Изоляция одной внутриклеточных бактериальных сообществ, генерируется из мышиных модели инфекции мочевыводящих путей анализа течению одноклеточного

Резюме

Этот протокол описывает простой метод изоляции одного, инфицированных пузыря эпителиальных клеток из мышиных модели инфекции мочевыводящих путей.

Аннотация

В этой статье мы приводим процедуру, используемую для изоляции отдельных внутриклеточных бактериальных сообществ от мыши, который был заражен экспериментально в мочевыводящих путях. Протокол можно разделить на три секции: инфекции, заготовка эпителиальных клеток мочевого пузыря и рот micropipetting изолировать отдельные инфицированные эпителиальных клеток. Изолированные эпителиальных клеток содержит жизнеспособных клеток бактерий и почти бесплатно загрязнять внеклеточного бактерии, что делает его идеальным для вниз по течению одноклеточных анализа. Время от начала инфекции для получения единого внутриклеточных бактериальных сообщества — около 8 ч. Этот протокол является недорогим для развертывания и использует широко доступны материалы, и мы ожидаем, что он также может использоваться в других моделях инфекции изолировать один инфицированных клеток от клеток смеси, даже если эти зараженные клетки встречаются редко. Однако из-за потенциального риска в рот micropipetting, эта процедура не рекомендуется для высоко инфекционных агентов.

Введение

Инфекции мочевыводящих путей (UTIs) являются одним из наиболее распространенных бактериальных инфекций. Ожидается, что примерно 40-50% женщин, опыт по крайней мере один инфекции мочевыводящих путей (UTI) во время их жизни¹. Одним из главных агентов UTI является uropathogenic E. coli (УПЭК), который приходится свыше 70% неосложненной UTIs². Кроме того приблизительно одна четверть тех, которые имеют UTI будет иметь рецидивирующие инфекции, часто вызваны же штамм, несмотря на соответствующее лечение антибиотиками³. Высокая распространенность UTI представляет тяжелым бременем на системы здравоохранения, стоимостью более 2 миллиардов долларов в год в США⁴. Кроме того использование антибиотиков для лечения UTIs также приводит к рост к антибиотикам, который является обеспокоенность общественного здравоохранения⁵.

Таким образом большое усилие было помещено в понимании механизмов, посредством которых УПЭК поражает мочевыводящих путей, а также его способность вызывать рецидивирующие инфекции^6,,78. В частности модель мыши инфекции был использован для изучения бактериальных и принимающих характеристики, которые способствуют UTI⁸. Эта модель мыши имеет преимущество, применимых к неизмененным Клинические штаммы изолированы от человеческого пациентов. Эта модель также привело к открытию потенциально druggable бактериальной пути, важные для создания UTI, таких как тип 1 pilus⁹ и железа приобретения систем¹⁰.

По сравнению с эти успехи в изучении ранних событиях в UTI, знаний о механизмах, лежащих в основе периодически UTI до сих пор отсутствует¹¹. Одна из гипотез является УПЭК избегает антибактериальной терапии и вызывает рецидивирующие инфекции мочевого пузыря, формируя внутриклеточных бактериальных сообществ (КСГМГ) внутри пузыря эпителиальных клеток. КСГМГ были определены как в мышиных моделях инфекции, так и в человеческих UTI пациентов^12,13. Присутствие КСГМГ в пробах мочи в педиатрических пациентах UTI был связан с более высокой частотой повторения^14,15. Однако изолируя КСГМГ и изучая бактерии в них оказалось технически сложным из-за их редкости; Предполагается, что зараженные мышиных пузыря, как правило, только имеет 10-100 КСГМГ¹⁶. Кроме того, эпителиальные клетки мочевого пузыря являются относительно большие (50-120 мкм)¹⁷, что делает его сложным для развертывания флуоресценции помощь клеток сортируя (FACS) учитывая, что типичный СУИМ сопла разработаны с диаметром 70 мкм или 100 мкм. Таким образом фильтрации до СУИМ во избежание засорения fluidics часто удаляются клетки, как большой, как эпителиальные клетки мочевого пузыря.

Наша лаборатория недавно описал общие и экономичный метод, чтобы изолировать редких инфицированных клеток от смесей, таких как царапины эпителиальные клетки мочевого пузыря¹⁸. Чтобы эффективно изолировать КСГМГ, мы использовали традиционные рот закупорить. Рот micropipetting — это метод, который уже давно используется для микроманипуляции одиночных клеток и эмбрионов для вниз по течению анализа^{19,20,21,,2223, 24 , 25}. традиционные рот закупорить больших объемов жидкости (в миллилитрах) часто являются причиной несчастных случаев лаборатории, и техника справедливо избегали большая часть научного сообщества за пределы традиционных эмбриологии и Одноячеистый приложений. Наш протокол вдохновлен одну ячейку версий этой техники^19,20, которые смягчения риска, предоставляя большой буфер (> 2 мл) воздуха между исследователем и образца, по сравнению с объем жидкости переданы (< 1 МКЛ). Этот метод также использует преимущества точного управления что рот micropipetting обеспечивает, который переводится на низкий конечный объем окружающих решения переданы и высокой чистоты изолированных клеток. Техника использует недорогие материалы (<$ 50) и таким образом должен быть реально внедрить в всех лабораториях.

Этот визуальный протокол описывает нашу IBC изоляции технику, предоставляя ссылку на помощь других исследователей, стремящихся повторить эту технику. Исследователь будет необходим доступ к флуоресцентный Микроскоп рассечения (или аналогичное оборудование), который может использоваться для визуализации отдельных эпителиальных клеток и флуоресцентные бактерий во время живых изображений, с открытой и доступной этап визуализации для micropipetting (см. Таблицу материалов для деталей Микроскоп используется, хотя другие эквивалентные инструмент модели также могут быть использованы). Хотя этот протокол будет сосредоточена на КСГМГ в мышиных модели UTI, аналогичные методы должны применяться изолировать зараженные клетки от клеточных суспензий в других моделях инфекции.

протокол

Все методы, описанные здесь животных обращения были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Сингапура генома институт и центр биологических ресурсов Агентства для науки, техники и научных исследований, Сингапур.

1. мышь инфекции

1. Подготовка стекла капилляров
   1. Лампа открытого пламени (горелка Бунзена или спиртовая горелка).
   2. Держите стакан капилляра с двумя руками, крепко сжимая обоих концах, а затем равномерно тепло в середине трубы, пока стекло идет мягкой. Вращайте капилляра осторожно взад и вперед вдоль своей оси для помощи в даже обогрева стекла.
   3. Удаление капиллярной стекла от источника тепла и немедленно тянуть руки врозь, сохраняя при этом сцепление на обоих концах трубки. Идеальный окончательный вытащил капилляра длиной 3-5 см длиннее, чем unpulled капиллярной обеспечить соответствующий внутренний диаметр изоляции одного пузыря эпителиальных клеток.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Трубы по-прежнему остается чрезвычайно горячей для определенного периода времени, так что выделить капилляр на поверхности тепла Сейф на несколько минут остыть, прежде чем перейти к следующему шагу.
   4. Проверить чтобы увидеть, если в середине стеклянные капиллярные стал короче (рис. 1А) и что интерьер трубки до сих пор пустотные (рис. 1Б). Для изоляции КСГМГ отверстие размером 200-400 мкм годн к употреблению.
   5. Возьмите один конец вытащил капилляра с одной рукой. Провести пару щипцы с другой стороны и использовать его, чтобы забрать вытащил стеклянный капилляр в самом узком месте. Убедитесь, что щипцы обладал с достаточной силой для захвата капилляра твердо без дробления его.
   6. Используйте быстрые вращательные движения по рукой, придерживая щипцы для прикрепления вытащил капилляров в самом узком месте для создания рот micropipetting капилляров.
      Примечание: С помощью пальцев, а не щипцов также является приемлемым, поскольку используется адекватной защиты от осколков стекла.
   7. Повторите шаги 1.1.2-1.1.6 по крайней мере 4 x больше производить достаточно запасных micropipetting капилляров и предоставляют широкий спектр диаметров для IBC изоляции. Если ожидается более чем одной группе инфекции, подготовьте 5 дополнительных micropipetting капилляров для каждой дополнительной инфекцией группы.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не забудьте выключить открытого пламени.
   8. Вытащил капилляров в 100 мм Петри и разоблачить блюдо для УФ-излучения на 30 минут, чтобы стерилизовать капилляров.
   9. Замените крышку на Петри блюдо после УФ стерилизации и хранить Петри с капилляров при комнатной температуре.
2. Подготовка катетеров до инфекции
   1. Подготовьте мочевыводящих катетеры для инфекции, как описано в Hung et al.⁸ и Коновер et al.²⁶ по крайней мере за один день до инфекции.
3. Подготовка флуоресцентный uropathogenic культуры е. coli
   1. Расти выбранного выражения Флюорофор uropathogenic бактериальный штамм согласно установленных протоколов.
      Примечание: Выбор напряжения и Флюорофор во многом зависит от Микроскоп и штаммы доступны в отдельных лабораториях. В этом примере мы используем штамм, производный от UTI89, которая является клинической изолировать родом из пациента с рецидивирующий цистит. Это штамм, SLC-638, осуществляет плазмида (Цоя-77), который выражает vsfGFP-9 и канамицин сопротивления¹⁸. SLC-638 выращивается в LB отвара при 37 ° C, с 50 мкг/мл канамицин.
   2. Полоска штамм SLC-638 на Бертани Лурия (LB)-агар плита с 50 мкг/мл канамицин. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
   3. (Необязательно) Вид плиты рассечения микроскопа для подтверждения выражение флуоресцентные маркеры перед выбором колонии.
   4. С помощью цикла бактериальной прививка, выбранные колонии передать 125 мл конические флакон с 10 мл LB отвара дополнена 50 мкг/мл канамицин. Инкубируйте колбу статически при 37 ° C в течение 24 ч.
   5. Субкультура бактерии от этой колбе, приняв 10 мкл культуры из колбы и разбавления 10 мл LB отвара дополнена 50 мкг/мл канамицин в свежий 125 мл флакон (разбавления 1: 1000). Инкубируйте этот второй колбе статически при 37 ° C для еще 24 часа.
   6. Уменьшается бактериальной культуры за 5 мин на 5000 x g и 4 ° C.
   7. Декант супернатант и Ресуспензируйте бактериальных Пелле в холодной PBS на₆₀₀ ОД 0.5.
      Примечание: Хотя это может варьироваться от культуры к культуре, обычно 1 мл статической культуры дает около 4-5 мл ОД₆₀₀ = 0.5 бактериальной культуры. Общий объем бактериальной посевным материалом, необходимые для каждого штамма можно рассчитать следующим образом: для каждой мыши требуется 50 мкл и 50 мкл необходима для заполнения головку иглы. Еще 10-20% (минимум 50 мкл) по посевным материалом рекомендуется для учета мертвого объема в шприц.
   8. Используйте остальные бактериальных смесь для определения титра инфекции, как описано в Hung et al.⁸.
      Примечание: Этот шаг может быть отложено на несколько часов, сохраняя бактериальных смесь при 4 ° C.
4. Мышиных модель инфекции мочевыводящих путей
   1. Заразить мышей, как описано в⁸Hung et al., с одной экспериментальной группе для каждого штамма флуоресцентные кишечной палочки, культивируемых в разделе 1.3.
      Примечание: Также см. Коновер et al.²⁶ для визуального помощь.
   2. Обратите внимание на время бактериальной прививка для мыши или клетку.
   3. Повторите инфекций для всей экспериментальной группы.
      Примечание: Катетер инфекции могут быть повторно использованы для всех мышей в той же группе.
   4. Повторите шаги 1.4.1-1.4.3 для каждой экспериментальной группы планируется, обеспечивая, что свежий катетера и новые смазочные гель готовится для каждой группы.
      Примечание: Для экспериментов с большим количеством животных лучше всего разделить животных на группы по пять и ошеломляющий инфекции, таким образом, чтобы каждая группа инфицированных около 30 мин до 1 часа друг от друга. Это даст достаточно времени для следующих шагов (разделы 2 и 3).

2. мочевого пузыря эпителиальных клеток, заготовки для получения суспензии клеток

1. Заготовка и инвертирование мышиных пузыри
   1. Подготовьте три 50 мл конические трубы заполнены с 45 мл 70% этанола для стерилизации хирургическое оборудование.
   2. В двух из труб, подготовленную на этапе 2.1.1 место ножницами и пара щипцы каждый. Место две пары щипцов (один предпочтительно более узкий и с закругленными подсказка для инверсии мочевого пузыря) в третьем трубку.
      Примечание: Инструменты в первой трубе будет использоваться на внешней области, средствах работы в второй будет использоваться в уборке мочевого пузыря, и две пары щипцами в завещании труба используется в инверсии мочевого пузыря.
   3. В 6 ч после инфекции, усыпить зараженных мышей, в соответствии с установленными протоколами IACUC учреждения.
      Примечание: Наш протокол IACUC требует эвтаназии через шейки матки дислокации, в то время как указатель мыши находится под наркозом (изофлюрановая).
   4. Положите животных плашмя на спину и использовать спрей бутылку с 70% этанол стерилизовать их брюшной области.
   5. Используя пару щипцы и Ножницы хирургические из первой трубки (подготовленных на шаге 2.1.2), открытие сделать небольшой поперечный разрез на кожу около 1 см выше уретры. Разверните разрез по диагонали к верхних конечностей мыши, создавая V-образный разрез вдоль всей передней мыши, предоставляющий содержимое брюшины. Убедитесь, что в ходе этого процесса, ножницы не прорваться через кишечник мыши (рис. 2, Б).
   6. Переключиться на второй набор инструментов (подготовленных на шаге 2.1.2). С помощью лезвия ножниц или валы щипцы, осторожно надавите на жировых отложений вблизи области таза мыши.
      Примечание: Этот шаг вызывает мочевого пузыря выступают наружу и обеспечивает видимость для уборки.
   7. Захват выставленных мочевого пузыря на вершине с парой щипцов (рис. 2C).
   8. Держать крепко на вершине мочевого пузыря с щипцами, вырезать и свободной мочевого пузыря от остальной части животного (убирания мочеточников и уретры) используя Ножницы хирургические. Релиз не щипцов, удерживая пузыря еще.
   9. Переход от ножницы узкие округлые щипцы от третьего конические пробки (из шага 2.1.2), вставьте кончик одного вала округлые щипцами в отверстие мочевого пузыря, где он был просто вырезать на предыдущем шаге (Рисунок 2D). С кончика округлые щипцы, надежно вставлен в отверстие мочевого пузыря выпуск пара щипцы, сжимая Апекс мочевого пузыря и вернуть его второй Конические трубки.
   10. Используя второй пары щипцов из третьего трубки, осторожно поверните мочевого пузыря «наизнанку», впервые потянув за пределами конца устья мочевого пузыря от закругленными щипцы (Рисунок 2D, стрелка 1) и направляя его вокруг и над другими кончик округлые щипцы (Рисунок 2D, стрелка 2).
       Примечание: Действие может быть приравнено к удаление носок от одной ногой и потянув его над другим.
       1. Во время процесса инверсии поддерживать первый округлые пара щипцы почти полностью закрыт. Это обеспечивает достаточно свободы передвижения стащить мочевого пузыря от первого вала округлые пинцет, но также приносит второй вал округлые щипцы ближе к первой и мочевого пузыря легко передаваться. Конечным результатом этого шага является, что мочевого пузыря следует закончить вверх быть обращено и на кончике второй вал первой пары щипцов (2 рисунокE).
       2. Используя второй пары щипцов, аккуратно задобрить Перевернутый мочевого пузыря от оконечности щипцы в 1 мл холодного PBS.
          Примечание: (Необязательно) Это подходящее время принять изображения всего перевернутый, зараженных пузыря соблюдать общую частоту и распределение КСГМГ, если таковые имеются.
   11. Повторите шаги 2.1.1-2.1.10 для каждого пузыря в экспериментальной группе (для максимум пяти животных).
2. Пузыря эпителиальных клеток соскоб
   1. С помощью двух чистый пар щипцов, осторожно очистите снаружи Перевернутый мочевого пузыря (который является эпителиальных клеток внутреннего слоя). Окружающие PBS должен появиться туманнее как соскабливания доходов и эпителиальные клетки попадают в раствор PBS.
   2. (Необязательно) Визуально подтвердите, что соскоб мочевого пузыря выпустила клетки в решение с использованием рассечения микроскопа. Рисунок 3 A, B). PBS должна появиться облачно невооруженным глазом, и царапины отдельных пузыря эпителиальные клетки можно увидеть при 10-кратном.
   3. Повторите шаги 2.2.1-2.2.2 для каждого собранного мочевого пузыря от шаг 2.1.

3. внутриклеточных бактериальных сообщества (IBC) изоляции: рот закупорить КСГМГ

Примечание: Все методы, описанные в этом разделе прошли оценку институциональных рисков. Рот закупорить несет в себе неотъемлемую опасность проглатывания раствора, которое передается. Этот риск снижается во многом nanoliter томов, которые использует этот протокол, и мы рекомендуем всех пользователей протокола оплаты прислушаться к осторожности и отмечает практику, перечисленных здесь и в ходе обсуждения.

1. После клетки были царапины в PBS, настроить аппарат micropipetting рот (рис. 3C).
   1. Вставьте конец толще вытащил стеклянный капилляр (unpulled конец) в резиновой заглушкой (белый конец) Аспиратор трубки.
   2. Вставьте узкий конец наконечник пипетки 1 мл в другие открытые (красный) конец Аспиратор трубки, обеспечивая плотное прилегание.
   3. Вставьте узкий конец 2 мл, аспирационных пипетку в открытой, более широкий конец кончика пипетки 1 мл, опять таки гарантируя, что существует жесткой подходят.
      Примечание: Результате установки позволяет рот пипеткой исследователь от широкого, открытого конца аспирационных пипетку для создания нежный силу всасывания из узкий конец капиллярной трубки на другом конце аппарата.
   4. Протестируйте аппарат micropipetting окончательный рот, используя чашку Петри 100 мм, содержащий свежие деионизированной воды. Незначительные всасывающего действия на открытом конце аспирационных пипеткой (аналогично потягивая напиток через соломинку) следует увеличить уровень жидкости в капилляр, но не вызывают деионизованной воды переполнения в трубу Аспиратор. Использование одной рукой для управления капиллярной трубки, при использовании с другой стороны, чтобы отрегулировать положение Петри.
      Примечание: Сила всасывания, необходимых для рта дозирование единого IBC будет варьироваться среди исследователей. Однако рекомендуется каждый исследователь, попытки этот метод начать с слабой всасывания и постепенно увеличивать его, если никакая жидкость течет вверх капилляра. Нет необходимости для сил больше, чем сосать соломы для питья. Если капилляра, как представляется, не поднимая жидкости в ходе испытания на шаге 3.1.4, вполне возможно, что капилляр или всасывающие трубки будет закрыта и нуждается в замене. Далее рекомендуется, что все новые исследователи первой практике контроля всасывания в рот дозирования аппарат с помощью стерилизации воды. Кроме того, обратите внимание, что контроль объема принятых рот дозирования аппарат с помощью исследователя языка. Язык можно тонко регулировать силу всасывания применяется, а также выступать в качестве экстренной остановки.
   5. После достижения успешного поглощения жидкости, проверьте возможность изгнать его из капилляра, осторожно дуть в открытый конец аспирационных пипеткой. Убедитесь, что нет пузырьков создаются в процессе высылки жидкости для предотвращения загрязнения КСГМГ во время шага 3.5.
      Примечание: Как с всасывания, сила позитивного давления исследователем высылать КСГМГ в пластиковых пробирок будет варьироваться среди исследователей. Рекомендуется для исследователей новой настоящего Протокола на практике шаг 3.1 за несколько дней до фактического инфекции. Одно из предложений для практикующих рот micropipetting является практика передачи небольших объемов стерилизации воды, смешанной с несколькими каплями пищевой краситель (для видимости) с помощью аппарата микропипеткой рот.
2. Место суспензию царапины клеток под микроскопом рассечения и определения КСГМГ как большой флуоресцентный агрегатов (рис. 3A, B). Идеальный диапазон увеличение составляет 20-40 x. Окунуть прекрасный конец стеклянный капилляр в свежий трубки PBS для 1 s для уменьшения поглощения нежелательных тома через капилляр действий.
3. Глядя в Микроскоп, определение МДС интерес и медленно довести открытый конец капиллярной трубки к КСГМГ. Используйте прекрасный конец стеклянный капилляр чтобы вымести дополнительные клетки рядом каждый КСГМГ для предотвращения стремление две или более ячеек, или разорвать помимо крупных агрегатов клеток.
4. Хотя глядя через микроскоп, прикладывайте очень небольшой силы всасывания на дальнем конце (забирающие пипеткой) рот micropipetting аппарата для КСГМГ в стеклянный капилляр.
5. После собирание КСГМГ, переместить капилляра в пустой 1,5 мл пластиковых пробирок и применить небольшое положительное давление высылать капли и КСГМГ в центрифуге трубку (рис. 3D).
6. Повторите шаги 3,3-3,6 на необходимости многие КСГМГ из текущей мочевого пузыря, прежде чем перейти к следующему мочевого пузыря. Измените аспирационных пипетки и капилляров часто, чтобы предотвратить накопление слюны.
   ОСТОРОЖНОСТЬЮ: При работе с инфекционные (или клинические) штаммов бактерий, постоянно контролировать уровень раствора в капилляр. Не позволяйте уровня жидкости, будучи накапаны переполнение от края капилляров в трубу Аспиратор. Если это происходит, немедленно переключиться на другой Аспиратор трубку и отменить предыдущий набор вверх.
7. Повторите шаги 3.2-3.6 на всех собранных пузыри, или до тех пор, пока достаточное количество биологических образцов были собраны для экспериментальной группы.
8. (Необязательно) Повторите шаги, 3,6 и 3,7 до тех пор, пока все экспериментальной группы (или мышей) были умерщвлены и достаточно биологических образцов собрали из каждой группы.

Результаты

Помимо подтверждения (рис. 3D) присутствие одной изолированной IBC в коллекции трубку через рассечения микроскопа чистоту изолированных IBC также могут быть подтверждены confocal микроскопии. Как показано на рис. 4A, изолированные клетки должны пятно для е. coli и uroplakin и ожидаемый размер для КСГМГ (50-120 мкм)¹⁷. Кроме того E. coli окрашивание не присутствует в окружающей жидкости. Основываясь на наших данных, более чем 90% клеток, изолированные с этой техникой, КСГМГ¹⁸. После изоляции присутствие и жизнеспособность бактериальных клеток в отдельных IBC может быть подтверждена через колонии, формируя блок (CFU) перечисления (Рисунок 4B) или количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) для геномной эквиваленты ( Рисунок 4 C). рис. 4C также показывает, что неинфицированных клеток эпителия, изолированные с тот же протокол не поддающихся количественной оценке количества бактерий. Основываясь на этих данных, мы оцениваем, что диапазон CFUs в одном МКБ-10²-10³ в мышиных модели инфекции мочевыводящих путей. Одна из главных целей одного IBC изоляции является анализ течению например РНК последовательности. Чтобы убедиться, что наш метод изоляции является возможность получить РНК от бактерий в КСГМГ для анализа, мы провели Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) количественная оценка трех генов (16S, cyoB и frdA) для спектр индивидуально изолированных и обобщённые КСГМГ (рис. 4D). Все данные, показанный на рисунке 4 была адаптирована с разрешения Дурайсвами et al.¹⁸. Обзор схемы нашей IBC изоляции протокола можно увидеть в рисунке 5, который воспроизводится Дурайсвами et al.¹⁸.

Рисунок 1 : Вытащил руку капилляров сохраняют узкие отверстия. (A) образцы вытащил руку капиллярных трубок отображаются на черном фоне для контраста. От дна к верхней, unpulled капилляров, капиллярные, который не был разобран в достаточной степени показаны капилляров, который может использоваться для уборки единого пузыря эпителиальных клеток и капилляров, вытащенных слишком тонкий (и таким образом разделенных на две части). Правитель 15 см помещается в нижней части изображения для масштаба. Предположительная точка для привязки от используемых капиллярное обозначается красной стрелкой на рисунке. (B) изображение взято с микроскопом рассечения, подтверждающие полые внутренний диаметр вытащил капиллярные (внизу). Unpulled капиллярной позиционируется выше продемонстрировать относительного размера разницы двух капилляров. Шкалы бар = 4,0 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Рассечение мыши урожая мочевого пузыря эпителиальных клеток. (A) изображение мыши с белыми линиями, добавил сообщить ориентировочное местоположение и угол разреза подвергать мышиных брюшной полости и мочевого пузыря. (B) изображение подвергается мыши брюшной полости после разреза. (C) изображение подвергается мочевого пузыря (красная стрелка) выступающие между жировых отложений. (D) изображение мышиных мочевого пузыря с наконечником щипцы, вставляется в Люмене, со стрелками, чтобы указать направление движения необходимо инвертировать мочевого пузыря. Мочевого пузыря сначала извлекается слегка наружу, затем вокруг и первый вал щипцы. Направления движения для обоих этих действий являются как обозначается белыми стрелками, №№ 1 и 2. (E) изображения показаны окончательную позицию Перевернутый мочевого пузыря, вставить второй вал щипцы. Валы щипцы помечены в обеих панелей D и E с текстом и красными стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : IBC заготовки из мочевого пузыря клеток. (A) зараженных и инвертированных пузыря в холодных PBS раствор перед соскоб клеток. (B) изображения показаны царапины клетки мочевого пузыря как увидеть под микроскопом. КСГМГ могут быть определены как большой Зеленый флуоресцентный агрегатов в оба изображения (см. Красные стрелки). (C) изображение завершившегося рот micropipetting аппарат. Аспирационных пипетки, наконечник пипетки, аспиратор трубки и вытащил капиллярной трубки отождествляются с пронумерованные стрелки, как указано на право. (D) изображение одной изолированной IBC в коллекции 1,5 мл трубки (изложенные в красном). Масштаб баров (как указано) представлены белые линии в группах A, B и D. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Собранный КСГМГ чистой и может использоваться для анализа течению. Эта цифра была изменена с разрешения Дурайсвами et al¹⁸. (A) образы двух изолированных GFP-положительных клеток, которые были окрашены с анти uroplakin и анти -E.coli антител. Первая ячейка (IBC 1) имеет изображения отдельных каналов (при низкой увеличение) на левой стороне, и объединенное изображение высокого увеличения находится на правой. Во второй ячейке (IBC 2) показано в большим увеличением в Объединенные и отдельные каналы. Масштаб адвокатские сословия, как указано. ДНК витражи с 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и представлены в канале синего. Анти -E. coli запачкается с вторичное антитело проспряганное флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) и представлены в зелёном канале. Анти uroplakin запачкается с вторичное антитело проспряганное тетраметилродамина Изотиоцианаты (TRITC) и представляют в красный канал. (B) бактериального CFUs от изолированных КСГМГ. КСГМГ были обработаны немедленно, или инкубировали в 0,1% тритон-X для 10 или 30 мин пуле CFU количество отдельных КСГМГ изолированы от n = 3 показаны отдельные эксперименты. Предел обнаружения = 0,7 журнала₁₀ CFUs/IBC. Красные точки нанесены на пределе обнаружения указывают образцов, для которых нет колонии были восстановлены. Все образцы, содержащие IBC не значительно отличаются (p > 0,05, тест Манна-Уитни); неинфицированным эпителиальные клетки значительно отличаются от данных МКБ (10 мин) (p < 0,001, тест Манна-Уитни). (C) количественной ПЦР бактерий на отдельные КСГМГ и неинфицированных клеток эпителия после 10 минут инкубации в 0,1% тритон-X (*, p < 0,0001, тест Манна-Уитни, n = 4). Предел обнаружения = 1,18 журнала₁₀ бактериальный геном эквиваленты/IBC. Красные точки обозначают образцов, для которых нет колонии были восстановлены на titering в группы B. (D) количественная оценка 16S рРНК, cyoB и frdA генов для различное количество индивидуально изолированных и обобщённые КСГМГ (n = 1 эксперимент; каждый точка указывает среднее 3 технических реплицирует). NC = отрицательный контроль не ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Схема и ее связанные фотографии, представляющие изоляции КСГМГ через рот micropipetting от инфицированных мышей пузыри. Эта цифра воспроизводится Дурайсвами et al.¹⁸. (A) A собирают весь мочевого пузыря; (B) Перевернутый весь мочевого пузыря, подвергая GFP, выражая КСГМГ; (C) крупным планом края царапины мочевого пузыря, показаны отдельные КСГМГ в виде суспензии в прилегающих буфер; (D) единый изолированный IBC, накапаны в трубку. Красные стрелки на панели B показывают примеры GFP-позитивных КСГМГ на поверхности Люминал мочевого пузыря. Красная пунктирная линия в группе C указывает правую границу Перевернутый мочевого пузыря (указывается как «BL»); красные стрелки на панели C указывают явно отдельных GFP-позитивных эпителиальные клетки, которые были соскрести поверхности мочевого пузыря. Белой пунктирной линией в группе D указывает micropipetted суб микролитр капли, содержащие изолированных КСГМГ, который обозначен белой стрелкой. Масштаб баров = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Протокол, который мы описали позволяет для изоляции одного КСГМГ из мышиных модели ИМП. Этот протокол изолирует КСГМГ, содержащие жизнеспособные внутриклеточных бактерий, которые могут быть проверены путем культивирования для ГРУ. Протокол результаты внутриклеточных бактерий от КСГМГ с мало загрязнения внеклеточного бактериями, позволяя для дальнейшей характеризации обоих бактерий и принимающей ячейки от IBC (рис. 4C). Мы также показывают, что бактерии из одного IBC может использоваться в нисходящие приложения, например ПЦР (рис. 4C), предполагая, что наша техника может использоваться для процесса КСГМГ для других в пробирке анализов. Объединив бактерий, добываемых из всего лишь 5 КСГМГ, мы еще больше продемонстрировать нашу способность выполнить qRT ПЦР-анализа на три бактериальных генов, предполагая, что хорошее качество РНК могут быть собраны из бактерий в наших изолированных КСГМГ (рис. 4D). Комбинированные, которую мы показали данные указывают, что анализ генома общесистемной РНК (например, РНК последовательности) на одном КСГМГ может быть возможно с помощью этой техники изоляции.

В этом протоколе мы сосредоточились на момент времени 6 h, потому что, когда IBC номера пик в пузырях черный 6 мышей, инфицированных UTI89²⁷. Кроме того мы также использовали систему статический бактериальной культуры для повышения уровня экспрессии pilus типа 1 в UTI89. Выражение типа 1 pilus имеет решающее значение для кишечной палочки для присоединения к и инфицировать эпителиальные клетки мочевого пузыря²⁸. Однако это выражение является жестко регулируемых²⁹ и экологические сигналы, как известно, изменить его³⁰. Чтобы поддерживать последовательную инфекции фенотипа и достаточного количества КСГМГ, мы рекомендуем использовать статические бактериальной культуры 2 x 24 h (слегка изменен Hung et al.⁸) и 6 h инфекции момент при работе с ранее протестированных E. coli штаммов, таких как NU14 и UTI89^28,29. Однако вполне возможно, что эти переменные нужно будет корректироваться в другие штаммы UTI или другие штаммы мышей, чтобы получить идеальное количество КСГМГ от каждой инфекции.

Хотя протокол от Hung et al.⁸ использует только самок мышей, другие установленные протоколы для создания инфекции мочевыводящих путей у мышей-самцов были сообщил³¹. В этой модели цистит у мышей-самцов также следовать пути IBC. Как пузыри мужские и женские мышей имеют одинаковый размер, мы ожидаем, что наш Протокол изоляции IBC может использоваться на зараженных мышей-самцов также.

Относительно простой технологии, используемые в настоящем Протоколе также гарантирует, что он может быть развернут в большинстве лабораторий. Одним из ключевых шагов, участвующих в настоящем Протоколе является потянув из стеклянных капилляров для создания microcapillaries для выбора ячейки типа интереса. Этот шаг позволяет гибкость в диаметры microcapillaries создан, и таким образом метод может быть расширен для нескольких различных целевых типов клеток. Однако из-за присущего различия в создании этих капилляров, должны быть осторожность для обеспечения того, чтобы окончательный диаметр используемого диапазона. Если капилляры являются слишком узкими, они не могут подобрать клетки интереса, но если они являются слишком широкими, несколько ячеек может быть выбран в одной попытки. Кроме того использование открытого пламени во время процесса капиллярного потянув носит имманентный риск ожогов и огня, поэтому исследователь, пытаясь создать microcapillaries должны заботиться, чтобы предотвратить появление таких событий. Чтобы снизить изменчивость, а также открытые пожароопасных участвует в принятии этих капилляров, исследователь может сделать использование традиционных микропипеткой, потянув машины, такие как те, которые используются для электрофизиологических экспериментов (например, PC-100, Narishige группы). Как сделать эти машины использовать тяжести или роботизированной платформы, чтобы вытащить капилляров, они могут быть приспособлены для удовлетворения потребностей в модели инфекции. Однако широкий спектр микропипеткой, потянув машин будет означать, что индивидуальный исследователь нужно будет пройти через несколько проб и ошибок, чтобы определить соответствующий окончательный диаметр капилляра для использования с настоящим Протоколом.

Представленные протокол использует бактерий, выражая флуоресцентные метки для визуально определить КСГМГ. Таким образом эта техника ограничивается способность исследователей генетически модифицировать инфекционными организма. Специально для УПЭК формирования IBC штаммов, таких как CFT073 и NU14 были успешно преобразованы с GFP-выражая плазмид^32,,3334; Поэтому их следует использовать в тот же протокол. Основываясь на область мочевого пузыря (70 мм²) мыши³⁵, длина отдельных эпителиальных клеток (50-120 мкм)¹⁷и частота КСГМГ в одном пузыря¹⁶, консервативная оценка для случаев КСГМГ идет о 1 в 1000 клетки (или 0,1%). Эта оценка демонстрирует полезность наших клеток Протокол изоляции для редких событий. Точность клеточной селекции через наш протокол и широкий круг диаметром капилляров, которые могут быть выведены предполагают, что этот протокол может использоваться для изоляции внутриклеточных бактерий от других моделей в vivo и in vitro инфекции. Действительно мы успешно использовали этот метод для изоляции инфицированных искусственного мочевого пузыря эпителиальных клеток (данные не показаны).

Одним из наиболее технически сложных шагов в протоколе инверсия мочевого пузыря подвергать эпителиальных клеток для соскабливания. Мы нашли, что это также можно сделать надрез на пузырь, чтобы скошенный его для соскабливания. Однако следует позаботиться о том, чтобы уменьшить ущерб в эпителиальные клетки мочевого пузыря во время процесса резки открытым; в идеале разрубом один должны использоваться для скошенный открытым мочевого пузыря. Кроме того в холодной PBS, для предотвращения случайной потери клеток или тканей мочевого пузыря во время процесса следует сократить.

Рот закупорить КСГМГ в этот протокол обеспечивает больший контроль над процесс отбора клеток, а также ограничение окончательный объем раствора, передаваемых вместе с ячейки. Точное управление и большие разделение решения от исследователей рот также увеличивает безопасность исследователя, как тома переданы находятся в пределах nanoliter микролитр диапазон. Напротив наш опыт работы с современной микропипеткой является, что она стремится передавать больше окружающих жидкости и клетки с IBC, потенциально ведет к загрязнению с внеклеточного Люминал бактерий. Наш вывод, что рот закупорить обеспечивает более высокую производительность над другими одну ячейку методы изоляции сообщалось также в других лабораториях по^22,23,24. Помимо изоляции одной ячейки закупорить рот даже были использованы в одноклеточных электропорации для нейронов²⁵, который также демонстрирует утилита и минуту управления, обученный исследователь может достичь с техникой. Однако, безопасность имеет первостепенное значение, и мы предлагаем потенциальных дополнительных мер, которые могут быть приняты в зависимости от используемого патогенов: (i) расширение буфера воздуха между исследователем и биологический материал, например с помощью аспирационных Пипетка с большего объема (например, 5 мл), или (ii) добавить физический фильтр как вата в аспирационных пипеткой выступать дополнительным барьером.

В тех случаях, когда оценки риска приводит к выводу, что рот закупорить все еще слишком рискованным коммерчески доступных роботизированной установок (например, те, которые используются для nanoinjections) могут быть объединены с другими разделами нашего технику, чтобы обеспечить безопасный метод для изоляция инфицированных клеток со смешанным населением. Следует отметить, что наш опыт с использованием роботизированной микроманипулятор продемонстрировал снижение ставки IBC изоляции, по сравнению с рот закупорить, как большой внутри экспериментальной отклонения в размерах мочевого пузыря эпителиальных клеток делает его сложным для пользователя Роботизированная рука для определения силы обязаны забрать один КСГМГ. Тем не менее он по-прежнему жизнеспособной, хотя и дороже, вариант для тех, кто работает с высоко возбудителей заболеваний.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube			For static bacterial culture and OD measurement
100% ethanol			For Alcohol Burner
15 mL conical tube			For static bacterial culture and OD measurement
1 mL Tuberculin Syringe	BD Biosciences	302100
3% Bacterial Agar			For static bacterial culture and OD measurement
70% ethanol			For static bacterial culture and OD measurement
Aesculap anatomic forceps	Braun/Kruuse	BD222R	For initial dissection of mouse (skin, fascia)
Alcohol Burner	Wheaton	237070
Aspirating pipette	BD Biosciences	357558
Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177
Bacterial loops			For static bacterial culture and OD measurement
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5424	Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes
Conical flasks			For static bacterial culture and OD measurement
Digital camera for microscope	Olympus	DP71	For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Glass Capillaries	Kimax	6148K07
Iris Scissors STR SS 110MM	Braun	BC110R
Isoflurane (Isothesia)	Henry Schein Animal Health	29405
Kanamycin Sulfate	Calbiochem	420311	For static bacterial culture and OD measurement
LB broth (Miller)	Thermo/Gibco	10855021	For static bacterial culture and OD measurement
Light source unit for microscope	Olympus	LG-PS2	For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Lubricant	KY		Any similar commercial medical lubricant will suffice
Macro fluorescence microscope	Olympus	MVX10	For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Micropipette + micropipette tips			For static bacterial culture and OD measurement
PBS 1x			For static bacterial culture and OD measurement
Pipette controller + Pipettes			For static bacterial culture and OD measurement
Polyethylene Tubing	BD Intramedic	427401
Precision Glide needle 30 G	BD Biosciences	305107	Possibly under new catalogue number (305106)
Splinter forceps curved	Braun	BD312R
Spray bottle (for ethanol)			For static bacterial culture and OD measurement
Square cuvettes	Elkay	127-1010-400	For static bacterial culture and OD measurement
Sterilgard III Advance Safety Cabinet	Baker	SG403	Any biosafety cabinet with a UV irridiator
Sterilin 90mm Standard Petri Dish	Thermo	101VR20	Any sterile petri dish
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm	Braun	OK366R	Recommended for harvesting of bladder
Surgical Scissors STR S/B 105MM	Braun	BC320R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	5810R	Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals
WPA C08000 cell density meter	Biowave (Biochrom)	80-3000-45	For static bacterial culture and OD measurement