Мониторинг выживаемость нейронов через продольные флуоресцентной микроскопии

Здесь мы представляем протокол для отслеживания выживания на основе одной ячейки и определения переменных, которые значительно предсказать смерть клетки.

Аннотация

Стандартные цитотоксичность анализов, которые требуют сбора лизатов или фиксированные ячейки в нескольких точках времени, имеют ограниченный чувствительность и способность оценить факторы, которые влияют нейрональных судьбы. Эти анализы требуют наблюдения за отдельные популяции клеток в точках дискретного времени. В результате отдельные клетки не могут следовать проспективно со временем, серьезно ограничивая способность различать ли субцеллюлярные события, такие как формирование puncta или белка mislocalization, патогенных драйвера болезни, гомеостатических реакций, или просто случайными явлениями. Одноклеточных продольной микроскопии преодолевает эти ограничения, позволяя исследователя определить различия в выживаемости между населением и привлечь причинно-следственной связи с повышенной чувствительностью. Это видео руководство будет изложить представитель рабочего процесса для экспериментов, измерения одноклеточных выживания крыса первичной корковых нейронов, выражая флуоресцентного белка маркера. Зритель будет узнать, как добиться высокой эффективности transfections, собирать и обрабатывать изображения, включение перспективных отслеживания отдельных ячеек и сравнить относительную выживания нейрональных популяций, с помощью анализа пропорционально опасности Кокс.

Введение

Клеточная атипия смерть является движущим фактором во многих заболеваний, включая рак, нейродегенеративные и ход¹. Надежные и чувствительные анализы для смерти клетки важны для характеристики этих расстройств, а также разработки терапевтических стратегий для расширения или сокращения сотовой выживания. В настоящее время есть множество методов для измерения смерти клетки, либо непосредственно, либо через суррогатные маркеры². Например смерть клетки можно оценить визуально с помощью жизненно красителей, которые выборочно пятно³живых или мертвых клеток, или путем наблюдения за внешний вид конкретных фосфолипидов на плазматической мембраны⁴^,⁵^,⁶. Измерения внутриклеточных компонентов или сотовых метаболитов, выпущенный в СМИ после клеточного распада также может использоваться как прокси для клеток смерть⁷^,⁸. В качестве альтернативы клеточной жизнеспособности могут быть аппроксимированы оценки метаболической активности⁹^,¹⁰. Хотя эти методы обеспечивают быстрое средства оценки выживаемость клеток, они не являются без оговорок. Каждый метод отмечает культуры как одной популяции, делает невозможным провести различие между отдельными клетками и их уникальные показатели выживания. Кроме того такие анализы на основе населения не в состоянии оценить факторы, которые могут быть важными для смерти клетки, в том числе клеточной морфологии, выражение протеина или локализации. Во многих случаях эти анализы ограничены точек дискретного времени и не позволяют для непрерывного наблюдения клеток с течением времени.

В отличие от продольных флуоресцентной микроскопии является весьма гибкой методологии, которая непосредственно и постоянно следит за риск смерти на основе одной ячейки¹¹. Короче говоря продольные флуоресцентной микроскопии позволяет тысячи отдельных ячеек, чтобы быть отслежены на регулярной основе для длительных периодов времени, позволяя точные определения гибель клеток и факторов, которые расширения или подавить смерти клетки. На его базе метод предполагает переходных трансфекции или трансдукции клеток с векторами, кодирование флуоресцентных белков. Затем устанавливается уникальный доверенным лицом, и положение каждой transfected клеток по отношению к этот ориентир позволяет пользователю изображения и отслеживать отдельные ячейки в течение часов, дней или недель. Когда эти изображения просматриваются последовательно, гибель клеток характеризуется характерные изменения флюоресценции, морфология и фрагментации клетки тела, позволяя назначение времени смерти для каждой ячейки. Расчетный уровень смертности, определяется функцией опасности, можно затем количественном сравнении между условиями, или связанных с выбора сотовой характеристик с помощью одномерных или многовариантный Кокс пропорционально опасности анализ¹². Вместе эти подходы позволяют точной и объективной дискриминации ставок клеточной смерти среди клеточных популяций, и определения переменных, которые значительно предсказать смерть клетки или выживания (рис. 1).

Хотя этот метод может использоваться для наблюдения за выживание в любой тип клеток после митотическая в различных покрытий форматов, этот протокол будет описывать условия для transfecting и визуализации крыса корковых нейронов, культивируемых в 96-луночных пластине.

протокол

Все позвоночных животных работы был одобрен Комитетом по использованию и уходу за животных в университете штата Мичиган (протокол # PRO00007096). Эксперименты, тщательно планируется свести к минимуму количество животных в жертву. Беременных женщин одичал тип (WT), не трансгенных крыс длинные Эванс (Rattus Омар) поодиночке размещаются в камерах с экологическими обогащения и позабочено для группой для лабораторных животных медицины (УЛАМ) в университете штата Мичиган, в в соответствии с руководством NIH-поддерживается для ухода и использования лабораторных животных. Все крысы хранились в рутину, жилье для мало времени, как возможно до эвтаназии, в соответствии с рекомендациями руководящих принципов по эвтаназии американской ветеринарной медицинской ассоциации и Мичиганский университет методов эвтаназии Виды руководящих принципов.

1. Подготовка

Вскрыть корковых нейронов из эмбриональных день 19 – 20 детенышей крыса и культуры крыса корковых нейронов в 0,5 х 10⁶ клеток на миллилитр на поли D-лизин пластины с покрытием для 4 дней в пробирке, как описано ранее¹³^,¹⁴^, ¹⁵^,¹⁶^,^,¹⁷¹⁸^,¹⁹.
Подготовьте плазмидной ДНК интерес после описанные бесплатно эндотоксина плазмида ДНК изоляции комплект (см. Таблицу материалы). Количественно результирующая ДНК, используя спектрофотометр.
В пробирке день аликвота, фильтр 4 (DIV4), стерилизации, и инкубировать следующие средства массовой информации на 37 ° C: 6 мл и сокращение сыворотке СМИ (RSM, например., OptiMEM), 25 мл нейронов базальной СМИ (НБМ), 40 мл NBKY (НБМ + 1 мм Кинуреновая кислота + 10 мм MgCl₂, скорректирована с рН 7. 4), 10 мл NBC (НБМ + 1 x нейрональные клетки культуры дополнение + 1 x L-глютамин добавки + 1 х перо Strep).
Примечание: Тома в списке достаточно для transfecting одну плиту 96-луночных. Обратитесь к Таблице материалы для определенных реагентов.

2. transfection корковых нейронов крысы

Изменить предоставленный Пример трансфекции листа (см. дополнительный файл 1), регулируя тип пластины, пластины карта, количество ДНК, концентрации ДНК и количество скважин (зеленые квадратики).
Примечание: Общая ДНК суммы до 0,2 мкг на хорошо, независимо от ли один (например,., А ДНК) или несколько (например, ДНК B и C) ДНК конструкции добавляются к каждой скважины.
Рабочие из электронной таблицы, сочетают в себе соответствующее количество RSM и ДНК в одной из труб. Объединить соответствующее количество RSM и трансфекции реагент (например, Lipofectamine) в отдельном трубку.
Инкубации при комнатной температуре (RT) за 5 мин.
Объединить ДНК и трансфекции RSM смеси реагентов и Инкубируйте на RT на 20 мин.
На этом этапе инкубации, использовать многоканальные пипетки и стерильных пластиковых желоба для мытья клетки 2 x с 100 мкл на хорошо НБМ. Зарезервировать кондиционером СМИ (CM) и хранить при температуре 37 ° C. Для этого и следующие шаги Позаботьтесь, чтобы свести к минимуму количество времени, которое нейронов подвергаются воздействию воздуха.
Извлеките носитель НБМ и заменить 100 мкл на хорошо NBKY.
После 20 минут прошло, добавьте 50 мкл Реагента/ДНК смесь transfection каплям каждой скважины.
Инкубировать клетки с трансфекции реагент/ДНК комплексы для 20 минут при 37 ° C.
Промыть 2 x с NBKY и замените µL 100 см и 100 мкл NBC в колодец.
Успешно transfected клеток должен быть виден при микроскопии флуоресцирования в течение 16-24 ч transfection. Чтобы оценить эффективность, используйте флуоресцентный микроскоп для проверки трансфекции после ночи инкубации при температуре 37 ° C.
Примечание: Этот метод приводит общую эффективность трансфекции от 5 до 10%.

3. томография

Установите пластину на флуоресцентный микроскоп с моторизованного столика и установления доверительного (например, знак на нижней плиты), которая позволит пользователю для выравнивания пластины каждый раз, когда его образ. Сохраните изображение этой фидуциарных для справки.
Перейдите к полю интерес и внимание координаты x-y относительно доверительного.
Сосредоточиться на transfected клеток, выражая флуоресцентные метки.
Принять флуоресцентного изображения в соответствующий канал или каналы (например, красный флуоресцирующий белок [запрос], Зеленый флуоресцирующий белок [GFP], 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), либо вручную, либо в автоматическом режиме. Взяв несколько изображений регулярно-на расстоянии промежутки, монтаж скважины может быть смонтирован во время обработки изображений (см. шаг 4).
Примечание: Расстояние зависит от нескольких факторов, включая увеличение, оптики микроскопа и детектор размер. В общем оптических расстояние между соседними изображения будет между 90 – 95% от размера каждого индивидуального изображения, чтобы разрешить для небольшой степени совпадения изображения и есть выравнивание.
Повторите этот процесс так часто, как требуется, приведение к оригинальной доверительного каждый раз. Для выживания анализа изображений занимает место каждые 6 – 24 ч, в зависимости от типа клеток и Цель эксперимента.

4. обработка изображений

Примечание: После захвата изображений ряд шагов обработки требуются до анализа изображений. Они включают, но не ограничиваясь, брошюровка, укладки и вычитание фона (рис. 1). Цель этих шагов-производить стек изображений, или временных рядов, в которых клетки четко различимы от их происхождения и легко следить за несколькими моментами времени. Специальный макрос Фиджи (Image_Processing.ijm, см. Дополнительные 2 файла), выполняет основные швы, укладки и вычитание фона. Каждый шаг и параметры, которые необходимо учитывать при выполнении обработки изображений, разъясняются в разделе обсуждения.

Настройка исходных данных или ввода каталог для соответствия параметрам форматирования, показано на рисунке 2.
Если время очки не являются смежными (то есть, T1, T2, T3), переименовать эти папки так, что они являются. Этот шаг очень важен для обеспечения что Image_Processing макрос не врезаться во время укладки.
Дважды щелкните на значке Фиджи открыть программу, а затем нажмите и перетащите макрос Image_Processing на Фиджи бар. Это позволит открыть макрос в Фиджи.
Настройка линии 2-7 Image_Processing макрос для указания входных каталог, содержащий изображения, желаемый выходной каталог для изображения сшитые и накоплением, количество изображений timepoints, количество флуоресцентные каналов и формат пластины.
Определите порядок, в котором были приобретены изображения. Чтобы проверить это, вручную стежка монтаж изображений в Фиджи, маневрируя плагины меню падения вниз | Брошюровка | Коллекцию сетки строчки. Настройте параметры в раскрывающемся меню тип и порядок пока не точно нашит изображения производится.
Настройте переменные GRID_TYPE и STITCH_ORDER в линии 8 и 9 макрос Image_Processing , чтобы соответствовать этим критериям.
Укажите количество изображений в колодец, регулируя линии 10 в макросе Image_Processing .
Примечание: Для 2 x 2 Монтаж изображений, эта линия будет читать DIM = 2.
Если требуется вычитание фона, отрегулируйте линия 14 в макросе Image_Processing BGSUB = true.
Установите радиусу качения шарика, регулируя линия 15 в макросе Image_Processing .
Примечание: Для получения оптимальных результатов, установить радиус до по крайней мере диаметр крупнейших переднего плана объекта на изображении.
Нажмите запустить для запуска макроса Image_Processing . После запуска, Image_Processing автоматически будет заранее через швы, укладки и вычитание фона.

5. Озвучивание смерть клетки

Примечание: В разделе обсуждения для получения дополнительной информации о скоринга гибель клеток и цензуры данных.

