2. Подготовка разведений каждого лиганда присутствии насыщения концентрации (100 мкм) другим лигандом как 4-кратный Стоковый раствор. Например: для 10 мкм финальный тест концентрации глицина, подготовить 40 мкм Стоковый раствор глицина, включая 400 мкм глутамата.
  3. Перейти с FDSS измерения, как описано в шаге 2.11.

5. сложные испытания

  1. Подготовка клетки, как описано в шаге 1.
  2. Подготовьте пластину лиганда с 5 раз запас окончательного лигандом концентрации в assay buffer.
  3. Подготовьте соединений плита с 4-кратный запас желаемой конечной концентрации соединений в assay buffer. Для окончательного соединения концентрации 10 мкм в assay buffer Подготовьте раствор 40 мкм.
    1. Сохранить концентрацию диметилсульфоксида (ДМСО) постоянной во всех образцах путем подготовки предварительного разбавления комплекса в ДМСО перед дальнейшего разбавления в assay buffer.
    2. Для ответа дозу комплекса в окончательный анализ, колеблется от 3 до 30 мкм Подготовьте предварительное разбавление комплекса в ДМСО, от 1 до 10 мм. Развести в Пробирной буфера 4-кратный запасов концентрации. Конечная концентрация ДМСО не должна превышать 0,5%.
      Примечание: Рекомендуется для проверки каждого образца в triplicates.
  4. Загрузите лиганд, соединение и плита клетки в FDSS.
  5. Измерьте базовые флуоресценции для 30 секунд.
  6. 10 мкл, комплекса запасов и измерения флуоресценции для 5 минут.
  7. 10 мкл лигандом запасов и измерения флуоресценции для 5 минут.
  8. Определите интеграл флуоресценции коэффициент расчета площадь под кривой люминесцентные показатели за последние 5 минут измерения.
    Примечание: в качестве альтернативы, Максимальное соотношение флуоресценции после добавления лиганд может использоваться для анализа.

Результаты

Перед началом тестирования эффекты малых молекул, необходимо определить оптимальное выражение уровня NMDARs, а также концентрации лиганд оптимальной. Как описано, HEK293 клетки были посеяны на 10 000 ячеек на хорошо в пластине 384-Ну, при наличии 5 мкм CGP060667, затем преобразованы ?...

Обсуждение

Успех этот assay в значительной степени зависит от состояния здоровья ГЭС ячеек, которые используются. Клетки проходят экспоненциальный рост и с числом низкий проход должен быть использован. Этот assay включает в себя многие переводы и дополнения решений, поэтому использование осторожно о?...

Раскрытие информации

Авторы имеют без конфликта интересов и ничего не разглашать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить ученых программы бакалавриата почтовое отделение и Новартис институтов для биомедицинских исследований в целом для финансирования этого исследования.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HEK-293ATCCCRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell LineChanTest CorporationCT6120
pFastBac Dual Expression VectorThermoFisher Scientific10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom MicroplateCorning Life Sciences3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay KitMolecular DevicesR8192
GlycineSigma-AldrichG7126
GlutamateSigma-Aldrich49621
D-serineSigma-AldrichS4250
L701,324Tocris907
HEPES BufferBoston Bio ProductBB-103
Magnesium Chloride SolutionSigma-Aldrich63069
Calcium ChlorideVWRE506
HBSSThermoFisher Scientific14025-092
ProbenecidThermoFisher ScientificP36400
DMEM/F-12, GlutaMAX mediaThermoFisher Scientific10565018
MDL105,519NIBRSynthesized in house
NVP-AAM077NIBRSynthesized in house
CGP070667NIBRSynthesized in house

Ссылки

  1. Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
  2. Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
  3. Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
  4. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  5. Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
  6. Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
  7. Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
  8. Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
  9. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
  10. Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
  11. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
  12. Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
  13. Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
  14. Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
  15. Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
  16. Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
  17. Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
  18. Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
  19. Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
  20. Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
  21. Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
  22. Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
  23. Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
  24. Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
  25. Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
  26. Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
  27. Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
  28. Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
  29. Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

137NMDARD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены