Дыхание коллекции от детей для открытия биомаркеров болезни

Резюме

Этот протокол описывает простой метод для приобретения отбору проб выдыхаемого воздуха от детей. Вкратце образцы смешанного воздуха предварительно сосредоточены в сорбент трубы до анализа газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Дыхание биомаркеров инфекционных и неинфекционных заболеваний могут быть идентифицированы с помощью этого метода коллекции дыхание.

Аннотация

Дыхание сбор и анализ может использоваться для обнаружения летучих биомаркеров в ряде инфекционных и неинфекционных заболеваний, как малярия, туберкулез, рак легких и заболевания печени. Этот протокол описывает воспроизводимый метод отбора дыхания у детей и затем стабилизации дыхание образцов для дальнейшего анализа с газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС). Цель этого метода заключается в создании стандартизированный протокол для приобретения дыхание образцов для дальнейшего химического анализа, от детей в возрасте от 4 до 15 лет. Во-первых дыхание выборку с использованием картона мундштук, прилагается к 2-ходовой клапан, который подключен к мешок 3 Л. Дыхание аналитов затем переведен в трубу термодесорбция и хранятся в 4-5 ° C до анализа. Эта техника ранее использовались для захвата дыхание детей с малярией для успешного дыхание биомаркер идентификации. Впоследствии мы успешно применяется эта техника для дополнительных педиатрических когорты. Преимуществом этого метода является, что она требует минимального сотрудничества со стороны пациента (представляют особую ценность в педиатрической популяции), имеет период короткий коллекции, не требует квалифицированного персонала и может быть выполнена с портативного оборудования в Параметры поля ограниченных ресурсов.

Введение

Биомаркеров может дать ценную информацию о нормальных и патологических биологических процессов, которые могут способствовать клинически идентифицируемые болезни. Недавно наблюдается растущий интерес к оценке дыхание летучих качестве биомаркеров для различных заболеваний государств, включая инфекции, метаболических расстройств и рака ¹. Выдыхаемого воздуха содержит поддающиеся количественному определению уровней летучих органических соединений (Лос), полулетучих органических соединений и микробиологически производного материала (например, нуклеиновые кислоты от бактерий и вирусов). Центральная цель анализа выдыхаемого воздуха является неинвазивным лучше понять состояние медицинского состояния и/или экологического воздействия. Существуют различные методы для сбора и анализа выдыхаемого воздуха, в зависимости от составляющих интерес. В настоящее время нет метода сбора стандартизированной выдыхаемого воздуха, который усложняет сравнительный анализ результатов различных исследований. Стандартизация процедур сбора дыхание важно, как сама процедура выборки имеет значительное влияние на течению результаты анализов дыхание.

Во многих исследованиях конце дыхания дыхание выборка является занятых^2,3. Эта выборка включает, отбрасывая начальная часть выдыхаемого воздуха («Мертвое пространство»), чтобы преференциально захватить воздух в конце цикла дыхания. Преимущество этой стратегии является, что он уменьшает уровни экзогенных Лос (например, экологические Лос), а обогащения для эндогенного, пациент конкретные Лос. Этот метод исключает первые несколько секунд испарений от индивидуального до сбора образца дыхание. Другие исследователи использовали датчик давления для того чтобы активировать выборки этапе Предопределенные действия^4,5. Поскольку датчики давления требуется комплексный инжиниринг, этот альтернативный метод требует устройство выделенный и сравнительно дорогостоящим выборки.

Детская Дыхание выборки может быть особенно сложным. Ключевой проблемой является, что маленькие дети могут быть неспособны сотрудничать с протоколами для добровольного выдоха воздуха «Мертвое пространство». По этой причине это легче получить смешанные дыхания дыхание от детей. Однако крупные предостережение с образцами смешанной дыхания дыхание является риск загрязнения окружающей среды и материала. Таким образом возможности детской коллекции является движущей озабоченность в области.

Кроме того, методы сбора хранения проб выдыхаемого воздуха также могут влиять качество образца. Высокая влажность в дыхание exhalate и ультра-низкой концентрации (частей на триллион), летучих органических соединений сделать дыхание отбору проб выдыхаемого воздуха особенно восприимчивы к проблемам, касающимся хранения^6,7. Несмотря на большой потенциал в реальном времени методы, как Протон передачи реакции масс-спектрометрии (PTR-МС) ГХ-МС остается золотой стандарт для анализа проб выдыхаемого воздуха. Так как GC-MS анализ образцов дыхание является автономной техника, он сочетается с предварительным концентрированием методы, такие как трубы термодесорбции (TD), твердой фазы микро добыча и иглы ловушку устройств. Перед предварительным концентрированием дыхание образцы должны храниться временно в полимерные мешки⁸. Полимерные пакеты популярны из-за их умеренная цена, относительно хорошей прочностью и повторного использования. В то время как мешки могут быть повторно использованы, время и усилия, необходимые для обеспечения эффективной очистки^7,8. Каждый тип конкретных мешок также требует эмпирически решительные и стандартизированных процедур для контроля качества, повторного использования и восстановления.

ТД трубы широко используются для дыхание предварительным концентрированием, потому что они захватывают большое количество летучих веществ и могут быть настроены. Абсорбирующие материалы, используемые для упаковки ТД трубы могут быть адаптированы для конкретных приложений и конкретных целевых летучих интерес. ТД труб значительно улучшить удобство дыхание биомаркер исследований, особенно в удаленных местах, потому что TD трубки безопасно хранить дыхание летучих веществ для по крайней мере две недели и легко транспорта³.

В попытке стандартизировать Детская Дыхание коллекции для открытия биомаркеров здесь мы опишем простой метод для сбора дыхание от детей младшего возраста. Чтобы проиллюстрировать представитель результаты выполнены протоколов, обезличенных данных представлены от проходящих когорта детей (8-17 лет) проходят оценку для безалкогольных жирная кислота печени заболевания (NAFLD). Полные результаты и анализ этого исследования будет сообщено в поздней публикации. В этой работе мы сообщаем суб набор данных для демонстрации применения нашего протокола. В краткой дети поручено обычно выдохните через мундштук в полимерной мешок, как будто «дует воздушный шар». Этот процесс повторяется 2 - 4 раза до 1 Л дыхание собирается. Образец затем передается в TD трубку и хранятся на 5 ° C до анализа GC-MS.

протокол

Это исследование был одобрен институционального обзора Совет из Вашингтона школы медицины университета (#201709030). Обоснованного согласия одного из родителей или законного опекуна до включения в исследование. Фотографии в Рисунок 2 воспроизведен с письменного информированного согласия родителей.

1. дыхание сборники Ассамблея

1. Используя одноразовые перчатки, придаем картонные мундштук дыхание сборники, как показано в дополнительном Рисунок 1. Прикрепите короткая длина труб большого диаметра в другую крайность дыхание сборники, как показано на рисунке 1 дополнительный. Использование новых труб для каждого пациента.
2. Подключите разъем дыхание на клапан мешка через трубку. Смотрите Рисунок 1 для фото дыхание сборники и мешок подключен.
3. Поверните винт с накаткой накаткой на стороне входной уместно против часовой стрелки, чтобы разблокировать клапан и надавите штока клапана мешка, чтобы открыть входе, оборудование для отбора проб.
4. Блокировка открытия клапана, поворачивая винт с накаткой накаткой на стороне входной уместно по часовой стрелке.
5. Убедитесь, что синий вентиль на дыхание сборники открыт (параллельно с разъемом).
6. Запись пациентов идентификатор, Дата и время на этикетке мешок полимера.
7. Состояние TD сорбента трубки до дыхание коллекции с помощью рекомендованных процедур (доступно из отдельных производителей). Крышка и хранить термодесорбция трубы в 4 – 5 ° C до дыхание коллекции для сведения к минимуму артефактов.

2. дыхание коллекции

1. Выполните демонстрацию выдоха дыхания ребенка с помощью пробоотборника дыхание (без мешка). Объясните ребенку, что они должны дышать так, как они будут делать, когда «дует воздушный шар» и продолжать дышать вне, поскольку они могут комфортно. Положите картон мундштук между ваши губы и выдыхайте, насколько вы можете.
2. Предоставить ребенку новое дыхание сэмплер, придает мешок и попросите их, чтобы выдох как демонстрации, как показано на рисунке 2.
3. Закройте синий клапан на устройстве сборники дыхание, как только ребенок готов, на выдохе. Откройте клапан при необходимости до дополнительных выдохов.
4. Повторите шаг 2.2 и 2.3, до тех пор, пока по крайней мере 1 Л дыхание было собрано. Для здорового ребенка, это может занять 2 выдохов и для больных или младшего ребенка 2 – 4 выдохов. 1 Л дыхание является аналитическая минимум. Обратите внимание на этикетке мешок, сколько вдохов были собраны от пациента. Смотрите Дополнительные рисунок 2 Фото мешок, содержащий различные объемы дыхание.
5. Перед отсоединением мешок из дыхание сэмплер, убедитесь в том ослабить винт накаткой на стороне входной уместно, повернув его против часовой стрелки и нажмите штока клапана до закрытия впускного фитинга. Смотрите Дополнительные рисунок 3 для фото мешок клапана в открытом и закрытом положении.
6. Замок сумка клапан закрыт, повернув винт с накаткой накаткой на стороне входной уместно по часовой стрелке.
7. Отсоедините мешок из дыхание сэмплер.
8. Распоряжаться мундштук и отложить в сторону дыхание сборники для очистки до использования с другой пациент.

3. дыхание передачи термодесорбция трубы

1. Снять трубку TD из холодильника. Удаление долгосрочного хранения шапки сорбента трубки, с помощью средства укупорочные для распечатки сотов Производитель предоставляемых трубки.
2. Прикрепите протектором конец TD сорбента трубки для проб с помощью трубы. Обратите внимание, что ориентация трубка имеет важное значение, как ТД трубы предназначены для воздуха течет только в одном направлении, начиная с рифленой конца. Обратите внимание, что передача дыхание от мешок TD должно быть сделано в течение 1 часа дыхание коллекции.
3. Вставьте другой конец трубки TD в трубы, который подключен к насосу.
4. Включите насос и набор для запуска на 100 мл/мин в течение 10 мин.
5. Открыть вентиль на мешок, поворачивая против часовой стрелки вращайте винт на стороне впуска установку и нажмите штока клапана вниз открытом входе установку. Это показано в дополнительном рисунок 4, который демонстрирует передачу дыхание в TD сорбента трубку с помощью насоса.
6. Запустите насос, который остановится после коллекции в 10 минут.
7. Снять трубку сорбента TD и завинтите крышки на обоих концах, с помощью средства укупорочные для распечатки сотов трубки. Долгосрочного хранения крышки должны быть ужесточены прочно для того, чтобы обеспечить герметичность уплотнения.
8. Поместите наклейку на конце одного шапка указывает, что используется трубка. На наклейке укажите дату и пациента исследование идентификационный номер (ин).
9. Место труб в небольшой закрывающемся полиэтиленовом пакете. Сорбент трубки магазина в 4 – 5 ° C. Нажмите остальные дыхание из мешка и отбросить мешок. Запись пациентов исследование ID, ТД трубки серийный номер, сбор день, время сбора дыхание, дыхание передачи и приема пищи (время приема пищи до дыхание коллекции и пищи, потребляемой).

4. окружающего воздуха коллекции

1. Сбор образцов окружающего воздуха в среде пациента сразу же после сбора дыхание.
   1. Прикрепите сумку в порт выходе насоса с помощью трубки, как показано на рисунке 5 дополнительных.
   2. Сдвиньте стержень клапана мешка вниз открыть входной штуцер для выборки.
   3. Замок открыть клапан, повернув по часовой стрелке вращайте винт на стороне впуска фитинга.
2. Включите насос и набор для запуска на 100 мл/мин 12 мин. Насос будет собирать 1200 мл окружающего воздуха.
3. После того, как были собраны запрошенный объем, ослабьте винт накаткой на стороне входной уместно, повернув его против часовой стрелки и нажмите штока клапана до закрытия впускного фитинга.
4. Замок сумка клапан закрыт, повернув по часовой стрелке вращайте винт на стороне впуска фитинга.
5. Отсоедините мешок из насоса.
6. Выполните те же действия, как и раздел 3. Единственная разница что окружающего воздуха, который будет передаваться Лос, не тех, от дыхания.

5. выборки и анализа данных

Примечание: Условия для анализа образцов дыхание и воздуха были описаны ранее⁹.

1. Анализ собранных данных и обнаружить соединений в хроматограммы. Используйте Типичные прикладные программы для поиска и идентификации всех соединений определяется инструмента (рис. 3A). Например используйте функцию деконволюция для выявления соединений. Фильтрация данных с помощью хранения окна размер коэффициента 80, массовые высот фильтры ≥100 подсчитывает, и соединений абсолютной области фильтра пола≥500 подсчитывает.
2. Используйте химические стандарты для идентификации соединений в образцах дыхания и воздуха. Извлечь площади пика базового ионных соединений интереса, таких как изопрена и β-пинена (рис. 4) и сравнить уровни летучих веществ в дыхание и воздуха.

Результаты

В нашем исследовании дыхание, которые были собраны пробы из 10 детей (8-17 лет) проходят оценку в Сент-Луисе детской больнице. Дыхание образцы и пробы окружающего воздуха (n = 10) были собраны, как описано выше. Образцы были проанализированы с помощью газовой хроматограф...

Обсуждение

Несмотря на значительный прогресс в исследованиях дыхание в течение последнего десятилетия стандартизированные методы отбора проб и анализа летучих газов дыхание оставаться неопределенным¹⁰. Основная причина этого отсутствие стандартизации был разнообразие дыхание ко?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")