Найдите стеки изображений, производимые Image_Processing сценарий. Откройте их в Фиджи.
Используйте точку инструментом в Фиджи для индивидуально этикетке каждой ячейки с числом. Нажать t , после каждой точки будет добавить идентификатор клетки к диспетчеру ROI (регион интереса).
Примечание: Идентификаторы могут быть визуализированы, нажав этикетки и Показать все флажки в менеджере ROI.
Прогресс через timepoints в каждом стека изображений и записи timepoint при каждой ячейки, либо умирает, или нужно быть цензуре в файле Survival_spreadsheet.csv (см. дополнительный файл 3).
1. Каждая ячейка занимает одну строку в таблице, где уникальный идентификатор (ID) для каждой ячейки состоит из его соответствующих хорошо и РУА число в пределах что хорошо. tp_death это последний момент времени, клетки наблюдается быть живым, в то время как time_death представляет фактическое время смерти в часах. Для каждой ячейки ввод этих данных. Крайне важно сохранить эту структуру для последующего анализа с использованием выживания. R (см. дополнительные 4 файла).
  Примечание: Критерии для определения смерти клетки имеют решающее значение и может варьироваться в зависимости от типа ячейки. Три основные критерии используются в идентификации мертвых нейронов¹¹^,²⁰ (рис. 3): потеря интенсивности флуоресценции (например, нейрон 1 69 ч), округление клеток тела (например, нейрон 2 188 ч) и потери neurite целостности или блеббинг (например, нейрон 2 188 ч).
Запишите цензор состояние ячейки в последней колонке.
Примечание: Здесь, благодаря своеобразно цензуры обрабатываются по R, цензуре клетки обозначены 0, в то время как без цензуры клетки характеризуются 1. Обратите внимание, что все ячейки, которые живут на последний момент цензуре и поэтому помечен как 0.

6. выполнение Кокс пропорционально опасности для анализа и визуализации результатов

При необходимости загрузить утилиту R-studio в https://cran.r-project.org/mirrors.html.
Откройте R-studio и дважды щелкните значок для выживания . R сценарий.
Поместите курсор на строке 2 выживания. R и нажмите кнопку выполнить в главном окне студии R для того чтобы загрузить библиотеку выживания.
Измените линия 5 выживания. R сценарий для соответствия расположения файла Survival_spreadsheet.csv. Нажмите запустить для загрузки данных выживания как датафрэйма.
Выделить линии 8 и 9 и нажмите кнопку запустить в окне консоли studio R для того чтобы выполнить анализ пропорциональной опасности Кокс. Результаты и Статистика выходных данных отображаются в окне консоли R студии.
Выделите линии 12-16 выживания. R и нажмите кнопку запустить чтобы производят совокупного риска смерти участок, который будет отображаться на вкладке участки в R-studio. Этот файл можно сохранить, нажав на кнопку Экспорт выше сюжет.
Если желательно данные выживания, как кривая Каплана-Мейера, выделите линии 19-24 выживания. R и нажмите кнопку выполнить .

Результаты

С помощью трансфекции процедуру, описанную здесь, DIV4 крыса корковых нейронов были transfected с плазмида кодирования mApple флуоресцентный белок. Начиная с 24 ч после трансфекции, клетки были образы микроскопии флуоресцирования каждые 24 ч для 10 дней подряд. Результирующего изо...

Обсуждение

Здесь представлены методологии непосредственно следить за выживаемость нейронов на основе одной ячейки. В отличие от традиционных анализов для смерти клетки, которые ограничены для дискретного времени точек и всей популяции клеток, этот метод позволяет для непрерывной оценки различ?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Стива Finkbeiner и члены Finkbeiner лаборатории для новаторских роботизированных микроскопии. Мы также благодарим Dan Пейсах за строительство первоначального программного обеспечения для обработки изображений и автоматизированный анализ выживаемости. Эта работа финансировалась Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (NINDS) R01-NS097542, Мичиганского университета протеин складные болезни инициативы, и Энн Арбор активных против ALS.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12863
Magnesium chloride Hexahydrate	Sigma	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
Poly D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 supplement	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140122
96 well plates	TPP	0876