JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описывают использование количественных immunoblotting для проверки иммунофлюоресценции гистологии, наряду с анализом изображений как средства количественного протеин интереса в образцах тканей формалином исправлена, парафин врезанных (FFPE). Наши результаты показывают полезность гистология иммунофлюоресценции для выяснения относительное количество белков биомаркеров в обычной биопсии образцы.

Аннотация

Количественная оценка протеинов интереса в образцах тканей формалином исправлена, парафин врезанных (FFPE) имеет важное значение в клинических и научно-исследовательских приложениях. Оптимальный метод количественной оценки является точным, имеет широкий динамический диапазон линейных и поддерживает структурную целостность образца для идентификации типов отдельных клеток. Нынешние методы иммуногистохимии (IHC), масс-спектрометрии и immunoblotting друг не соответствуют эти положения ввиду их категорического характера или необходимо гомогенизировать образца. В качестве альтернативного метода мы предлагаем использование иммунофлюоресценции (КРП) и анализа изображений для определения относительного изобилия протеин интереса в FFPE тканях. Здесь мы продемонстрировать, что этот метод легко оптимизируется, дает широкий динамический диапазон и линейно количественному сравнению с золотой стандарт количественных immunoblotting. Кроме того этот метод разрешает сохранение структурной целостности образца и позволяет для разграничения различных типов клеток, которые могут иметь решающее значение в диагностические приложения. В целом это надежный метод для количественной оценки относительной белков в FFPE образцах и может быть легко адаптирована с учетом клинических или исследовательских потребностей.

Введение

Во многих клинических областях существует необходимость для количественного определения белков в формалин исправлена, парафин врезанных образцах биопсии тканей (FFPE). Например количественная оценка биомаркер белков в обычной биопсии образцов используется прогноз и информировать лечения для рака пациентов1. Однако текущие методы обычно субъективные и отсутствие проверки.

Иммуногистохимия (IHC) обычно используется в лаборатории патологии и обычно зависит от основного антитела, направленные против целевого белка и вторичное антитело проспряганное с ферментативной метки например пероксидазы хрена2. Обычные IHC чувствителен, можно сделать использование минуту образцы и сохраняет морфологической целостности образцов тканей, тем самым позволяя оценки экспрессии белков в своих соответствующих гистологические контексте. Однако потому что хромогенных сигнал IHC Субтрактивный, он страдает от относительно узкий динамический диапазон и предлагает ограниченный потенциал для мультиплексирования2,3,4. При содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии изображений (MALDI-MSI) сохраняет морфологической целостности. Однако эта технология развивающихся ассоциируется с скромные морфологических резолюции и требует значительных калибровки и нормализации, умаление его осуществимости для рутинного использования клинических5,6,7. Альтернативные методы для количественного определения белка в образцах тканей включают immunoblotting8, масс-спектрометрия9,10,11и иммуноферментного анализа (ИФА)12, каждый из которых начинается с усредненной lysate образец ткани. Образцы основной ткани являются разнородными, в том, что они содержат множество типов клеток. Таким образом методы, которые влекут за собой гомогенизация пробы не количественной белка в конкретной ячейке населения интереса, таких как раковые клетки.

Как ИХС, если это применимо к малым FFPE образцы и разрешает сохранение гистологические целостности13. Однако, благодаря добавка характер флуоресценции сигналов, если поддается применение нескольких первичных антител и флуоресцентные метки. Таким образом протеин интереса может быть относительно количественно в пределах конкретных ячеек или сотовой отсеков (например, ядра и цитоплазмы) определяется с помощью других антител. Флуоресценции сигналы также имеют преимущество большего динамического диапазона13,14. Превосходство, воспроизводимость и мультиплексирования потенциал если применен к FFPE образцов был продемонстрировали13,14,15.

Здесь мы описываем использование количественных immunoblotting, с использованием установленных клеточных линий как золотой стандарт для выяснения количественный характер, если в сочетании с анализа компьютерного изображения при определении относительного изобилия протеин интереса к Гистологические срезы из образцов ткани FFPE. Мы применили этот метод успешно в мультиплекс подход к количественно биомаркер белков в клинической биопсии образцы16,17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Разрешение на использование образцов первичной человеческой ткани был получен от медицинских наук и связанные учебных больницах исследований этики Совет (HSREB) в Университете королевы.

1. Строительство линии клетки Microarray ткани (TMA)

  1. Урожай и вымыть клетки.
    Примечание: Этот протокол был протестирован на различных установленных увековечен клеточных линий (например HeLa, Jurkat, РЦГ-ACV).
    1. Для адэрентных клеток урожай примерно 1.3 x 107 клетки, как только они достигают примерно 80% confluency. Отсоедините клеток с использованием реагентов для этой линии клеток.
      Примечание: Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) предпочтительнее вообще трипсина для снижения риска деградации белков поверхности. При использовании трипсина, нейтрализовать трипсина, используя плода бычьим сывороточным (ФБС) сразу же после сбора урожая клетки.
    2. Для подвески клетки урожай примерно 8 х 107 клеток в лаг фазы роста.
    3. Соберите урожай/отдельностоящий клетки центрифугированием за 5 мин на 225 x g в 50 мл Конические трубки.
    4. Декант супернатант и вновь приостановить гранулы в 10 мл 1 X фосфат амортизированное saline (PBS). Центрифуга для 5 мин на 225 x g и сцеживаться супернатант.
      Примечание: 1 X PBS состоит из 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4 в дистиллированной воде; Отрегулируйте пэ-аш до 7,4.
  2. Исправьте клетки в формалине и Пелле их.
    1. Приостановите Пелле ячейки в пределах конические пробки в 10 мл нейтрального буферизации формалина 10% (NBF).
      Примечание: NBF может быть подготовлен путем разбавления 1 мл 37% формальдегида раствор в 9 мл ПБС.
      Предупреждение: Будьте осторожны при обращении с формалином и формальдегида. Используйте вытяжной шкаф для шагов, связанных с формалином и формальдегида.
    2. Инкубируйте клетки на рокер на 24 об/мин при комнатной температуре на ночь (около 17 ч).
    3. Приготовляют раствор 1% о низкой температурой плавления агарозы в PBS (0.01 g агарозы 1 мл PBS).
      1. Подготовьте достаточно для 500 мкл раствора агарозы за образец клеток линии.
      2. Растворите агарозы в 80 ° C водой ванну или тепла блоке, с случайного смешивания для 2-5 мин. После роспуска, держите решение в блоке Ванна или тепла воды 37 ° C для предотвращения упрочнения.
    4. Пелле, фиксированные клетки от шаг 1.2.2 центрифугированием за 5 мин на 225 x g. удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл ПБС.
    5. Перенесите клетки в пробки microcentrifuge 1,5 мл и Пелле центрифугированием за 5 мин на 290 x g. аспирата все супернатант.
  3. Литой клетки в агарозы.
    1. ~ 500 мкл агарозы 1% раствора (от шага 1.2.3) к каждой трубе, содержащий ячейки. Аккуратно, но быстро Пипетка смесь вверх и вниз с помощью P-1000 микропипеткой смешивать.
      Примечание: Отрежьте конце кончика пипетки для увеличения диафрагмы и избежать формирования пузырьков. Держите агарозы рабочий раствор в ванну воды 37 ° C для предотвращения упрочнения.
    2. Дайте раствору агарозы клеток для упрочнения (5-10 мин) при комнатной температуре. Добавьте 1 мл 10% NBF для каждого microcentrifuge трубка, содержащая образец и держать при комнатной температуре до парафин, встраивание (до 24 ч).
  4. Подготовьте вилку агарозы для встраивания парафина.
    1. Аспирационная покинуть NBF из образца.
    2. Удалите заглушку ячейки с помощью лезвия вырежьте пробки microcentrifuge, поместите вилку в пластиковых ткани кассеты. Храните кассеты в 10% NBF при комнатной температуре.
  5. Обработка образцов ночь либо вручную или с использованием автоматизированных ткани процессора и встроить в парафин с использованием методов стандартных гистологии.
    Примечание: См. Фишер и др. 19 для примера протокола.
  6. С помощью специализированного инструмента «ткани arrayer», урожай повторяющиеся 0,6 мм ядер из парафина блока из каждой ячейки строки и вставить их, в строках, в пустой получателей парафин блок для создания линии клетки TMA.
    Примечание: Стандартные методы должны использоваться такие, как описанные в Федор и De Marzo20.
  7. Включать ядра от первичных проб, представляющие типы 2-3 дополнительных тканей (например, миндалин, толстой кишки, яичников и т.д.) как положительный или отрицательный контроль в TMA. Выбор тканей, которые являются подходящими для протеина интереса.
  8. Используйте микротом подготовить два гистологических срезах, примерно 4-6 мкм толщиной, клеточной линии TMA. Смонтировать раздел на слайде гистологии, высушить его и deparaffinize (как описано в Федор и De Marzo20).

2. образец пятная иммунофлуоресценции

  1. Оптимизируйте разрежения основное антитело.
    Примечание: Стандартные протоколы существуют для оптимизации IHC или если для разделов ткани FFPE такие как в Kajimura и др. 21. Краткий обзор подхода изложена здесь.
    1. Подготовка 4-5 разведений первичных антител к протеину интереса, руководствуясь инструкциями производителя.
    2. Определите тип ткани управления из источника животного или человека, который выражает протеин интереса в популяции клеток морфологически узнаваемым. Подготовка разделов ткани и смонтировать их на слайд, после процедуры стандартного иммуногистохимия такие как Федор и De Marzo20.
      Примечание: Количество необходимых разделов является количество разведений основного антитела плюс один дополнительный.
    3. С помощью системы автоматической или ручной для immunohistology, протестируйте основное антитело разведениях от шага 2.1.1 каждый на слайде из шага 2.1.2. Исключить применение основного антитела от дополнительных слайд и использовать его в качестве отрицательного контроля.
    4. Во время процесса окрашивания пятно все слайды с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) как ядерной изображение и дневно тегами вторичное антитело. Если требуется повысить чувствительность, используйте HRP (пероксидазы)-конъюгированных вторичные антитела и усиления системы на основе tyramide сигнала (см. стек et al. 13).
      Примечание: Когда мультиплексирования первичного антитела, различные Флюоресцентная метка используется для каждого белка.
    5. Сканирование слайдов immunostained, используя соответствующий инструмент, способный генерировать файл цифрового изображения с помощью возбуждения и обнаружения длин волн, соответствующих флуорофоров, которые были использованы.
    6. Используйте соответствующее программное обеспечение для просмотра цифровых изображений и эмпирически выбрать основное антитело разрежения, которая оптимизирует интенсивность сигнала относительно фона флуоресценции.
      Примечание: При желании, эта оптимизация может произойти с помощью HRP-конъюгированных вторичные антитела, 3, 3'-диаминобензидин (DAB) и brightfield микроскопии.
  2. Выполняйте, если окрашивание на линии клеток TMA.
    1. Использование автоматической или ручной системы для immunohistology пятно слайд клеточной линии TMA с оптимизированной основное антитело разрежения (как определено в шаге 2.1). Исключить применение основного антитела от второго слайда и использовать его как отрицательный контроль.
    2. Во время процесса окрашивания пятно все слайды с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) как ядерной изображение и вторичные антитела и tyramide как шаг 2.1.4.
    3. Сканирование слайдов immunostained, используя соответствующий инструмент, способный генерировать файл цифрового изображения с помощью возбуждения и обнаружения длин волн, соответствующих флуорофоров, которые были использованы.
    4. Используйте пакет программного обеспечения анализа изображений для выявления клеточных отсек интереса (то есть, цитоплазма против ядро) и подсчитать среднее флуоресценции интенсивности (МФО) для каждой ячейки строки.
      Примечание: Для этой цели могут использоваться различные пакеты программного обеспечения и многие обсуждаются в стек и др. 13.

3. количественные Immunoblotting клеточных линий

  1. Подготовьте лизатов клеток.
    1. Урожай 2 миллионов клеток каждой ячейки строки, как описано в шагах 1.1.1 до 1.1.3.
    2. Вращать клетки вниз на 5 мин на 650 x g в 50 мл Конические трубки. Декант супернатант.
    3. Вымойте клетки с 10 мл ледяной PBS. Ресуспензируйте в 1 мл ледяной PBS и передачи пробки microcentrifuge 1,5 мл. Центрифуга согласно шаг 3.1.2, декантируют и оставить клетки на льду.
    4. Около 200 мкл буфера lysis холодной radioimmunoprecipitation (RIPA) с ингибиторами протеаз (10 µL 100 X ингибиторов мл буфера lysis RIPA) клеток, вихрь и инкубировать на льду за 15 мин.
      Примечание: Количество буфера lysis, необходимых для эффективного лизис варьируется в зависимости от линии клеток и может быть определено эмпирического. Буфер RIPA состоит из 150 мм NaCl, 5 мм ЭДТА, 50 мм трис, 1,0 NP-40%, 0,5% Дезоксихолат натрия, 0.1% SDS в дистиллированной воде.
    5. Чтобы обеспечить относительно даже нагрузка на иммуноблотов, количественного определения общего белка в 20 мкл пример из каждого lysate с использованием соответствующего метода как assay Брадфорд. Около 40 мкл буфера lysis 6 X Laemmli остаток (примерно 180 мкл) каждой lysate клетки и варить при 100 ° C тепла блок или водой ванну за 5 мин.
      Примечание: 6 X Лэмли, буфер состоит из 300 мм трис-HCl (рН 6,8), 4% (w/v) SDS, 60% глицерина, 0,6% (w/v) бромфеноловый синий, 50 мм Дитиотреитол (DTT) в дистиллированной воде.
    6. Храните образцы при-20 ° C до двух недель.
  2. Выполните immunoblot всех клеточных линий, чтобы определить, какие линии клеток имеет наиболее распространенных протеина интереса.
    Примечание: Следуйте процедуре, описанной в Махмуд, т. и Ян, PC. 22, со следующими изменениями.
    1. Алиготе ячейки lysate (подготовленные в шаг 3.1) содержащий 10-50 мкг белка (в зависимости от обилием протеина интереса) в microcentrifuge трубы. 2.5 мкл 6 буфер Лэмли X и достаточно буфера lysis RIPA сделать объем до 15 мкл.
    2. Загрузить 5% укладки и соответствующей концентрации разрешения (например, 10% для белков между 15-100 кДа) геля SDS-PAGE с трапом протеина и образцы из шага 3.2.1. Загрузите 1 X Laemmli буфер в пустой скважин. Запустите блок питания на соответствующие настройки, как правило 125 V, для 80 мин, или до тех пор, пока бромфеноловый синий краситель достигает нижней части пластины.
    3. Выполнить передачу полусухое белка, как описано в Видемана et al. 23.
      Примечание: для представителя результаты, мембраны нитроцеллюлозы (которые не должны быть выдержаны в метаноле), и холодной Bjerrum Шафер-Нильсен (НБС) передачи буфера были использованы. BSN буфер состоит из 48 мм трис, 39 мм глицин, 20% метанола в дистиллированной воде.
    4. После передачи используйте лезвия бритвы вырезать мембраны горизонтально, чтобы отделить части, содержащие протеин интереса от надлежащего внутреннего контроля белка, такие как GAPDH.
    5. Продолжить блокирование и антитела инкубаций, используя блокирующий буфер, рекомендованный производителем первичных антител.
      Примечание: Оптимальный основное антитело разведениях может резко варьироваться в зависимости от белка изобилия и чувствительность. Для представителя результаты ниже антител к протеину интереса требуется 1:1,000 разрежения в то время как элемент управления GAPDH требуется 1:40,000 разрежения. Разбавление вторичные антитела, которые используются был 1:3, 000.
    6. После инкубаций антитела и промывка мембраны место мембраны полоски в прозрачной пластиковой оболочкой как мешок сэндвич.
    7. Приготовить смесь хемилюминесценции (ЭСЛ) доработан после инструкции производителя. Используйте P-1000 пипетки для покрытия мембраны с ECL смеси, закройте оболочка и Проинкубируйте мембрану полоски со смесью в темноте при комнатной температуре в течение 1-2 мин.
    8. Место оболочке мембран в цифровой обработки изображений платформы. Используйте Хемилюминесценция и колориметрические маркер обнаружения для захвата различных экспозиций мембраны.
      Примечание: Время экспозиции будет меняться в зависимости от количество белка загружен, обилие целевого белка, антитела сродства и т.д. начнем с автоматической экспозиции (обычно через несколько секунд) и испытания воздействия раз выше и ниже несколько секунд.
    9. Эмпирически или с помощью программного обеспечения для анализа изображений, определить, какая клеточная линия выражает наиболее целевого белка.
  3. Найти линейный динамический диапазон каждого основного антитела, используя последовательный разрежения.
    1. Выполните шаги 3.2.1-3.2.8 с помощью ряда серийных разведений от линии клеток, которая выражает самую высокую концентрацию целевого белка (определены в шаге 3.2.9).
    2. Используйте программное обеспечение для анализа изображений например ImageJ для выполнения денситометрия на экспозиции изображения.
      1. Например с помощью ImageJ, используйте инструмент Прямоугольного выделения для выбора первой полосе геля для количественного определения. Перейти к анализировать | Гели | Выберите первый переулок. Используйте мышь, чтобы переместить полученный прямоугольник следующей лэйн. Перейти к анализировать | Гели | Выберите следующий переулок. Неоднократно перемещения прямоугольника к следующей лэйн и выберите полосу на оставшуюся часть полосы.
      2. Перейти к анализировать | Гели | Участок полосы. Используйте средство Прямой линии для рисования линий через основы каждого пика чтобы удалить фоновый шум. Используйте « палочка » для выбора каждого пика и собирать плотность каждого пика, отныне именуется как группа интенсивности, в окне результаты .
    3. Используйте денситометрия, выход для создания рассеяния группа интенсивности по сравнению с количество общего белка, загруженные для каждого основного антитела. С помощью линии наилучшего и визуального осмотра, определите местоположение (диапазон интенсивности) линейный динамический диапазон каждого антитела.
    4. Выберите концентрацию белка, который генерирует значение на более высоком конце диапазона линейной быть концентрация двигаться вперед с всех клеточных линий.
      Примечание: Поскольку эта концентрация находится ниже уровня насыщения в строке ячейки с наибольшее количество этого белка, там должно быть никакой опасности за разоблачение полосы для других клеточных линий.
  4. Выполните immunoblot, используя концентрацию белка, выбранный на шаге 3.3.4 для всех клеточных линий и повторите шаги 3.2.1-3.2.8.
    1. Выполните денситометрия на цифровой сканирует как шаг 3.3.2. Выберите изображения воздействия, которые дают сигналы линейной диапазоны для каждого антитела, идентифицированную на шаге 3.3.3.
    2. С помощью группы интенсивности сигналов от идеальной экспозиции от 3.4.1, рассчитайте соотношение целевых белков группа интенсивности загрузки интенсивности группы управления для каждой ячейки строки. Эти соотношения указывают относительное обилие целевого протеина интереса.
    3. Выполнение теста корреляции Пирсона (может быть сделано с помощью пакета статистическое программное обеспечение) соотнести значения, полученные из анализа изображений если окрашивание (шаг 2.2) для тех, кто получил от immunoblotting (шаг 3.4.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот протокол был использован для подтверждения если способность определить относительное количество анти apoptotic белка Bcl-2 в клеточных линиях в FFPE блоков ткани. Количественного определения Bcl-2 выборочно в раковых клетках можно выяснить онкогенных механизмы и может бы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы описали метод который использует количественных immunoblotting (IB) для демонстрации полезности иммунофлюоресценции (IF) для выяснения относительное обилие целевого белка в FFPE образцах тканей. Текущие методы количественной оценки белка ограничены их категорического характера, например хр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа частично финансируется Фредерик Banting и Чарльз Лучшие Канада выпускников стипендии (а.м.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
697DSMZACC 42Cell line
JeKo-1ATCCCRL-3006Cell line
JurkatATCCTIB-152Cell line
RCH-ACVDSMZACC 548Cell line
Granta-519DSMZACC 342Cell line
REHDSMZACC 22Cell line
RajiATCCCCL-86Cell line
HeLaATCCCCL-2Cell line
Trypsin/EDTA solutionInvitrogenR001100For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS)Wisent Inc.81150To neutralize trypsin
Neutral Buffered FormalinProtocol245-684For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agaroseInvitrogen15517-022For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XTRoche-For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)Dako (Agilent)K4000For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)Dako (Agilent)K4002For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagentPerkin ElmerNEL745001KTFor immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-To view scanned slides
HALO image analysis softwareIndica Labs-For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)Thermo Scientific1862209To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)BioShopEDT001For RIPA buffer
NP-40BDH Limited56009For RIPA buffer
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750For RIPA buffer
GlycerolFisherBiotechBP229For Laemlli buffer
Bromophenol blueBioShopBRO777For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB001For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper)Bio-Rad1703969For blotting transfer
Nitrocellulose membraneBio-Rad162-0115For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cellBio-Rad1703940For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk)Cell Signaling Technology9999SFor blocking buffer
Tween 20BioShopTWN510For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibodyEpitomics2251-1Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibodyabcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibodyabcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substratesBio-Rad1705060For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461For immunoblot signal detection
ImageJ softwareFreeware, NIH-For densitometry analysis

Ссылки

  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
  4. Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
  5. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  6. Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
  7. Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
  8. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  9. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  10. Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
  11. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
  12. Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
  15. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
  16. AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
  17. Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
  18. Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
  20. Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
  21. Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
  22. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  23. Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
  24. Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
  25. Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
  26. Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
  27. Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
  28. The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
  29. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  30. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).
  31. Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
  32. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
  33. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13(2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143immunoblotimmunohistology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены