Доклиническая модель сердечного донорства после смерти от кровообращения

Резюме

Этот протокол показывает простой и гибкий подход к оценке новых кондиционирующих агентов или стратегий для повышения осуществимости сердечного донорства после смерти кровообращения.

Аннотация

Спрос на пересадку сердца растет; тем не менее доступность органов ограничена из-за нехватки подходящих доноров. Донорство органов после смерти кровообращения (DCD) является решением для решения этой ограниченной доступности, но из-за периода длительной теплой ишемии и риск повреждения тканей, его регулярное использование в трансплантации сердца редко видели. В этой рукописи мы предоставляем подробный протокол, тесно имитирующий современные клинические практики в контексте DCD с непрерывным мониторингом функции сердца, что позволяет оценить новые кардиопротекторные стратегии и вмешательства, чтобы уменьшить ишемия-реперфузионная травма.

В этой модели, протокол DCD инициируется в анестезируется Льюис крыс, остановив вентиляцию, чтобы вызвать кровообращение смерти. Когда систолическое кровяное давление опускается ниже 30 мм рт. 00, инициируется теплое ишемическое время. После предустановленного теплого ишемического периода сердца промывают сяртом кардиоплегический раствор, закупаются и устанавливаются на систему перфузии сердца Langendorff ex vivo. После 10 минут первоначального реперфузии и стабилизации, восстановление сердца постоянно оценивается в течение 60 минут с помощью внутривенного мониторинга давления. Травма сердца оценивается путем измерения сердечного тропонина T и размер инфаркта количественно гистологического окрашивания. Теплое ишемическое время можно модулировать и адаптировать для разработки желаемого количества структурных и функциональных повреждений. Этот простой протокол позволяет оценить различные кардиопротекторные стратегии кондиционирования, введенные в момент кардиоплегии, начального реперфузии и/или во время перфузии ex vivo. Выводы, полученные из этого протокола, могут быть воспроизведены в больших моделях, облегчающих клинический перевод.

Введение

Твердая трансплантация органов в целом и пересадка сердца,в частности, находятся на подъеме во всем мире 1,². Стандартным методом закупки органов является донорство после смерти мозга (DBD). Учитывая строгие критерии включения DBD, менее 40%предлагаемых сердец принимаются 3, тем самым ограничивая предложение в условиях растущего спроса и расширения списка ожидания органа. Для решения этой проблемы, использование органов, пожертвованных после смерти кровообращения (DCD) считается потенциальным решением⁴.

В DCD доноров, однако, агональный этап после отмены ухода и период незащищенной теплой ишемии до реанимации неизбежны⁵. Потенциальная травма органа после смерти кровообращения может привести к дисфункции органов, объясняя нежелание регулярно принимать DCD трансплантации сердца. Сообщается, что только 4 центра используют DCD сердца клинически, с строгими критериями, которые включают в себя очень короткие теплые времена ишемии и молодых доноров без хронических патологий^6,7. По этическим и юридическим причинам, ограниченные или не кардиопротекторные вмешательства могут быть применены к донорам до смерти кровообращения^5,8,9. Таким образом, любое смягчение, чтобы облегчить ишемию реперфузии (ИК) травмы ограничивается кардиопротекторных терапии, начатой во время раннего реперфузии с кардиоплегическими решениями, и не позволяют для надлежащей функциональной оценки. Ex vivo перфузии сердца (EVHP) и восстановление сердца DCD с использованием специальных платформ была предложена в качестве альтернативного решения и изучены различными учеными^10,11,12,13 . EVHP предлагает уникальную возможность доставить пост-кондиционирования агентов DCD сердца для улучшения функционального восстановления. Однако для эффективного клинического перевода многие технические и практические вопросы еще предстоит решить, и это еще больше усугубляется отсутствием консенсуса по целому ряду перфузии и функциональных критериев для определения трансплантируемости^{6, 8}.

В этом мы сообщаем о разработке воспроизводимого доклинического протокола DCD с первичным малым животным в сочетании с системой перфузии сердца ex vivo, которая может быть использована для исследования органов после кондиционирования, начатого во время закупок, во время первоначального реперфузии, и /или по всему EVHP.

протокол

Все протоколы по уходу за животными и экспериментальные протоколы соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Центра Hospitalier de l'Universit' de Montr'al Research Center.

1. Предварительная подготовка

1. Включите водяную ванну, чтобы нагреть систему доставки кардиоплегии(рисунок 1A)и систему перфузии Ex vivo Langendorff (рисунок1B). Установите температуру воды до 38,5 градусов по Цельсию при температуре раствора 37 градусов по Цельсию. Настройка фотографии можно увидеть в дополнительной рисунок 1A, B.
2. Приготовьте 1 л кардиоплегического раствора. Добавьте 1 мл 2% гидрохлорида лидокаина и 10 мл 2 мм ККл (окончательная концентрация 20 мМ) к 1 л плазменно-лита А (140 мМ Н, 5 мМ К, 1,5 мм Мм Мг, 98 мм Хл, 27 мм ацетата, 23 мм глюконата). Правильный рН до 7,4 с помощью 6 N HCl.
   ПРЕДЕКТО: Эта модель очень чувствительна к рН. Неправильная коррекция рН (вне физиологического диапазона 7,3-7,4) или нестабильные растворы pH могут поставить под угрозу эксперимент или предоставить ненадежные данные.
3. Подготовьте 4 l решения Krebs (113 мм NaCl, 4,5 мм KCl, 1,6 мМ₂PO₄, 1,25 мм CaCl₂, 1 мМ ММ МГКл₂6H₂O, 5,5 мМ D-Глюкоза, 25 мм NaHCO₃). Массы субстрата на 1 л раствора должны быть следующими: 6,1 г NaCl, 0,3355 г KCl, 0,2035 г MgCl₂No6H₂O, 0,192 г₂PO₄, 0,1387 г CaCl₂, 0,99 г D-Глюкозы, 2,1 г NaHCO₃ , окончательный объем 1 л в ультрачистой деионизированной воде. Добавить NaHCO ₃ последнее, чтобы избежать осадков. Отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм и храните его на ночь. Исправить рН до 7,4, когда решение находится на 37 градусов по Цельсию и пузырь с 5% CO₂/95% O₂.
4. Заполните схему Langendorff раствором Krebs и запустите системный насос. Убедитесь, что пузырьки не остаются внутри трубки. Отрегулируйте скорость перистальтической насоса до 80 об/мин (эквивалент 1 л/мин). Используя двухсторонний стоп петух, настроить поток для поддержания медленного капельного через аорты канюли, пока сердце не прилагается(Рисунок 1B). Держите образец раствора Кребса (15 мл) в конической трубке 50 мл на льду для транспортировки сердца.
5. Заполните систему доставки кардиоплегии кардиоплегическим раствором. После того, как пузыри удаляются, переключите схему на солин с помощью 3-способа остановить петух(рисунок 1A). Отрегулируйте скорость капельного произвока. Солин должен медленно капать с кончика катетера, чтобы гарантировать, что ни один кардиоплегический раствор не вводится до смерти животного.

2. Подготовка животных

1. Используя ингаляционную камеру, индуцировать анестезию с 3% изолюран. После того, как животное не реагирует, выполнить интраперитонеальной инъекции кетамина (75 мг/кг) и ксилазин (5 мг/кг) или аналогично подходящий анестезии, в соответствии с местными правилами, для поддержания анестезии для остальной части процедуры. Обеспечьте глубину анестезии без реакции на щепотку и пальпебральный рефлекс.
2. Интубировать животное с помощью 14 G, 2-дюймовый катетер I.V. Начало вентиляции при 50 вдохах на мин, при этом давление в дыхательных спуске ограничено 20 см₂О.
3. Поместите животное на грелку, установленную на "среднюю" и накройте абсорбирующим колодкой для поддержания температуры тела. Вставьте ректальный зонд температуры и прикрепите датчик предермального импульса оксиметра к одной из ног. Поддерживайте ректальную температуру при температуре 37 градусов по Цельсию на протяжении всей процедуры.
4. Сосудистый доступ
   1. Сделайте разрез кожи средней линии от 3 до 4 см в шее ножницами. Используя тупые кончики изогнутых ножницами, тупо вскрыть подкожную ткань и разоблачить правую стерноиоидную мышцу. Использование не травматических щипцов, двигаться мышцы боковой до правой сонной артерии (пульсирующая), яремной вены (не пульсирующий) и блуждающий нерв (белый) визуально определены(Дополнительная рисунок 2A). Тщательно отделите блуждающий нерв от сонной артерии с помощью тупых кончиков изогнутых ножниц.
   2. Вводят гепарин (2000 МЕ/кг) через правую яремную вену. Применить давление на место инъекции после иглы опрокидки, чтобы избежать утечки крови.
   3. Используя изогнутые щипцы, пройдите два 5-0 шелковых швов вокруг сонной артерии. Твердо прикрепите дистальный шов, чтобы зафиксировать сонную артерию при верхнем аспекте открытой артерии. Держите проксимальный шов развязанным. Тяговая проксимального шва будет использоваться для контроля кровотечения на следующем этапе(Дополнительная рисунок 2B). Расстояние между швами должно составить около 2 см.
   4. Используя стереомикроскоп для лучшей визуализации, тщательно сделайте разрез 1 мм ножницами на передней стенке сонной артерии. Вставьте 22 G, 1-дюймовый закрытый катетер I.V. к аорте арки. Катетер подключен к 2 способ остановки петух, что позволяет подключение к преобразователю давления для постоянного мониторинга, с возможностью введения сосудили или кардиоплегии через систему доставки кардиоплегии (Рисунок 1A).

3. Инициирование сердечного донорства после сердечной смерти (DCD) Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Полную хронологию протокола можно увидеть на рисунке 2.

1. Re-asses анестезии глубины, выполняя щепотку ног и оценки palpebral рефлекс. Если реакция наблюдается, выполнить интраперитонеальный инъекции кетамина (37,5 мг/кг) и ксилазина (2,5 мг/кг). Переоценить через 5 минут. Если ответа не наблюдается, продолжайте процедуру. Трахеальный зажим должен выполняться только у адекватно обезболиваенных животных.
2. Выключите вентилятор и extubate животное. Использование комаров щиптем, зажим трахеи. Этот момент рассматривается как начало агональной фазы. Начните считать функциональное теплое ишемическое время (WIT), когда пик систолического кровяного давления падает ниже 30 мм рт. ст., или если появляется асистолия или фибрилляция желудочков, все, что приходит первым (Рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ущерба должен быть пропорционален WIT. Эксперименты необходимы для оптимизации времени WIT в соответствии с анестезией используется, животное штамм, пол и вес выбран. В контроль животных, сразу же после сонных сосудистых доступ обеспечивается, кардиоплегия вводится и сердце закупается, как описано в следующем шаге (Рисунок 2). Начало перфузии с кардиоплегией считается концом WIT.
3. В конце WIT, выполнить медиаль стернотомии. Держите грудную клетку открытой с помощью втягивающего втягивающего элемента Alm. Используя ножницы, откройте нижнюю полиа вены и оба предплеции, чтобы избежать разгрузки миокарда или рециркуляции кардиоплегии (дополнительная цифра 3). Зажим аорты над диафрагмой. Через ранее катетеризированную сонотидную артерию, настоять кардиоплегический раствор при постоянном давлении 60 мм рт. ст. с помощью системы доставки кардиоплегии. Давление инфузии можно изменить, изменив высоту водного столба.
4. В конце кардиоплегического инфузии, вскрыть восходящую проксимальную аорту из легочной артерии с помощью изогнутых щипц(Дополнительная диаграмма 4A). Отрежьте аорту дисталь в левую подклавианальную артерию. Обеспечьте длину аорты не менее 0,5 см для каннулирования для аппарата Langendorff.
5. Удерживая сердце от аорты, завершить кардиэктомии, отделяя сердце от легочных вен и других грудных структур(Дополнительная рисунок 4B). Быстро погрузите сердце в ледяной раствор Кребса для быстрой транспортировки в систему ex vivo. Держите вскрытие и время транспортировки как можно меньше (5 мин).

4. Ex Vivo сердце перфузии системы (EVHP) и сердечной функциональной оценки

1. Откройте просвет аорты с помощью щипцы. Побили аорту, заполнив просвет капающим раствором Кребса, чтобы избежать заставить пузырьки в коронарные сосуды. Опустите канюль в аорту, заботясь, чтобы не пройти корень аорты или повреждения аортальных клапан листовок. Исправить установку с небольшим зажимом.
2. Используя 2-способ стопкок, увеличить поток для поиска возможных утечек в аорте. Если ни один не обнаружен, плотно исправить аорты к канюле с помощью 2-0 шелковый шов. Полностью откройте поток к канюле. Поддержание аортального давления при физиологическом давлении 60-70 мм рт. см (с поправкой на изменение высоты системы). В этот момент инициируется начальное время реперфузии и стабилизации. Давление аорты может быть изменено в соответствии с экспериментальным планом следователя.
3. Поверните сердце, чтобы основа сердца (атрии) стояла перед датчиком давления. Расширьте левожелудочковое отверстие предсердий, рассекая легочные вены. Вставьте латексный шар, подключенный к датчику давления. Убедитесь, что воздушный шар полностью расположен внутри желудочка путем визуального осмотра. Медленно заполните шарик солевой раствор до конца диастолического давления (EDP) установлен до 15 мм рт. ст. Отрегулируйте по мере необходимости, чтобы сохранить постоянный EDP (предопределенный физиологический EDP). EDP может быть скорректирован в соответствии с экспериментальными целями каждого исследователя.
4. Вставьте темпэлектрода в переднее лицо сердца (правый желудочковый отток тракта). Избегайте прокалывающих коронарных сосудов. Как только спонтанное избиение наблюдается, инициировать ходить на 300 ударов в минуту. Требуемое напряжение может варьироваться между экспериментами и крысиных штаммов.
5. После 10 минут стабилизации инициируйте непрерывную внутривенную запись измерения давления. Этот момент считается началом этапа восстановления и оценки (время 0), который будет длиться 1 ч(рисунок 2). Восстановление может быть длительным, но во всех сердцах ожидается временное снижение контрактности.
6. В начале восстановления, собирать сердечные стоки снижается из сердечных вен в течение 5 минут для базовой оценки коронарного потока и биохимических анализов. Для тропонина T повторить каждые 15 минут (время 0, 15, 30, 45 и 60 мин). Для других анализов необходима индивидуализация времени сбора (Рисунок 2).

5. Конец опыта

1. Удалить сердце из аппарата Langendorff.
2. Используя прямое высокоуглеродное стальное лезвие (микротомное лезвие или подобное), удалите основание сердца (включая аорту и легочную артерию).
3. С правой желудочка лицом вниз, сократить поперечные желудочковые горки 1-2 мм толщиной. В одном репрезентативном разделе (обычно третий) выкрепите правый желудочек и заморозьте левый желудочек. Этот образец может быть использован для биохимического анализа.
4. Погрузите оставшиеся секции в свежеприготовленный 5%, 2,3,5-трифенил-тетразолий хлорид в коммерческих фосфатных буферных солен овый рН 7,4 в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия. Жизнеспособные ткани окрашены в красный кирпич.
5. Вымойте дважды фосфат буфера соливой рН 7,4 и исправить с 10% формалин на 4 кв к в одночасье. Вымойте дважды с фосфатами буферных солен рН 7,4 и держать каждый ломтик погружен.
6. Снимите лишнюю жидкость и вескаждого слайда. Возьмите цифровые цветные изображения с обеих сторон. Используйте планиметрические анализы для расчета процента размера инфаркта и правильного для среза и общего веса желудочков. Окраска исчезает со временем. Фотографии должны быть сделаны как можно скорее.

6. Анализ данных

1. Сохраните все данные о давлении в новом файле на одно животное.
2. Для анализа давления выберите не менее 200 циклов давления на временные точки. Анализ может быть выполнен в автономном режиме (после завершения эксперимента) с использованием специального программного обеспечения (т.е. LabChart). Общие сердечно-сосудистые параметры доступны включают в себя: Максимальное генерируемое давление, конец диастолического давления, здП/дт (самый крутой склон во время подъема кривой давления, индикатор желудочковой контрактильной способности), -dP/dt (самый крутой склон во время вниз кривой давления, индикатор релакса релакса) среди других.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа тропонина ожидается увеличение высвобождения тропонина при реперфузии. После 1 ч реперфузии в системе EVHP уровень тропонина может снизиться до базового уровня, подчеркивая необходимость тщательного времени в сборе и обработке этих образцов.

Результаты

После экстубации, кровяное давление быстро падает в предсказуемой картины(Рисунок 3). Ожидаемое время до смерти составляет менее 5 мин.

На рисунке 4 показана средняя кривая давления/времени в начале восстановления после 0, 10 и 15 минут WIT. Со в?...

Обсуждение

Представленный здесь протокол вводит простую, удобную и универсальную модель сердечного DCD, предлагающую возможность оценить сердечное функциональное восстановление, повреждение тканей и использование посткондиционирующих кардиопротекторных средств для улучшения восстановления ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL