В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия

Резюме

Эта статья представляет собой полезный анализ in vitro для оценки способности условной среды из опухолевых клеток для привлечения макрофагов.

Аннотация

Опухолевые макрофаги (TAMs) составляют большой процент клеток в опухолевой массе для различных видов рака. Глиобластома (ГБМ), злокачественная опухоль головного мозга без лечения, имеет до половины опухолевой массы TAMs. TAMs может быть проопухолевым или противоопухолевым, в зависимости от активации конкретных генов в клетках. Генетические мутации в опухолях, путем регулирования экспрессии цитокинов, могут повлиять на набор TAMs в микросреду опухоли. Здесь мы описываем количественный анализ на основе клеток для оценки набора макрофагов условным средством из опухолевых клеток. Этот анализ использует человеческую линию макрофагов MV-4-11 для изучения притяжения макрофагов условной средой от глиобластомы, что позволяет к высокой воспроизводимости и низкой изменчивости. Данные, генерируемые с помощью этого анализа, могут способствовать лучшему пониманию взаимодействия между опухолью и микроокружением опухоли. Подобный ассс может быть использован для оценки взаимодействия между опухолевыми клетками и другими иммунными клетками, включая Т-клетки и естественные клетки-убийцы (НК).

Введение

Макрофаги являются иммунными клетками с высокой фенотипической и функциональной неоднородностью^1. Они играют важную роль в системах защиты хозяина, ремонт тканей, развитие и прогрессирование опухоли¹. TAMs являются макрофагами в микросреде твердых опухолей. Некоторые TAMs может способствовать росту опухоли путем ингибирования Т-клеточной цитотоксичной активности, модулируя микросреду опухоли (TME), способствуя ангиогенез, вторжение и метастазы^{2,3,4, 5}. TAMs являются одними из наиболее распространенных типов клеток в TME и большее количество TAMs обычно коррелирует с хуже выживания пациента во многих типах твердых опухолей⁶. Различные генетические подписи опухолевых клеток влияют на их способность набирать макрофаги. В GBM, агрессивная опухоль мозга без лечения, макрофаги могут представлять до половины массы опухоли⁷. Совместное усиление рецептора эпидермального фактора роста(EGFR)и его усечения мутанта EGFRvIII часто наблюдается в ГБМ, что дает преимущества роста опухоли⁸. Клетки, совместно выражающие EGFR и EGFRvIII, привлекают больше макрофагов посравнению с клетками, выражающими EGFR или EGFRvIII singly 7.

Chemokines представляют собой семейство небольших цитокинов, которые играют значительную роль в регулировании иммунного состава в TME^6,9. Клетки человека выражают более 50 цитокинов^10. Иммунная инфильтрация в опухолях в значительной степени реализуется путем взаимодействия между цитокинов и цитокиновых рецепторов¹¹. Каждый тип иммунных клеток выражает различные рецепторы хемокина /хемокины и могут быть завербованы клетками, выделяющими специфические хемокины/хемокиновых рецепторы^12. Раковые клетки могут увеличить экспрессию некоторых хемокины для вербовки иммунных клеток, таких какTAMs, регулятивные Т-клетки и миелоидные супрессорные клетки (MDSCs) 6. Блокада специфического хемокина, выделяемого опухолями, может быть многообещающим способом ингибирования проникновения иммунных клеток в опухольную массу.

Здесь мы описываем протокол, который позволяет в пробирке оценки взаимодействия опухолево-макрофагов, используя условные средства из опухолевых клеток, содержащих хемокины и макрофаг клеточные линии.

протокол

1. Средняя подготовка

1. Приготовление среды стволовых клеток, свободных от сыворотки,
   1. Оттепель 50x B27 дополнения, эпидермальный фактор роста (EGF, 20 мкг/мл в 10 мм уксусной кислоты с 0,1% BSA), и фактор роста фибробластов (FGF, 20 мкг/мл в 10 мм уксусной кислоты с 0,1% BSA).
   2. Добавьте 500 л EGF (окончательная концентрация 20 нг/мл), 500 л FGF (окончательная концентрация 20 нг/мл), 10 мл 50x B27 до 500 мл л. модифицированной орла Dulbecco Средний /Питательный Mixture F-12 (DMEM/F12) и 5 мл 100x пенициллина/стрептомицина (Pen/Strep). Перевернуть бутылку 4-6 раз, чтобы перемешать, фильтр стерилизовать через 500 мл 0,1 мкм фильтрации чашки. Отметьте бутылку и храните при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда хороша для использования в течение месяца при 4 градусах Цельсия.
2. Подготовка MV-4-11 культуры среды: Добавить 50 мл сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) до 500 мл Исковва модифицированных Dulbecco в среднем (IMDM). Перевернуть бутылку 4-6 раз, чтобы перемешать, фильтр стерилизовать через 500 мл 0,1 мкм фильтрации чашки. Отметьте бутылку и храните при 4 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда хороша для использования в течение месяца при 4 градусах Цельсия.
3. Подготовка среды обслуживания опухолевых клеток: Добавить 50 мл FBS до 500 мл модифицированного орла среднего Dulbecco (DMEM). Перевернуть бутылку 4-6 раз, чтобы перемешать, фильтр стерилизовать через 500 мл 0,1 мкм фильтрации чашки. Отметьте бутылку и храните при 4 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда хороша для использования в течение месяца при 4 градусах Цельсия.

2. Подготовка клеток

День 1:

1. Таяние опухолевых клеток
2. Разогрейте среду обслуживания опухолевых клеток (как описано в шаге 1.3) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
3. Возьмем замороженные u87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII и U87:EGFR-EGFRvIII из резервуара с жидким азотом. Оттепель клетки на 37 градусов воды в течение 2 минут.
   ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при взятии клеток из резервуара с жидким азотом. Носите перчатки с тепловой защитой и защитными очками по мере необходимости.
4. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами.
5. Спрей криогенные флаконы, содержащие клетки и средняя бутылка с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами, и принести их в ткани культуры капот.
6. Pipette 5 mL поддержания опухолевых клеток среднего в 15 мл стерильной центрифуги трубки. Перевернуть трубку, содержащую опухолевые клетки 4-6 раз, чтобы смешать. Пипетка все клетки в 15 мл центрифуги трубки. Перевернуть центрифугу трубки 4-6 раз, чтобы перемешать.
7. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
8. Вымойте клетки 10 мл фосфатного буферного солья (PBS). Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
9. Resuspend клетки в 12 мл среднего обслуживания опухолевых клеток (как описано в шаге 1.3). Пипетка вверх и вниз 3-5 раз, чтобы смешать. Перенесите клетки в колбу культуры Т75.
10. Выращивайте клетки в инкубаторе 37 градусов с 5% CO_2. Положите средний уровень обслуживания опухолевых клеток обратно в холодильник 4 градусов по Цельсию.

День 2:

2. Проверьте клетки под микроскопом. При необходимости измените среду. Клетки должны расти в монослой в культуре.

День 3:

3. Таяние MV-4-11 клеток
   1. Разогрейте культурную среду MV-4-11 (как описано в шаге 1.2) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MV-4-11 может быть изменен на первичные макрофаги или другие линии клеток макрофагов, в зависимости от необходимости конкретного исследования.
   2. Возьмите замороженные MV-4-11 клетки из резервуара с жидким азотом. Оттепель клетки на водяной бане 37 градусов в течение 2 мин.
      ПРЕДЕКТО: Будьте осторожны при взятии клеток из резервуара с жидким азотом. Носите перчатки с тепловой защитой и защитными очками по мере необходимости.
   3. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами.
   4. Спрей криогенные флаконы, содержащие клетки и средняя бутылка с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами, и принести их в ткани культуры капот.
   5. Пипетка 5 мл культуры MV-4-11 (как описано в шаге 1.2) в стерильной центрифуге 15 мл. Перевернуть трубку, содержащую опухолевые клетки 4-6 раз, чтобы смешать. Пипетка все клетки в 15 мл центрифуги трубки. Перевернуть центрифугу трубки 4-6 раз, чтобы перемешать.
   6. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
   7. Вымойте клетки в 10 мл PBS и центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 минут при 4 c. Аспирируй супернатанта.
   8. Повторное действие клеток в 12 мл культуры MV-4-11 среды (как описано в шаге 1.2). Аккуратно пипетка вверх и вниз 3-5 раз, чтобы смешать. Перенесите клетки в колбу культуры Т75.
   9. Выращивайте клетки в инкубаторе 37 градусов с 5% CO_2.
4. Разделение опухолевых клеток
   1. Разогрейте среду стволовых клеток, свободных от сыворотки (как описано в шаге 1.1) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
   2. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами. Возьмите раствор отслоения клетки из холодильника. Спрей среднего и клеточного отслоения раствор бутылки с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами и принести их в ткани культуры капот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не разогревайте раствор аккутазы.
   3. Перенос культуры опухолевых клеток из инкубатора в капюшон культуры тканей. Прибавьте среду, добавьте 2 мл раствора отслоения клеток в колбу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промыть pbS перед добавлением аккутазы является необязательным здесь.
   4. Установите колбу в капюшоне. Проверьте, каждую минуту опухолевые клетки округляются. Как только опухолевые клетки округляются, осторожно коснитесь стороны колбы, чтобы помочь клеткам отделиться от колбы.
   5. Пипетка 8 мл сыворотки свободной стволовых клеток среды в колбу, пипетка вверх и вниз 3 раза, чтобы смешать, и передать клетки в 15 мл стерильной центрифуги трубки. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
   6. Вымойте клетки в 10 мл PBS. Пипетка вверх и вниз 3-5 раз, чтобы смешать. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным.
   7. Приостанавливайте действие клеток в 10 мл среды стволовых клеток, свободных от сыворотки (как описано в шаге 1.1). Пипетка вверх и вниз 3-5 раз, чтобы смешать. Возьмите 10 л клеток и смешайте с 10 злитровых раствора Trypan Blue. Пипетка 10 л смеси в счетслайд, количественно живой номер ячейки с помощью автоматического счетчика клеток.
   8. Отрегулируйте плотность клеток до 2,5 х 10⁵ клеток/мл со средой стволовых клеток, свободных от сыворотки (как описано в шаге 1.1), и семенами 2 мл клеток в каждую скважину 6-хорошей пластины клеточной культуры. Для каждого типа клеток, семян 3 скважины (тройной образец). В то же время, подготовить 6 скважин с 2 мл сыворотки свободной стволовых клеток среды только (без клеток).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы будут использоваться: 1) в качестве отрицательного контроля и 2) для регулировки условного среднего объема на основе номеров клеток.
   9. Положите 6-колодец пластин в инкубатор 37 градусов с 5% CO₂. Разрешить клетки расти в течение 24 ч.

3. В пробирке Макрофаг Привлечение Анализ

1. Подготовка условных носителей
   1. Разогрейте среду обслуживания опухолевых клеток (как описано в шаге 1.3) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
   2. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами. Возьмите раствор отслоения клетки из холодильника. Спрей бутылки среды и раствор отслоения клеток с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами и принести их в ткани культуры капот.
   3. Вынизвините из инкубатора 6-колодливые пластины. Тщательно пипетка кондиционированных носителей в 15 мл стерильных центрифуг труб. Поставьте трубки на лед. Pipette средств в «средствах только» наилучшим образом в отдельно пробку центрифуги 15 mL стерильной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим шагом, убедитесь, что проверить под микроскопом, чтобы увидеть, если клетки прикрепляются. Если нет, можно использовать покрытые пластины на шаг 2.4.8, чтобы лучше вложения или включить плавающие ячейки в шаге подсчета.
   4. Добавьте 0,5 мл раствора отслоения клеток в каждую скважину 6-колодца. Проверьте, каждую минуту опухолевые клетки округляются. После того, как опухолевые клетки округлить вверх, осторожно нажмите сторону пластины, чтобы помочь клеткам отделиться.
   5. Пипетка 2,5 мл поддержания опухолевых клеток среднего в колодец, пипетка вверх и вниз 3 раза, чтобы смешать и передать клетки в 15 мл стерильной центрифуги трубки. Возьмите 10 л клеток и смешайте с 10 злитровых раствора Trypan Blue. Пипетка 10 л смеси в счетслайд и количественно количество живых клеток с помощью автоматического счетчика клеток.
   6. Отрегулируйте громкость условных носителей в соответствии с номером клетки с помощью среды стволовых клеток, свободной от сыворотки (37 градусов по Цельсию на ночь). Например, если Well A имеет в 3 раза больше живых клеток, а также скважину с наименьшим количеством клеток, разбавьте его условные носители 1:3. Этот шаг используется для контроля разницы, вызванной скоростью пролиферации клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Причина использовать сыворотку свободной среде стволовых клеток с 37 КК инкубации в одночасье заключается в том, чтобы контролировать возможные изменения в средствах массовой информации с длительным 37 кС воздействия.
   7. Фильтр условных носителей через 0,45 мкм фильтры. Положите условные носители на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг удаляет клетки и мусор клеток в условных носителях.
2. Приготовление клеток MV-4-11
   1. Разогрейте среду IMDM (без FBS) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
   2. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами. Спрей средней бутылки с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами и принести их в ткани культуры капот.
   3. Возьмите колбу MV-4-11 клеток в капюшон культуры ткани. Пипетка 10 мл клеток в стерильной центрифуге 15 мл. Возьмите 10 л клеток и смешайте с 10 злитровым раствором Trypan Blue. Пипетка 10 л смеси в счетслайд и количественно количество живых клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 c. Аспирируй супернатанта.
   4. Вымойте клетки с 10 мл PBS и центрифуга клетки на 200 х г в течение 5 минут при 4 c. Аспирируй супернатанта.
   5. Приостанавливайте действие клеток в среде IMDM (без FBS) для конечной плотности клеток 1x10⁶ ячеек/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток макрофагов, используемых здесь, может быть скорректировано.
3. Трансуэлл ассе
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага используйте набор асссов для проведения исследований миграции клеток или купите реагенты и вставьте отдельно. Для ячеек MV-4-11 выберите вставки Transwell с размером поры 5 мкм. Чтобы обнаружить миграцию макрофагов, непосредственно количественно количество макрофагов в нижней камере или использовать колористетриметрические /фторметрические методы. Здесь мы демонстрируем анализ с помощью колориметрического метода.
   1. Доведите 24-колоднюю пластину, вставку и реагенты до комнатной температуры.
   2. Добавьте 250 кЛ ячеек MV-4-11, подготовленных выше, в каждую вставку.
   3. Добавьте 400 кл кв.м. кондиционированной средней/средней только (с ночной инкубации при 37 градусах Цельсия, эти образцы служат отрицательным контролем) в нижние камеры 24-хорошей пластины. Для каждой линии опухоли или контроля, используйте тройные образцы. Избегайте пузырьков между вставкой и кондиционированной средой. Пузыри будут препятствовать макрофагам от миграции в нижние колодцы.
   4. Инкубировать пластины в инкубаторе 37 градусов с 5% CO₂ на 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации можно скорректировать. Клетки, мигрирующие в нижние камеры, можно увидеть под микроскопом.
   5. Аккуратно коснитесь вставки на внутренней стене того же колодца и отбросьте вставку. Поскольку клетки MV-4-11 растут в суспензии, раствор отслоения клеток или лечение трипсина здесь не требуется.
   6. Аккуратно пипетка клетки в колодцах вверх и вниз 3 раза, чтобы смешать. Передача 225 л клеточной подвески на черностенную 96-хорошую пластину, подходящую для флуоресцентных измерений.
   7. Разбавить краситель Cyquant 1:75 с 4x лисис буфера. Vortex кратко и спина вниз решение. Добавьте 75 л раствора к каждой скважине из 96-хорошо пластины. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре.
   8. Читайте флуоресценцию, используя фильтр 480/520 нм с флуоресценцией.
   9. Проанализируйте данные, вычитая пробел и нормализации в линии контрольной опухолевой клетки.

Результаты

Результаты обычно показываются с помощью графиков баров (пример показано на рисунке 1). Образцы с высокими значениями 480/520 показывают, что условные носители обладает высокой емкостью для набора макрофагов. В зависимости от экспериментальной потребнос?...

Обсуждение

В этом протоколе есть несколько ключевых шагов: 1) выбор вставки Transwell. Для MV-4-11 клеточной линии, 5 мкм Transwell вставки хорошо работать. Однако, для других клеточных линий, таких как широко используемая линия моноцитов THP-1, другой размер поры может работать лучше. 2) По мере того как по-разному ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 μm filtration cup	Thermo fisher	566-0010
0.45 μm filter unit	Millipore	SLHA033SS
10 mL serological pipettes	Olympus plastics	12-104
15 mL sterile centrifuge tubes	Olympus plastics	28-103
1 mL pipette tip	ART molecular bioproducts	2779-RI
2 mL aspirating pipet	Falcon	357558
24-well plate	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
75 cm2 flask	Corning	430641U
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
Trypan blue	Biorad	1450021