Универсальный метод для монтажа Arabidopsis оставляет для прижизненной покадровой изображений

Резюме

Мы приводим простой и универсальный способ выполнения флуоресцентные жить изображений Arabidopsis thaliana листьев в течение длительного периода времени. Мы используем трансгенных растений Arabidopsis выражая флуоресцентные Репортер ген под контролем промотора, связанных с иммунитетом в качестве примера для пространственно-временных понимания растений иммунных реакций.

Аннотация

Завод иммунного ответа, связанный с геном общесистемной transcriptional перепрограммирования инициируется в месте инфекции. Таким образом иммунный ответ регулируется пространственном и временном отношении. Использование флуоресцентных гена под контролем промотора связанных с иммунитетом в сочетании с автоматизированной флуоресцентной микроскопии является простой способ понять пространственно-временных регуляции иммунитета растений. В отличие от корня тканей, которые были использованы для целого ряда различных прижизненной флуоресцентных изображений экспериментов существуют примеры флуоресцентные жить изображений для тканей листа, которые сталкиваются массив бортовых микробной инфекции. Поэтому мы разработали простой метод для монтирования листья Arabidopsis thaliana растений для живой клетки изображений в течение длительного периода времени. Мы использовали трансгенные растения арабидопсис , выражая желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) genefused на ядерной локализации сигнал (NLS) под контролем промотора гена оборонной маркер, Pathogenesis-Related 1 ( PR1). Мы проникли трансгенных лист с псевдомонас pv. помидор DC3000 (avrRpt2) напряжение (Pst_a2) и осуществляется в естественных условиях промежуток времени визуализации рекламы ЯФП сигнала для в общей сложности 40 h, с использованием автоматизированных флуоресценции стереомикроскопом. Этот метод может быть использован не только для исследования на завод иммунные реакции, но и для анализа различных мероприятий в области развития и окружающей среды реакций, происходящих в тканях листа.

Введение

Иммунную систему растений включает в себя динамический transcriptional перепрограммирования регулируется несколькими транскрипции факторы, а также фитогормонов¹. Накопление данных транскриптом предоставляет возможности для сбора информации о иммунной системы растений: например, структура сети сигнализации каскады². Однако наши знания о пространственной и временной динамизм иммунитета растений по-прежнему ограничены^3,4,5.

В предыдущих исследованиях пространственно-временных регуляцию экспрессии генов, связанных с обороны главным образом проанализирован с помощью гибридизации in situ и β-глюкуронидазы (GUS) репортер пробирного^6,,78. Эти методы позволяют нам визуализировать transcriptional активации различных генов интерес на местах. Однако эти процедуры требуют химической фиксации образцов и таким образом привести к потере всей временной информации. Биологическая события, такие как иммунитет, прогресс с течением времени. Использование Люцифераза как репортер позволило захвата временной динамики промоутер интерес³. Однако на основе Люцифераза пробирного требует дорогих субстрата и очень чувствительных детекторов. Чтобы увеличить наше понимание пространственно-временных аспектов растений иммунного ответа с помощью простой процедуры, мы создали трансгенных Arabidopsis thaliana растений, выражая желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) ген сливается с сигнал (рекламы ЯФП-NLS) ядерной локализации под контролем промотора гена оборонной маркер, Pathogenesis-Related 1 (PR1)⁹. Мы использовали хлорофилл аутофлюоресценция, маркер живых клеток, чтобы захватить процесс запрограммированная смерть клетки (PCD), которая часто происходит во время эффекторных срабатывает иммунитета (ETI), форма иммунитета растений, вызванных конкретного возбудителя инфекции^{9 , 10}. Мониторинг временная динамика интенсивности флуоресценции сигнала в свободно движущихся объектов, таких как живущих листья Arabidopsis , требует сложной обработки изображений программное обеспечение либо построенных собственными силами или имеющиеся коммерчески. Кроме того предотвращая перемещение образцов представляет собой простой метод для решения этого вопроса. Здесь мы разработали универсальный и простой метод для монтажа живущих листья трансгенные растения арабидопсис для долгосрочного наблюдения под стереомикроскопом автоматизированной флуоресценции. Метод позволяет нам захватить промоутер, листья динамика в почве выросли нетронутыми завода в течение нескольких дней.

протокол

Примечание: Важно предотвратить сна движения листьев живых образцов во время промежуток времени визуализации. Чтобы свести к минимуму механических напряжений на листьях, нежный фиксации листьев является необходимым. Только образцы адекватно подготовленные листья производят покадровой фотографии подходит для анализа различных изображений. Протокол, с помощью трансгенные растения арабидопсис , выражая Рекламы ЯФП-NLS фьюжн под контролем PR1 гена промоутер (pPR1-рекламы ЯФП-NLS растения) и псевдомонас pv. помидор DC3000 (avrRpt2) напряжение (Pst_a2) описан ниже в качестве примера.

1. Подготовка растений и патогенов

1. Заполните Пластиковый сотовый вилка лоток (Таблица материалов) с газобетона почвы.
2. Сеять один трансгенных семян арабидопсиса в ячейку (рис. 1А).
3. Передача лоток в комнату рост на уровне 23 ° C и выращивать растения под непрерывный белый свет 2-3 недели.
4. За два дня до прививки патогена, полоска псевдомонас pv. помидор DC3000 avrRpt2 деформации (Pst_a2) от глицерина запас на NYG среднего (Пептон 5 г/Л, экстракт дрожжей 3 г/Л, 20 мл/Л глицерина, бактериологического агар 15 г/Л, pH 7.0) содержащий 100 мг/Л рифампицин и 50 мг/Л канамицин и Инкубируйте на 28 ° C в течение 48 часов.
5. Урожай бактериальные клетки, которые появляются на поверхности среды, используя пластиковые советы, перенести их в пластиковую пробирку, содержащую 10 мм MgCl₂и Ресуспензируйте. Измерение оптической плотности (OD) раствора на 600 Нм (₆₀₀OD). Отрегулируйте окончательный ячейки концентрации бактериальных клеток в 10⁸ колонии формирования единицы (CFU) / мл, который обычно соответствует ОД₆₀₀ = 0.2¹¹.

2. возбудитель прививка

1. Аккуратно вырежьте вилкой ячейки, содержащие 2-3-недели старый завод без повреждения растений. Задайте ячейку в пустой ячейке вилка лоток (2 x 2 клетки достаточно) поддерживать хороший баланс (рис. 1Б).
2. Выберите заметно здоровый лист для прививки. Как правило, третий, четвертый и пятый листья (#3, #4 и #5, соответственно, на рис. 1C) от нижней части завода просты в обращении. Использование листьев на той же позиции в наборе экспериментов для лучшей воспроизводимости. Воды, почвы, холдинг завод до прививки для долгосрочного покадровой воображения.
3. Дополнительно в случае анализа стресс отзывчивым промоутеров, таких как pPR1, чтобы гарантировать, что растения не подчеркнул естественно, изучите листья под стереомикроскопом флуоресценции до прививки возбудителя проверить отсутствие рекламы ЯФП сигнала. Исключить листья показ рекламы ЯФП сигнал от эксперимента.
4. Носите одноразовые латексные перчатки до проникновения, чтобы избежать прямого контакта с возбудителя. С помощью безыгольной Пластиковый шприц 1 мл, тщательно проникнуть на abaxial стороне листа с бактериальной подвеска (10⁸ кое/мл)¹¹ (рис. 1D). Прививка небольшой части на половину листа позволяет хорошая визуализация pPR1 деятельности; проникли области становится видимым как темный зеленый цвет по сравнению с оставшиеся листья. Будьте осторожны, чтобы не вызвать механические повреждения листьев во время проникновения.
   Примечание: Убедитесь, что все межклеточных пространствах в районе проникли полностью (по вертикали) выполнены с подвеской возбудителя; в противном случае PCD домен будет трудно визуализировать под стереомикроскопом флуоресцентные. Это может быть просто подтверждено завершение темные озеленения в районе проникли.
5. Поглощают избыток бактерий подвеска из района вокруг проникли секции проникли листья мягкие бумажным полотенцем.

3. Монтаж привитых лист

1. Сразу же после прививки исправьте на стеклянное скольжение на пластиковый лоток, используя хирургическая лента (Таблица материалов), таким образом, что проникли лист расположен в центре стеклянное скольжение. Убедитесь, что привитых листовой пластинки полностью установлен в стеклянное скольжение (рисA).
2. Подготовить-двухслойной пластиковой лентой (в случае ленты толщиной 0,2 мм, см. Таблицу материалы) и разрезать его на две части (рис. 2B; частей 1 и 2) по размеру пространства вдоль черешок листа проникли. Организовать Длина этих двух частей, с двунаправленной стрелки в рисунке 2B, чтобы вписаться в длину двунаправленной стрелки, показан на рисунке 2A.
   Примечание: Вырезать угол от каждого из двух частей помогает избежать повреждения листовой пластинки (Рисунок 2B, наконечники стрел; также увидеть шаг ниже 3.4). Любой вид пластиковой лентой с аналогичными толщиной подходит для приготовления мост над черешок. Жесткость пластиковой ленты имеет важное значение для легкой обработки во время описанной ниже процедуры.
3. С помощью тонкой пинцет, придерживаться ленты частей 1 и 2 по обе стороны черешок, таким образом, чтобы вырезать углы каждого куска выровнять с базой листовой пластинки (рис. 2C). Убедитесь, что куски ленты не прикасайтесь к лезвию черешок или листьев.
   Примечание: Эти кусочки-двухслойной пластиковой ленты на базе листовой пластинки выступать в качестве распорки и предотвращению физического стресса на черешок во время монтажа.
4. Подготовить дополнительный кусок двуслойная пластиковые ленты (рис. 2B, часть 3) к размеру двунаправленной стрелки на рисунке 2B и придерживаться его на верхней части ленты, 1 и 2 к форме мост над черешок ( Рисунок 2D, E). Будьте осторожны, чтобы не поймать черешок и листьев лезвие непосредственно между куски ленты на позиции, отмеченные стрелки на рисунке 2D, E.
5. Аккуратно придерживаться небольшой кусок Хирургическое ленты (рис. 2F, часть 4) на стеклянное скольжение выше кончика листовой пластинки, так что листовой пластинки очень мягко фиксируется на стеклянное скольжение. Только твердо надавите часть хирургическая лента прямо трогательно стекла слайд (Рисунок 2F, область, ограниченная пунктирной красной линией), не другая часть вышележащих листьев.
6. Аккуратно stick еще небольшой кусок Хирургическое ленты (рис. 2G, часть 5) на границе черешок и пластиковые ленты штук (1, 2 и 3), так что очень мягко черешок фиксируется на стеклянное скольжение и пластиковые ленты штук. Только прочно прикрепить частью хирургическая лента прямо трогательно стекла слайд слайд стекла и куски пластиковой ленты (рис. 2G, область, ограниченная пунктирной красной линией), не другая часть вышележащих черешок.
7. Предотвратить соседних листья от переезда в поле зрения микроскопа с помощью 200 мкл наконечники (Рисунок 2H). Вставьте наконечники в почве аккуратно прижмите соседних листья от проникли листьев. Будьте осторожны, чтобы не вставить советы слишком глубоко в почву, чтобы избежать возможных повреждений.
   Примечание: Подготовленные завод теперь готов к флуоресцирования стереомикроскопом изображений.

4. микроскопические промежуток времени наблюдения

1. Включите флуоресцентные стереомикроскопом.
   Примечание: Здесь, автоматизированный стереомикроскопом оснащен высокочувствительным монохромный 1,4 МП, цифровой фотоаппарат в 12-битный режим используется (Таблица материалов). Микроскоп должны быть помещены в темной комнате с кондиционирования воздуха или в темный шкаф с достаточной вентиляцией для поддержания комнатной температуре 23 ° c во время промежуток времени визуализации.
2. Установите завод в пространстве над под объектив стереомикроскопом для воображения.
3. Настройка параметров для покадровой изображений (см. примеры, приведенные в таблице 1). Убедитесь, что программа шагов по освещенности в период интервала промежуток времени визуализации, поскольку свет имеет существенное влияние на иммунитет растений¹².
   1. Используйте обычные рекламы ЯФП фильтр (возбуждения 500-520 Нм; выбросов 540-580 Нм) для визуализации рекламы ЯФП сигнала.
   2. Используйте фильтр Техас красный (TXR) (возбуждения 540-580 Нм; выбросов 610 Нм длинный пас) для визуализации хлорофилл аутофлюоресценция, чтобы домен PCD видна как темные области (не аутофлюоресценция), окруженный рекламы ЯФП положительных клеток слои⁹ (рис. 3 A).
   3. Используйте обычные epi яркие поля установки для дополнительного воздействия света шагов.
      Примечание: Прежде чем эксперимент, измеряют мощность источника света epi яркий и настроить его на уровень роста состояния собственного завода.
4. Запустите программу промежуток времени визуализации. Для долгосрочного наблюдения в течение нескольких дней рассмотрим полива растений надлежащим образом, например, во время действия освещенности.
5. После захвата изображений опустите дополнительных каналов, используемых для освещенности в интервалах (соответствующие каналы 3-8 в таблице 1) из набора данных. Анализируйте данные с различных методов, таких как региона интерес (ROI) анализ, используя программное обеспечение для анализа различных изображений например Фиджи⁹.

Результаты

Здесь, мы использовали Pst_a2-индуцированной ЕТС в качестве примера для покадровой воображения. Промежуток времени данные были получены как серию изображений, некоторые из которых показаны на рисунке 3Bи как промежуток времени фильм (Дополнительные фильм 1)⁹. В успешных экспериментов с использованием pPR1-рекламы ЯФП-NLS во время Pst_a2-индуцированного ETI, переходных активации pPR1 было отмечено, как видно из рекламы ЯФП, выражая очаги, в несколько слоев клеток, окружающих PCD домена (рис. 3B) ⁹. Активация pPR1 в клетки, окружающие PCD домена обычно начинается примерно 5 часов пост прививка (hpi), пики в приблизительно 12 Инн и длится до 40 hpi (рис. 3B)⁹. Поскольку изображения были приобретены с помощью системы epi люминесцентные, рекламы ЯФП сигналов, полученные здесь были получены из нескольких слоев adaxial клеток, включая клетки эпидермиса, а также верхняя мезофилл.

Рисунок 1 : Метод, используемый для проникновения бактериальных патогенов в Arabidopsis thaliana лист. (A) двух до трех week-old Arabidopsis растения выращивались в трее вилка ячейки. Один клетки (B) Подсоедините, содержащий выбранный завод использоваться для прививки и наблюдения было вырезать и помещены в пустую ячейку вилка лоток для поддержания баланса. (C) Третий, четвертый и пятый листья (#3, #4 и #5, соответственно) подходят для анализа изображений. (D) проникновение возбудителя подвеска в выбранный лист с помощью безыгольной шприца. Проникли области может быть признано на основании его темный зеленый цвет, чем оставшиеся листья. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Метод, используемый для монтажа проникли Арабидопсис лист для покадровой воображения. (A) фотография растение Arabidopsis с фиксированной под привитых лист стекла слайд. Проникли лист был установлен в центре стеклянное скольжение. Двусторонняя стрелка указывает длину распорки пластиковой лентой. (B) подготовка пластиковой лентой распорки и мост. Двухместный - многослойные пластиковые ленты был сокращен на два произведения (1 и 2) для прокладки и еще один кусок (3, ограниченная пунктирной красной линией) был сокращен подготовить мост. Длины двунаправленной стрелки практически идентичны по длине двунаправленной стрелки в (A). Один из четырех углов частей 1 и 2, обозначаются стрелками, были сокращены. (C) двух штук-двухслойной пластиковой ленты (под номером 1 и 2) были тщательно вставляется стекло слайд вдоль с помощью тонкой пинцет, не делая прямого контакта с лезвием черешок и листьев черешок. (D) дополнительных кусок двуслойная пластиковые ленты (под номером 3), который был подготовлен (B), был сделан на обоих базальной распорки (1 и 2), чтобы сформировать мост над черешок, обеспечивая при этом не для того, чтобы поймать черешок между 1 и 2 на ленты позиции, отмеченные стрелками. (E) фотографию тесьмой черешок. Не важно поймать растительной ткани непосредственно между куски пластиковой лентой на позиции, отмеченные стрелками. (F) A небольшая хирургическая лента (под номером 4) был аккуратно наклеенные на стеклянное скольжение вокруг кончика листовой пластинки. Только области, изложенные пунктирная красная линия была нажата твердо на стеклянное скольжение. (G) еще один небольшой кусок Хирургическое ленты (номер 5) был аккуратно вставить на границе черешок и куски пластиковой лентой. Только области, изложенные пунктирная красная линия была нажата для фиксации черешок мягко на слайд стекла и куски пластиковой лентой. (H) две одноразовые наконечники были использованы для предотвращения перемещения в поле зрения стереомикроскопом соседних листья. Наконечники были вставлены непосредственно в почву на соответствующих позициях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Представитель результатов, используя Арабидопсис лист метод монтажа. (A) флуоресцентный stereomicroscopic образы трансгенных Arabidopsis листа (pPR1-рекламы ЯФП-NLS завод). Часть листа было проникли с Pst_a2 (10⁸ кое/мл) на его abaxial поверхность, и изображения были захвачены в 22 часа пост прививка (ХПИ). Ядра, в которых был активирован промоутер pPR1 были обнаружены с помощью фильтра рекламы ЯФП, а запрограммированная смерть клетки (PCD) был обнаружен на потери хлорофилла аутофлюоресценция, с помощью фильтра Техас красный (TXR) основе. Шкалы бар = 2,5 mm. (B) несколько замедленной изображений, выбранных из коллекции 800 изображений, полученных с помощью протокола описаны здесь. Эти данные предоставляют в vivo обзор динамики пространственно-временных pPR1 деятельности для 40 Инн. Рекламы ЯФП и TXR объединенного изображения отображаются. Шкалы бар = 2,5 mm. (C) макет инфильтрации трансгенных листа (pPR1-рекламы ЯФП-NLS завод). В макет инфильтрации 10 мм MgCl₂ было проникли на abaxial стороне листа, а затем time-lapse изображений. Макет лечение не вызывать внематочной pPR1 активности и не вмешиваться аутофлюоресценция хлорофилла в 13 ХПИ. Стрелка указывает позицию макет инфильтрации. Шкалы бар = 2,5 мм. Эти изображения были изменены из предыдущего исследования⁹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Промежуток времени визуализации программы, используемые в данном исследовании.

Дополнительные фильм 1: промежуток времени фильм, показывающий динамика пространственно-временных pPR1 Активация в трансгенных Арабидопсис лист, индуцированных следующие эффекторных срабатывает иммунитета (ETI) Pst_a2 прививки. Часть abaxial стороне трансгенных листьев, перевозящих конструкцию PPR1-рекламы ЯФП-NLS было проникли с Pst_a2 (10⁸ кое/мл). Изображения были приобретены на 3-мин интервалами для в общей сложности 40 ч. Штамп времени показывает находится в формате dd:hh:mm:ss.sss. Этот фильм был изменен от предыдущего исследования⁹. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Обсуждение

Здесь мы приводим простой метод для монтирования гостиной Arabidopsis лист, выражая флуоресцентные Репортер ген под контролем промотора интерес для долгосрочного наблюдения с использованием автоматизированной флуоресцентные стереомикроскопом. Промежуток времени изображения флуоресцентных репортер был часто выступал в тканях корня; Однако только несколько аналогичные исследования были проведены в тканях листа. Это, скорее, потому что листья имеют возможность свободно перемещаться в пространстве, в то время как корни часто похоронены и исправлена в средне твердой агар.

В настоящем докладе мы сосредоточились на пространственно-временных динамика pPR1 активности во время ETI, индуцированных Pst_a2. В дополнение к нежным фиксации листа, подробно говорилось выше важно четко визуализировать пространственно-временных динамику клеточного событий, таких как промоутер активации и PCD. Если не резкое различие между ячейками, показывая pPR1 активности и PCD, убедитесь, что все из межклеточного пространства в районе проникли полностью заполнены с подвеской возбудителя (см. шаг 2.4). Это очень важно при использовании стереомикроскопов флуоресценции поля, поскольку эти Микроскопы захватить все обнаруживаемые сигналы вдоль же вертикальное положение образца. Хлорофилл аутофлюоресценция из живых клеток выше или ниже клетки PCD домена легко маски выставке не аутофлюоресценция мертвые клетки. Это также верно для рекламы ЯФП сигнала.

Условия для покадровой изображений необходимо будет тщательно через несколько предварительных экспериментов в различных экспериментальных условиях. Параметры для покадровой изображений зависит от нескольких факторов, таких как микроскопические системы, трансгенных растений и патогенов. Чтобы получить эти параметры, мы сначала проанализировал различные воздействия раз для рекламы ЯФП интенсивности сигнала в проникли листьев на 7 ХПИ, который почти совпадает с первоначальной активации pPR1. 5 s экспозиции было определено как подходящие для захвата сигнала рекламы ЯФП с стереомикроскопом, используемые в данном исследовании. Подобный тест был проведен для визуализации аутофлюоресценция хлорофилла. Воздействие образца света между интервалами 3 мин был запрограммирован в программу покадровой изображений как нормальный светлые области изображения с максимальной выдержка. Наша система (Таблица материалов) позволило нам иметь 2,5 мин помимо рекламы ЯФП, TXR и светлые области изображения. Это ограничение было основной причиной для выбора интервала 3 мин. Далее мы подтвердили, что этот промежуток времени условие вызвало без видимых повреждений на образцы растений и не вызывать внематочной света стрессом активации pPR1 (Рисунок 3B, C). Это привело к разработке программы, используемые в данном исследовании. Таким образом, 3-мин интервалами флуоресценции изображений были сочтены достаточными для захвата pPR1 динамика во время Pst_a2-опосредованной ETI⁹.

Промоутер репортер конструкций, особенно с флуоресцентные репортер, сливается с NLS, использовались многими группами, и легко доступны от исследовательского сообщества; Мы использовали конструкции, опубликованной Кубо et al. ¹³. Таким образом, протокол, описанные здесь может использоваться в любом исследовании биологии растений, изучение тканей листа, если соответствующие трансгенных растений доступны. Наш простой и простой протокол предоставляет большие возможности для исследователей, которые хотят анализ пространственно-временных динамики любых биологических событий, происходящих в листья, таких как иммунного ответа. Вполне вероятно, что наш метод, с помощью кусков ленты вызывает небольшой физический стресс на образцы. Однако этот вопрос можно контролировать, включив соответствующие позитивные и негативные элементы управления, например макет лечения, в экспериментах (рис. 3C). Экспериментальных условий может быть далее изменена и оптимизирована путем анализа этих элементов в различных условиях.

В последние годы быстрое развитие изображений инструментов и методов стимулировало интерес исследователей в сложных пространственно-временных аспектов биологических событий. В любых изображений анализа соответствующие крепления и фиксации образцов являются одним из наиболее важных вопросов. Простой и универсальный метод монтажа жизни листья Arabidopsis разработан в этом исследовании можно применять и оптимизирована для различных изображений экспериментов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	BD biosciences	214010
Bacto Protease Peptone No. 3	BD biosciences	211693
Bacto Yeast Extract	BD biosciences	212750
BM2 soil	Berger
Glycerol	nacalai tesque	17017-35
Kanamycin sulfate	Wako	113-00343
Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated)	Leica Microsystems		Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed
Magnesium Chloride Hexahydrate	Wako	135-00165
Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm)	MATSUNAMI	S1112
Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m)	3M	1530-0
Needleless 1 ml plastic syringe	Terumo	SS-01T
Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm  × 44mm × 44 mm)	Tanaka sangyo, Japan	htray-bk72	Any  tray with similar sized cells can be used
Rifampicin	nacalai tesque	30259-81
Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long)	Yamato	No0200-19-1	Any plastic/vinyl tape with  similar thickness can be used