В Vivo изображений и количественного пребывания ангиогенных ответ в опухоли зебрафиш ксенотрансплантатов

Резюме

Цель этого метода состоит в том, чтобы создать модель in vivo опухолевого ангиогенеза путем ксенотрансплантации опухолевых клеток млекопитающих в эмбрион зебры, который имеет флуоресцентно обозначенные кровеносные сосуды. С помощью изображения ксенотранспланта и связанных с ним сосудов можно получить количественное измерение ангиогенной реакции.

Аннотация

Опухолевой ангиогенез является ключевой целью противораковой терапии, и этот метод был разработан, чтобы обеспечить новую модель для изучения этого процесса in vivo. Ксенотрансплантат зебры создается путем имплантации опухолевых клеток млекопитающих в перивительное пространство двухдневных эмбрионов зебры, а затем измерения степени ангиогенной реакции, наблюдаемой в экспериментальной точке конца до двух дней после имплантации. Ключевым преимуществом этого метода является способность точно квантитаризировать ангиогенную реакцию зебры-хозяина на трансплантат. Это позволяет детально изучить молекулярные механизмы, а также вклад хозяина против опухоли в ангиогенный ответ. Ксенотрансвированные эмбрионы могут подвергаться различным методам лечения, таким как инкубация с потенциальными антиангиогенезными препаратами, для того, чтобы исследовать стратегии по ингибированию опухолевого ангиогенеза. Ангиогенный ответ также может быть живым изображением для того, чтобы изучить более динамичные клеточные процессы. Относительно нетребовательная экспериментальная техника, дешевые затраты на техническое обслуживание зебры и короткие экспериментальные сроки делают эту модель особенно полезной для разработки стратегий по манипулированию опухолевым ангиогенезом.

Введение

Ангиогенез является одним из классических признаков рака и представляет собой цель противораковой терапии^1,2. Для изучения этого процесса, ксенотрансплантат модели рака были созданы путем имплантации опухолевых клеток млекопитающих в животных, таких как мыши³. Модель ксенотранспланта зебры также была разработана, которая включает в себя имплантацию опухолевых клеток в 2 дня после оплодотворения (dpi) зебры, что приводит к быстрому росту кровеносных сосудов зебры в ксенотрансвграф⁴.

Этот протокол описывает in vivo зебрафиш эмбриона опухоли ксенотрансплантат модели, в которой ангиогенный ответ может быть точно количественно по всему ксенотрансвграф. Этот метод позволяет исследователю изучить, in vivo, молекулярные механизмы, которые лежат в основе опухоли ангиогенной реакции. Генетическая tractability зебры позволяет хозяину вклад быть допрошен, в то время как выбор различных опухолевых клеток линий позволяет вклад опухоли ангиогенез также будет рассмотрен^5,6,7. Кроме того, как личинки зебры проницаемы для малых молекул, конкретные ингибиторы пути могут быть использованы или библиотеки наркотиков могут быть проверены для выявления новых ингибиторов опухолевого ангиогенеза^{8,9,10, 11}.

Модель ксенотранспланта эмбриона зебры представляет уникальные преимущества по сравнению с другими моделями ксенотранспланта млекопитающих. Зебрафиш ксенотранспланты дешевле и проще в исполнении, большое количество животных могут быть рассмотрены и живой клеток изображения позволяет детальное изучение поведения клеток⁴. В отличие от других моделей in vivo, для наблюдения которых требуется до нескольких недель, ангиогенез у ксенотрансплантатов зебры можно наблюдать в пределах 24 ч после имплантации^3,4. Однако, отсутствие адаптивной иммунной системы у эмбриональных зебры, в то время как полезно для поддержания ксенотрансплантата, означает, что адаптивный иммунный ответ и его вклад в ангиогенез опухоли не могут быть рассмотрены. Кроме того, отсутствие опухолевых стромальных клеток, неспособность к ортотопически имплантации опухоли и разница в температуре обслуживания между зебрафиши и клетки млекопитающих являются потенциальными недостатками этого метода. Тем не менее, удобство этой модели для живой визуализации и способность точно количественно ангиогенный ответ делает его однозначно полезным для изучения клеточных процессов, которые регулируют ангиогенез опухоли in vivo.

протокол

1. Подготовка игл микроинъекций

1. Включите выдвижной микропипетец и установите следующие параметры (откалиброванные для модели вытягивателя micropipette, перечисленные в таблицематериалов): Тепло, 680; Потяните, 75; Скорость, 40; Время, 55; Давление: 530.
2. Закрепите боросиликатный стеклянный капилляр в выдвижной микропипетик и потяните капилляр, чтобы сделать две иглы. Повторите столько игл, сколько пожелает.

2. Клеточная культура для имплантации

ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании этого протокола, любая линия раковых клеток млекопитающих может быть использована для имплантации в эмбрионы зебры в качестве ксенотрансплантатов. Тем не менее, существует много изменений в ангиогенной реакции индуцированных между различными линиями клеток^5,11,12. Было показано, что клетки меланомы b16-F1 вызывают сильную ангиогенную реакцию в эмбрионах зебры¹¹ и поэтому подходят для использования в этом протоколе.

1. Выращивайте клетки B16-F1 при 37 градусах Цельсия в колбе номиналы мем-2 с использованием медиа MEM-q, дополненных сывороткой плода крупного рогатого скота (FBS) до конечной концентрации 10% (v/v) и пенициллина /стрептомицина, каждый при конечной концентрации 100 мкг/мл.
2. Удалите носители из 95-100% сопливой 75 см² колбы из клеток B16-F1 и промойте клетки в 5 мл фосфатно-буферного соливого раствора комнатной температуры (PBS).
3. Удалить 5 мл PBS, добавить 2 мл комнатной температуры 0,25% Трипсин / этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) и инкубировать при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 60 с.
4. Нажмите на сторону колбы, чтобы определить, начинают ли клетки терять свою привязанность к нижней части колбы.
5. Добавьте 8 мл комнатной температуры MEM-я с 10% FBS в колбу, пипетку против внутренней части колбы, чтобы принести любые клетки, которые остаются прилипания к нижней части колбы в подвеску и пипетка подвески клетки в 15 мл трубки.
6. Centrifuge клеточной суспензии на 800 х г, 4-8 кв в течение 5 минут, аспирировать средства массовой информации и приступить к маркировке клеток с красителем.

3. Маркировка B16-F1 Клетки с флуоресцентным красителем

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы различать имплантированные опухолевые клетки и другие клетки эмбриона, опухолевые клетки должны быть помечены соответствующим флуоресцентным красителем перед имплантацией. Этот шаг можно пропустить, если клетки уже выражают флуоресцентные репортеры.

1. Инкубировать 2 мл безсыворотки MEM-- медиа при 37 градусах Цельсия.
2. Подготовьте стоковый раствор выбранного красителя и разбавьте его в предварительно инкубированных 2 мл безсыворотки MEM-медиа, чтобы сделать работоспособную концентрацию (примеры красителей и концентраций, подходящих для клеток B16 F1, приведены в таблицематериалов).
3. Пипетка 1 мл раствора красителя в клеточный гранулы (от шага 2.6), тщательно перемешать путем пипетки, затем добавить другие 1 мл раствора красителя и перемешать.
4. Инкубировать клетки и краситель смесь при 37 градусов по Цельсию в течение 40 минут, смешивая нежной тряски на 20 мин.
5. Центрифуги ядолок подвески на 800 х г, 4-8 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
6. Призадыхать супернатант и мыть помеченные клетки путем pipetting с 5 мл PBS.
7. Centrifuge клеточной подвески снова на 800 х г, 4-8 кв в течение 5 минут, аспирировать супернатант и поместить клетки на лед, пока не готов к имплантации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный пузало опухолевых клеток должен иметь объем 20-40 Л.

4. Подготовка эмбрионов для имплантации

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите трансгенную линию зебры, которая имеет флуоресцентно маркированные кровеносные сосуды (например, kdrl:RFP, fli1a:EGFP и т.д.) ^{13 Год , 14}.

1. За два дня до имплантации, нереста зебры, как описано ранее и собирать эмбрионы¹⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мы не инъекционных этих рыб на ранней стадии, они не должны быть собраны в течение 20 минут нереста, как описано Розен и др.¹⁵, но могут быть собраны после нескольких часов спаривания.
2. Поместите эмбрионы в 100 мм культурные блюда при плотности около 100 эмбрионов/блюдо.
3. Добавьте 50 мл E3¹⁶ (дополнено 5 qL из 1% w/v aqueous stock solution из метилена синего для предотвращения загрязнения) к каждому блюду, очищайте любые мертвые эмбрионы или мусор и держите блюдо в темном инкубаторе при 28 градусах Цельсия до готовности к инъекциям.
4. На 1 день после оплодотворения (dpf), добавить 1-фенил-2-тиура (PTU) к каждому блюду для получения окончательной концентрации 30 мг/ l PTU в E3. ПТУ предотвращает пигментацию, которая может помешать способности просматривать опухолевые клетки и кровеносные сосуды.
5. На 2 dpf, используйте иглы или пинцет вручную dechorionate любые эмбрионы, которые не вылупляются. Используя флуоресцентный микроскоп, выберите столько трансгенных эмбрионов, как это требуется для ксенотрансвации (50-200).
6. Перед имплантацией анестезируйте выбранные эмбрионы в растворе 300 мкг/мл трикаина в E3, чтобы предотвратить движение во время процедуры инъекции.
7. Заполните 35-мм блюдо с 2% метилцеллюлозы в E3 раствора до четверти объема блюда.
8. Используйте пересадочную пипетку для размещения примерно 50 эмбрионов (минимизация объема раствора E3 также перенесена) на метилцеллюлозу.
9. Используйте наконечник пипетки Microloader, чтобы организовать эмбрионы так, чтобы все они были ориентированы вертикально, с головами вверх и с левой стороны вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.7-4.9 также могут быть выполнены путем организации эмбрионов на блоке агарозы, как ранее описано¹⁷, но по нашему опыту, эмбрионы легче организовать, когда массивные в метилцеллюлозе.

5. Перивителлин инъекций клеток рака млекопитающих в 2 dpf эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения того, чтобы клетки слипались в качестве трансплантата при имплантации, клетки должны быть смешаны вместе с внеклеточной матричной смесью (ECM). Мы описали шаги создания такой смеси ячейки/ECM при использовании смеси ECM, на которую ссылаются в таблицематериалов. Если используется альтернативная матрица, шаги должны быть соответствующим образом скорректированы.

1. Разделите запас ECM на 100 аликотов в 500 трубках и храните при -20 градусов по Цельсию до необходимости.
2. Оттепель из aliquot ECM и добавить 100 л PbS разбавить смесь до 50% (v/v).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленный 50% ECM может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 1 месяца.
3. Смешайте 50% ECM хорошо с B16-F1 клеток гранулы (от шага 3.7) путем pipetting и перемешивания, чтобы произвести смесь клеток / ECM в соотношении 2:1 и хранить смесь на льду.
4. Используя микрокапиллярную пипетку, возьмите 3-10 кл клеток.
5. Аккуратно вставьте кончик пипетки в иглу и выбрасывайте смесь B16-F1/matrix в конец иглы.
6. Вставьте иглу в держатель иглы и наклонитесь под углом 45 градусов к блюду.
7. Разбейте кончик иглы с помощью пинцета, чтобы сделать отверстие достаточно большим для клеток, которые будут извлечены из иглы без сжатия клеток.
8. Включите перфоцилиндр под давлением, прикрепленный к аппарату впрыска, и включите инжектор в «непрерывном» режиме на мгновение, чтобы подтолкнуть клетки к кончику иглы.
9. Выньте иглу из тарелки и замените блюдо гемоситометром.
10. Поместите каплю масла на гемоцитометр и введите иглу один раз на эту каплю.
11. Подсчитайте количество клеток, выбрасываемых с помощью одного импульса с помощью гемоситометра и калибруйте иглу, чтобы извлечь около 150 клеток на пульс, регулируя продолжительность пульса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выброс этого количества клеток на пульс потребует нескольких импульсов для того, чтобы имплантировать успешный ксенотрансплантат. Это даст исследователю больше контроля над окончательным размером опухоли ксенотрансплантата, позволяя им умеренно регулировать число / расположение импульсов, чтобы сделать каждый ксенотрансвант больше или меньше, как они считают нужным.
12. Направьте иглу к желтоковому мешку эмбриона и протолкните его через желточный мешок в брюшном направлении, пока кончик иглы не вышел из желточного мешка и не толкает эмбриональный эпидермис на брюшной стороне эмбриона просто задний к сердцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите иглу так, чтобы она вошла в переднюю часть эмбрионального желткового мешка до конечного места, где клетки будут выброшены. Это гарантирует, что клетки будут выброшены в направлении от сердца, уменьшая вероятность введения клеток в общую кардинальную вену.
13. Тщательно нажмите кончик иглы вперед немного, пока он не создал пространство (перивителина) между эпидермис и желтка мешок мембраны, а затем импульс инжектор, чтобы извлечь некоторые из клеточной смеси в пространстве перивителина.
14. Повторите импульсы до 500-800 клеток были введены в пространство перивителина, создавая видимый выпуклость, которая простирается по крайней мере половину пути вдоль нижней части желточного мешка, а затем удалить иглу из эмбриона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки блокируют иглу или повреждены во время инъекции, очистите иглу, на мгновение переключившись на "непрерывный" режим, а затем обратно в "пульс". Это должно разблокировать иглу и позволить клеткам быть извлеченным свободно и undamaged.
15. Продолжайте делать то же самое для всех эмбрионов в блюде, загрузка новой иглы с опухолевыми клетками, когда это необходимо.
16. После введения всех эмбрионов, удалить иглу и нажмите все эмбрионы вместе с помощью микрокапиллярных пипетки отзыв, так что они могут быть пипетка с как можно меньше метилцеллюлозы, как это возможно.
17. Перенесите эмбрионы в блюдо восстановления, содержащее E3 (с PTU и метиленовым синим) и промойте их, аккуратно промывe E3 вокруг эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, ксенопригированных эмбрионов можно лечить с помощью наркотиков, разделяя их на различные блюда и добавив препарат решение одного блюда и контрольный раствор (например, наркотиков транспортного средства) к другому блюду.
18. Инкубировать эмбрионы при 34 градусах Цельсия и выполнять два раза в день проверки, чтобы удалить мертвые или отеки эмбрионов из блюда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 34 КК было установлено, что оптимальная температура для ксенотрансплантата васкуляризации, а также используется в других исследованиях, использующих зебрафиш эмбриональной ксенотрансплантат ангиогенез модели¹⁸. Ксенотранспланты могут быть изображены в любое время до 48 hpi (часы после имплантации).

6. Live Imaging

1. На 48 hpi, определить 3-5 здоровых эмбрионов без отеков. Анестезируйте их в 150 мкг/мл трикаина и смонтировать их боковой в 1% Низкий плавильный пункт (LMP) агарозы, как ранее описано¹⁹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как агарозы затвердевает, используйте микрокапиллярный пипетка отзыв держать эмбрионы расположены боковой.
2. Включите конфокальный микроскоп, контроллер микроскопа, лазеры и компьютерное программное обеспечение для управления микроскопом.
3. Поместите блюдо на конфокальный микроскоп. Используя 20-x увеличение, вода погружения объектив объектив, положение ксенотрансплантата в центре поля с помощью яркого поля изображения.
4. Выберите возбуждающие лазеры, которые подходят для обнаружения красителя, используемого для обозначения опухолевых клеток и фторфора, используемого для обозначения кровеносных сосудов зебры.
5. Отрегулируйте выигрыш для каждого лазера до уровня, который позволяет обнаружить как опухолевые клетки, так и кровеносные сосуды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как конфокальные настройки были установлены, убедитесь, что они остаются неизменными на протяжении всего эксперимента, так что сравнение может быть сделано между ксенотрансвграфами.
6. Используя лазерный канал, подходящий для опухолевых клеток, определите объем, который будет изображен, который включает в себя весь объем ксенотрансплантата, что позволяет, по крайней мере, один или два оптических секций по обе стороны от трансплантата. Используйте интервалы раздела, которые находятся на части примерно на 5 мкм друг от друга, чтобы создать z-стек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы z-стек содержал весь объем ксенотрансплантата.
7. Используя двухканальный образизображения, изображение как опухоли ксенотрансвтат и кровеносные сосуды. Повторите шаги 6.6-6.7 для каждой личинки, чтобы быть изображены.

7. Время Lapse изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель очень подходит для визуализации динамических клеточных процессов из-за его прозрачности и наличия трансгений зебры, которые флуоресцентно маркировать различные типы клеток. Это делает визуализацию замедленной помощью ключевым применением этой модели.

1. Включите экологическую камеру и установите до 34 градусов по Цельсию, по крайней мере 2 ч до изображения. Если камера не увлажняется, добавьте блюда из воды.
2. Анестезия 3-5 эмбрионов (с использованием 120 мкг/мл трикаина на 2 dpf и 100 мкг/мл трикаин на 3 dpf) и смонтировать их боково в 0,8% LMP агароуз для покадровой визуализации в соответствии с ранее описанным протоколом¹⁹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как агарозы затвердевает, используйте микрокапиллярный пипетка отзыв держать эмбрионы расположены боковой.
3. Настройка оборудования и изображения ксенотрансплантата, как описано в шагах 6.2-6.7, приобретая z-stackts ксенотрансплантата с интервалом 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрион должен поддерживаться при 34 градусах Цельсия, как это изображение и E3 на вершине личинок в агаре должны быть проверены и дополнены время от времени, чтобы убедиться, что он не высохнет.

8. Количественная оценка ангиогенного ответа на ксенотрансплант зебрафиш

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги используют программное обеспечение для анализа 3D изображений. Конкретные шаги будут варьироваться в зависимости от используемого программного обеспечения.

1. Перенесите файлы изображения конфокального изображения опухоли в новую папку на программном обеспечении для анализа 3D изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы количественно уровни васокляризации опухоли, Протоколы измерения должны быть созданы с настройками откалиброваны так, что они могут быть использованы для измерения либо объем опухоли или объем судна для всех ксенотрансплантатов.
2. Чтобы создать протокол "Tumor Volume" для измерения объема опухолевых ксенотрансплантатов, перейдите на вкладку "Измерение" в верхнем меню, а затем перетащите протоколы под названием "Найти объекты" из списка протоколов, который появляется на левой стороне окна в пространство который называется "Перетащите задачи здесь, чтобы сделать измерения".
3. Убедитесь, что этот протокол установлен для измерения объектов в опухолевом канале, а затем перетащите протоколы под названием "Клип на ROIs" и "Сделать рентабельность от населения" из списка протоколов в "Перетащите задачи здесь, чтобы сделать измерения" пространство. Убедитесь, что эти две команды применяются к объектам, идентифицированным "Найти объекты".
4. Перед калибровкой настроек этого протокола перейдите в меню выпадения над меткой "Mode" в левом верхнем левом окне и выберите представление "Расширенный фокус".
5. Отберите неопухолевые каналы в стеле справа, нажав на черный круг под каждым заголовком канала, так что можно увидеть только опухолевый канал. Используйте инструмент "Freehand" в верхней части окна, чтобы нарисовать "регион интереса" (ROI) вокруг всего объема опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы убедиться, что ни одна из опухоли не остается вне рентабельности инвестиций. Это обеспечит область, на которой выполняется протокол при калибровке настроек.
6. Выберите метку "Резюме" на панели под изображением и установите опцию "Дисплей", чтобы показать "Население 2". Для калибровки нажмите на звездочку на задаче «Найти объекты», которая откроет окно настроек. Отрегулируйте "Порог" с помощью "Интенсивность" и определения "нижнего" порога до тех пор, пока не будут выбраны только опухолевые клетки, а не фоновая флуоресценция.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно для того, чтобы только флуоресценция из опухолевых клеток в выбранной рентабельности инвестиций (нарисованная в 8,5) обнаружена и ни один из фоновой флуоресценции не измеряется.
7. Определить "Минимальный размер объекта", так что только нетронутые клетки измеряются в отличие от мелких элементов клеточного мусора (например, путем установки "Минимальный размер объекта" как 100 мкм^3). Сохранить этот протокол как "Tumor Volume", нажав на вкладку Измерения в верхнем меню и нажав кнопку "Сохранить протокол", и использовать те же настройки для измерения всех ксенотрансветтов.
8. Для измерения объема ксенотрансплантата связанных кровеносных сосудов, вам нужно будет сделать новый протокол. Перейти к верхней меню, нажмите на вкладку измерения и нажмите "Чистый протокол". Перетащите задачи "Найти объекты" и "Clip to ROIs" в пространство, озаглавленное "Перетащите задачи здесь, чтобы сделать измерения" для этого протокола.
9. Убедитесь, что первая команда настроена на измерение объектов в канале кровеносных сосудов и что следующая команда настроена на объекты, идентифицированные первой командой. Затем отображайте несосудные каналы в крайнем правом стене, чтобы можно было увидеть только кровеносные сосуды.
10. Определите настройки для "Объема судов" аналогичным образом, как и для протокола "Tumor Volume" и сохраните этот протокол как "Объем судов" (см. 8.6-8.7).
11. Очистить протокол и нарисовать рентабельность инвестиций вокруг ксенотрансплантата, заботясь, чтобы не включать какой-либо неопухолевой автофлюоресценции. Измерьте сумму объема объектов в опухолевом канале внутри этой окупаемости, нажав на вкладку Измерения, выбрав команду «Протокол восстановления» и выбрав протокол «Опухолевый объем».
12. Используя новую рентабельность инвестиций, составленную протоколом "Tumor Volume", используйте протокол "Объем судов" для измерения общего объема объектов в канале судна внутри этой рентабельности, нажав на вкладку Измерения, выбрав команду "Восстановить протокол" и выбрав "Vessel Объем" протокол.
13. Разделите объем сосуда на объем опухоли и умножьте ответ на 100, чтобы получить процентное значение трансврант-васкуляризации.
14. Повторите шаги от 8.11 до 8.13 для всех остальных ксенотрансплантов.

Результаты

С помощью изображения индивидуального ксенотрансплантата на 6, 24 и 48 hpi, ангиогенный ответ в разных точках времени может быть рассчитан, как показано на рисунке 1A-C. Самый большой ангиогенный ответ наблюдается между 24-48 ч после имплантации, с мак...

Обсуждение

Первым важным шагом в протоколе является имплантация опухолевых клеток. Очень важно, чтобы клетки вводились в место, которое позволит ксенотрансплантатуспешно успешно имплантировать в эмбрион, не делая эмбрион отек. Инъекция, которая является слишком передней может позволить клеткам...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air cylinder	BOC	011G	Xenotransplantation
B16-F1 cells	ATCC		Cell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)	Corning	356235	Xenotransplantation
Borosillicate glass capillaries	Warner Instruments	G100T-4	OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection
Cell culture dish 35 mm diameter	Thermofisher NZ	NUN153066	Fish husbandry
Cell culture dish 100 mm diameter	Sigma-Aldrich	CLS430167-500EA	Fish husbandry
Cell culture flask 75 cm2	In Vitro Technologies	COR430641	Cell culture
CellTracker Green	Invitrogen	C2925	Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH	In house [1]		Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1,000 μL	VWR	732-1491	Used during multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	732-1489	Used during multiple steps
Filter tip 10 μL	VWR	732-1487	Used during multiple steps
Fluorescence microscope	Leica	MZ16FA	Preparation of embryos
FBS (NZ origin)	Thermofisher Scientific	10091148	Cell culture
Gloves	Any commercial brand		Used during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer	HawksleyVet	AC1000	Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge	Thermofisher Scientific	75004500	Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342	Thermofisher Scientific	62249	Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure Agarose	Thermofisher Scientific	16520050	Imaging
Methycellulose	Sigma-Aldrich	9004 67 5	Xenotransplantation
Methylene blue	sigma-Aldrich	M9140	Fish husbandry
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries	Eppendorf	5242956003	Xenotransplantation
Micropipettes	Any commercial brand		Used during multiple steps
Micropipette puller P 87	Sutter Instruments		Xenotransplantation
Microscope cage incubator	Okolab		Time-lapse imaging
Microwave	Any commercial brand		Imaging
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M3516	Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) - alpha	Thermofisher Scientfic	12561056	Cell Culture
MPPI-2 Pressure Injector	Applied Scientific Instrumentation		Xenotransplantation
Narishige micromanipulator	Narishige Group		Xenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope	Nikon		Imaging
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Fish husbandry
PBS	Gibco	10010023	Cell culture
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	Cell culture
S1 pipet filler	Thermoscientific	9501	Cell culture
Serological stripette 10 mL	Corning	4488	Cell culture
Serological stripette 25 mL	Corning	4489	Cell culture
Serological stripette 5 mL	Corning	4485	Cell culture
Serological stripette 2 mL	Corning	4486	Cell culture
Terumo Needle 22 G	Amtech	SH 182	Fish husbandry
Tissue culture incubator	Thermofisher Scientfic	HeraCell 150i	Cell culture
Tivozanib (AV951)	AVEO Pharmaceuticals		Drug treatment
Transfer pipette 3 mL	Mediray	RL200C	Fish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25%)	Life Technologies	T4049	Cell culture
Tweezers	Fine Science Tools	11295-10	Fish husbandry
Volocity Software (v6.3)	Improvision/Perkin Elmer		Image analysis