Простая миграция/вторжения рабочий процесс, с помощью автоматизированных Imager клеток

Резюме

Текущий протокол описывает комплексный метод исследования миграции клеток рака и вторжения на единой платформе в режиме реального времени, обеспечивая легко воспроизводимые и время эффективный вариант для изучения клеток мобильность и морфологии.

Аннотация

Рак клеток мобильность имеет решающее значение для начала метастазов. Таким образом исследование клеточного движения и инвазивного потенциала имеет большое значение. Анализов миграции обеспечивают основные понимание клеточного движения на 2D уровне, тогда как вторжения анализов более физиологически важны, подражая в естественных условиях раковых клеток выскальзывание из оригинального сайта и вторжение через внеклеточного матрикса. Текущий протокол обеспечивает один рабочий процесс для миграции и вторжения анализов. Вместе с комплексной автоматизированной микроскопических камеры для реального времени изображения HD и модуль встроенного анализа это дает исследователи время эффективный, простой и воспроизводимые экспериментальный вариант. Этот протокол также включает замены расходных материалов и методов альтернативного анализа для пользователей, чтобы выбрать из.

Введение

Миграции клеток и вторжения являются важные биологические процессы, которые позволяют нормальных функций в теле человека, таких, как закрытие раны, вторжение плаценты в матки и молочной железы морфогенеза^1,2,3. Человеческое тело имеет точного и строгого контроля этих биологических событий; Однако есть некоторые исключения. Злокачественные опухоли, например, возможность избежать этой гарантии, демонстрируют ненормальное распространения и вторгнуться в соседние ткани, которая называется метастазированием. Метастазирование является главной причиной смертности, связанной с раком⁴.

Рак молочной железы является наиболее часто диагноз рака у женщин и является вторым по величине причиной связанных с раком смерти среди женщин в развитых странах во всем мире⁵. Рак молочной железы происходит от протоки или долек, которые состоят из одного или нескольких слоев эпителиальных клеток. В нормальной груди эпителиальные клетки придерживаться друг с другом и базальной мембраны через мембранных белков, таких как E-Кадгерины и интегринов⁶. Однако инвазивным молочной железы клетки рака потеряли их полярность и клеток клеточной адгезии и классически пройти переходного эпителия мезенхимы (EMT) и получить возможность перемещения. После кровоподтек эти клетки пересекают внеклеточного матрикса (ECM) и введите кровеносного сосуда или лимфатической системы, затем следуют intravasation и метастатические роста⁷. Понимание механизмов, посредством которых это происходит, имеет большое значение, поскольку метастаз является наиболее распространенной причиной смертности, связанных с раком и тесно связана с раком клетки миграции/вторжения. Чтобы визуализировать движение раковых клеток, миграции и вторжения анализов являются идеальной модели для изучения 2D и 3D клеточного движения, соответственно. Миграции непосредственно оценивает движение клеток, тогда как вторжения включает в себя взаимодействие с микроокружения и способность к разложению биологические барьеры. Эти два процесса не являются полностью независимыми друг от друга, как миграция является требованием вторжения.

Несколько методов были разработаны для изучения миграции и вторжения. Как рассмотрено, Крамер et al., анализов миграции как ранозаживляющее, забор и микро перевозчик анализов генерировать клетки свободно OBLASTь разрешить клетки переехать в, оценка изменения площади; в то время как transwell и капиллярной анализы основаны на количество клеток, которые двигаться в сторону аттрактанта⁸. Для вторжения анализов, ECM среды должен быть установлен с ECM гель или коллагена например, и 3D движения могут быть оценены путем наблюдения за вторжения области, расстояние и клеток обвинения (например, transwell проба, Утконос пробирного)⁸. Другой тип вторжения пробирного является объединить инвазивных клетки с неинвазивные клеток и оценить поведение инвазивных клеток (например, assays сфероида). Эти методы имеют свои плюсы и минусы и путь, это простой подход, легко повторить и объединить assay переноса и пробирного вторжения в рабочем процессе подобных преференций в экспериментальный дизайн.

Этот протокол описывает измерение миграции клеток и вторжения, с помощью томографа живой клетки. Это реальном времени ячейки, мониторинга системы, установленной в инкубатор культуры стандартной ячейки. Он принимает изображения высокой четкости согласно сканирование интервалы и измерения, применяя соответствующие маски в клетки или флуоресцентные целей. Модуль миграции/вторжения пробирного включает в себя использование 96-контактный скретч инструмент, который подходит для создания однородной скретч раны на монослое клеток в 96-луночных пластине. Этот механизм основан на в пробирке рану исцеление анализов, мониторинг 2D клеточного движения на пластиковом или с покрытием поверхности. Можно также оценить вторжения или 3D движение через дополнительные ECM в пределах нуля раны. Краткий рабочий процесс проиллюстрирован на рисунке 1.

протокол

Примечание: Две линии клетки должны обрабатываться отдельно. Следующие процедуры должны применительно к одной строке одну ячейку, если не указано.

1. оптимизировать плотность клеток до ранения

1. Культура адэрентных клеток в колбах культуры ткани² см T75, около 80% слияния в фенол красный бесплатно Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 200 мм L-глютамина и 2 мкг/мл инсулина при 37 ° C с 5% CO₂ ( стандартные инкубационных условий для большинства рак клеточных линий, культура формулировки являются клетки линии зависимых).
2. Удалите медиа культуры, дозирование Выкл в контейнер для отходов. Пипетки 2 мл подогретым 0,1% трипсина-ЭДТА в кратко смыть монослоя клеток и пипетки. Добавить еще 2 мл 0,1% трипсина-ЭДТА и место колбу в условиях стандартного инкубации при 37 ° C за 5 мин.
3. Аккуратно коснитесь Фляга для обеспечения отряд клеток, а затем добавить 10 мл подогретым культуры средств массовой информации, чтобы остановить протеолитических реакции.
4. Перенесите суспензию клеток в 15 мл пластиковых пробирок и спин вниз на 200 x g 5 мин при комнатной температуре (RT). Тщательно удалить супернатант без агитацию Пелле клеток и Ресуспензируйте с другой 10 мл подогретым Культура СМИ.

2. Подсчет количества клеток, используя счетчик автоматизированных клеток (или любых методов подсчета)

1. Разбавить 200 мкл суспензии ресуспензированы клеток с 800 мкл 1 x Дульбекко фосфат буфер солевой (DPBS) в пластиковых пробирок 1.5 мл.
2. Прикрепите датчик количество клеток 60 мкм счетчик соматических клеток, удерживая переключатель и объединить кончик в суспензию клеток. Медленно отпустите рычаг до тех пор, пока суспензию клеток успешно обращается в датчик. Концентрация ячейки отображается в кл/мл.
3. Расчет количества клеток в суспензии клеток 10 мл.

3. клетки плакировка

1. Пластина ячейки в диапазоне плотностей клеток (40 000-90 000 клеток/а) в трех экземплярах в 96-луночных пластине.
2. Место пластину в тепловизор клеток и запланировать сканирование каждые 2 ч за 24 ч.
   1. В программном обеспечении нажмите сканирует расписание из списка задач. В панели настройки ящик определить положение пластины, нажмите кнопку Добавить судна и выберите тип пластины. В панели Настройки сканирования выберите или редактировать схему сканирования по данным экспериментальных плиты установки и задайте Тип сканирования как стандарт.
   2. Щелкните правой кнопкой мыши на временной шкале и выберите Задать интервалы. Установите Добавить сканирует каждый 2 ч в 24-h расписание. Нажмите кнопку Применить.

4. Определите оптимальное ячейки посева плотности для Assay переноса

1. STсоч сканирования после 24 ч, применить слияния обработки инструмент анализа на HD-фаза контраст изображения автоматически собраны и генерировать кривой распространения клеток против времени.
   1. Определить 3-6 представитель изображения и разместить их в новой Коллекции изображений.
   2. Определите маску надлежащей Обработкиопределения.
   3. Запустите задание анализа.
   4. Определить плотность оптимизированный клеток согласно слияния против времени (примерно 100% слияния в течение 6-18 ч в зависимости от того, когда начинается assay переноса).
      Примечание: Количество времени, необходимое для роста клетки до слияния варьируется в зависимости от заполнения разрежения.

5. дни 1 и 2: подготовка к миграции и вторжения анализов

1. В день 1 Пальто пластину для вторжения assay.
   Примечание: гель ECM всегда должны обрабатываться на льду и с советами, которые были помещены в холодильник на ночь.
   1. Разбавить ECM гель с ледяной культуры СМИ до 100 мкг/мл и 50 мкл разбавленного ECM гель/СМИ в назначенный скважины.
   2. Место пластину на стандартных инкубационных условий на ночь.
2. На 2 день аккуратно удалить избыток средств массовой информации. Пластина клетки с плотностью оптимизированный клеток в 2 96-луночных плит, предназначенных для assay переноса (без покрытия) и вторжения assay (с покрытием) в triplicates следующие разделы 1-3 в конце дня (в текущий протокол, оптимизированный плотности посева для Были ZR75-1 и MDA-MB-231 90000/Ну и 50000/Ну, соответственно).
3. Поместите пластины на стандартных инкубационных условий на ночь.

6. день 3: Рана нуля

1. Спрей и протрите скретч инструмент и 2 мытья лодки с 70% этанол до размещения их в области биобезопасности кабинета. Заполните Стиральная лодка 1 и 2 с точно 45 мл стерильного (газобетона) дистиллированной воды и 70% этанола соответственно.
2. Для стерилизации место нуля инструмент контактный блок (вверху) на промывку лодка 1 и 2 для 5 мин.
3. Начните с пластину пробирного миграции.
   1. Переместить пластину, содержащие клетки из инкубатора и убедитесь, что нет ну сухой, чтобы избежать повреждения царапины инструмента. Снять крышку плита и вставьте в основание держатель рабочего инструмента и осторожно поместите верхнюю часть на базовой части, направляя дюбели. Нажмите и удерживайте рычаг черный, тем временем, осторожно поднимите блок PIN-код. Пробелы в каждой скважины обычно видны невооруженным глазом и под микроскопом.
   2. Быстро смочите булавки в воде; Это достаточно, чтобы очистить средство нуля до царапин пластину пробирного вторжения, если плита установки идентичны. В противном случае повторите шаги стерилизации с стерильной дистиллированной водой, а затем 70% этанола за 5 мин.
4. Мыть плиты 1 или 2 раза с подогретым культуры средств массовой информации, чтобы избежать отдельные ячейки или ячейки листов, повторное присоединение к колодцу.
5. 100 мкл свежий теплый СМИ, в назначенный скважины с или без лечения.
6. Дополнительные шаги для вторжения assay.
   1. Место пластину пробирного вторжения на 4 ° C за 5 мин сбалансировать и тщательно аспирационная холодной средства массовой информации.
   2. Разбавить ECM гель с ледяной культуры СМИ до 5 мг/мл, 50 мкл разбавленного ECM геля в назначенный скважины и место под стандартные инкубации за 30 мин.
   3. 100 мкл подогретой СМИ с или без проверки соединений.
7. Место пластину в живой клетки тепловизор и дайте ему сбалансировать на 5 мин Типа судна как imagelock пластины. Задать Тип сканирования как Скретч раны, выбрать или изменить Шаблон проверки согласно экспериментальной плиты установки (1 изображение/Ну и широкоэкранный режим) и расписание 24-h повторить сканирование каждые 1-2 ч за 72 ч до заживления раны.
8. Чтобы очистить скретч инструмент, поместить верхнюю ось блока в каждом из следующих решений (45 мл в мытья лодки) за 5 мин: 0,5% моющего средства 1 моющего средства 1% (см. Таблицу материалы), 2 (см. Таблицу материалы), стерильной дистиллированной водой и 70% этанола. Место нуля инструмент обратно на его основание и магазин в среде пыли.

7. анализ данных

1. Остановите сканирование пластину назначенный после того, как все раны зажили, выбрав экспериментальной пластины на Ящик установки и Удаления судна.
2. Соберите 3-6 представитель изображения, охватывающих широкий спектр звука проценты, включая изображения прямо после того, как рана был достигнут, ушивание раны на 10% и 50%.
3. Определение надлежащей обработки, используйте Настройки сегментации, очистки и фильтры , чтобы применить соответствующие Поцарапать раны маски и Маски слияния. Используйте Предварительный просмотр текущего/все для просмотра точности маски.
4. Запустите задание анализа.
5. Данные можно проанализировать в рамках программного обеспечения или экспортированы для дальнейшего анализа. Три метрики, предоставляемый программное обеспечение может использоваться для оценки изображения HD-фаза: ширина (мкм), раны слияния (%) и относительной рану плотность (%). Сравнение будет обсуждаться в следующем разделе.

Результаты

Этот assay переноса/вторжения основан на исцеление assay рану, которая оценивает уровень клеток в клетки свободно OBLASTь, созданный инструментом скретч 96-контактный. Разница между миграцией и вторжения анализов, что миграция assays клетки мера, движущихся на ткани Культура леч?...

Обсуждение

Миграция и вторжения являются важными параметрами для оценки подвижности раковых клеток. Используя инструмент скретч 96-pin, это возможно для проведения анализов в 2D и 3D ранозаживляющее одновременно. Помимо содействия автоматическое сканирование, обеспечение стабильной клетки культур?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Dilute to 2x in DPBS
Countess II FL Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% working concentration
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% working concentration
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Growth-factor reduced, phenol red free
Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom	Essen	4379
EVE Counting slides	BioTools	EVS-50
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories	Essen	4444	Including CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Cell migration kit	Essen	4493	Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software
IncuCyte ZOOM	Essen		Live cell analysis system
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175