Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши

Резюме

Представлен протокол для изоляции различных подмножеств макрофагов и других неиммунных клеток от миокарда человека и мыши путем подготовки одной клеточной подвески через ферментативное пищеварение. Также представлены схемы идентификации цитометрии потока и характеристики изолированных макрофагов.

Аннотация

Макрофаги представляют собой наиболее неоднородные и обильные популяции иммунных клеток в сердце и занимают центральное место в воспалении и репаративных реакциях после сердечной травмы. Как различные подмножества макрофагов организовать иммунные реакции после сердечной травмы является активной областью исследований. Представлен простой протокол, который наша лаборатория выполняет регулярно, для извлечения макрофагов из мыши и человеческих образцов миокарда, полученных от здоровых и больных людей. Кратко, этот протокол включает в себя ферментативное пищеварение сердечной ткани для создания одной подвески клеток, а затем окрашивая антитела, и поток цитометрии. Этот метод подходит для функциональных анализов, выполняемых на отсортированных клетках, а также для секвенирования РНК навалом и одноклеточной РНК. Основным преимуществом этого протокола является его простота, минимальная повседневная вариация и широкая применимость, позволяющая исследует неоднородность макрофагов в различных моделях мыши и человеческих заболеваниях.

Введение

Макрофаги представляют собой наиболее распространенный тип иммунных клеток в сердце, и они играют важную роль в генерации надежных воспалительных и репаративных реакций после сердечной травмы^1,2,3,4. Ранее наша группа определила два основных подмножества макрофагов в сердце мурина, полученных из различных происхождения развития^5,6. В целом, различные популяции тканей резидентов сердечных макрофагов подмножества могут быть определены на основе экспрессии поверхности клетки CCR2 (C-C мотив хемокин рецептор 2). CCR2^- макрофаги (выражение поверхности клетки: CCR2^-MHCII^низкий и CCR2^-MHCII^high) имеют эмбриональное происхождение (примитивные и эритромиелоидные линии), способные к самообновлению и представляют доминирующую популяцию в гомеостатичных условиях. Резидент CCR2^и макрофаги имеют окончательное гематопоиетическое происхождение, поддерживаются путем набора из циркулирующих моноцитов, и представляют незначительную популяцию в гомеостатических условиях. Функционально, CCR2^- макрофаги генерировать минимальное воспаление и имеют решающее значение для коронарного развития неонатальной регенерации сердца^5,7. В отличие от этого, CCR2^и макрофаги инициировать надежные воспалительные реакции после сердечных оскорблений и способствовать залога травмы кардиомиоцитов, неблагоприятное ремоделирование левого желудочка, и сердечная недостаточность прогрессии^8,9.

Недавно мы показали, что миокард человека также содержит два различных подмножества макрофагов, идентифицированных аналогичным образом как CCR2^- или CCR2^No8. Экспрессия генов и функциональный анализ показали, что макрофаги CCR2^{человека и} CCR2 представляют функционально расходящиеся подмножества и функционально аналогичны CCR2^- и^{макрофагам} CCR2, найденным в сердце мыши. Человеческий CCR2^- макрофаги выражают устойчивые уровни факторов роста, включая IGF1, PDGF, Cyr61 и HB-EGF. Макрофаги CCR2^и обогащаются в химокинах и цитокинах, которые способствуют воспалению, таким как IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 и TNF-a. Стимулированные CCR2^- макрофаги выделяют заметно более высокие уровни воспалительного цитокина интерлейкина-1 " (IL-1") в культуре. Как эти подмножества дифференарно способствуют восстановлению тканей и ремоделирования левого желудочка (LV) в контексте сердечной травмы остается областью активных исследований.

Поток-цитометрия на основе анализа макрофаг неоднородности в мыши и человеческого сердца требует переваривания сердечной ткани и генерации одной клеточной подвески с последующим циклометрическим анализом потока или сортировкой клеток для дальнейших процессов вниз по течению, таких как массовое секвенирование РНК/одноклеточная РНК секвенирования или культивирование клеток для функциональной анализа. Первоначальный протокол для принятия одной ячейки подвески из сердца murine были впервые сообщили nahrendorf группы в Nahrendorf и др. 2007¹⁰. Наша лаборатория адаптировала и модифицировала протокол для извлечения макрофагов из миокарда человека. Используя тот же протокол, но с небольшимизменением в схеме окрашивания и gating, CD45^- стромальные клетки из миокарда человека также могут быть собраны. Представленный здесь, в тексте и видео, протокол, который выполняется регулярно для извлечения макрофагов или стромальный из человеческой миокарда.

Образцы сердечной ткани получают сяритогецы у взрослых пациентов с расширенной кардиомиопатией (DCM: идиопатической или семейной) или ишемической кардиомиопатией (ИКМ), проходящими левожелудочковой вспомогательной помощью (LVAD) имплантации или трансплантации сердца. Выслаженные сердца или сердечники LVAD внутриваскулярно пронизаны холодным сольнием до начала процедуры пищеварения. Важно отметить, что «качество» образца ткани, определяемые с точки зрения степени образования рубцов или инфильтрации жировой ткани, может значительно повлиять на урожайность макрофагов. Образцы сердца с большими областями рубцов будут иметь гораздо более низкую урожайность клеток и могут представлять серьезные технические ограничения, когда желаемые методы анализа вниз по течению требуют культивирования клеток in vitro.

протокол

Представленный протокол был одобрен Вашингтонским университетом в Сент-Луисе (#201305086). Все испытуемые предоставляют информированное согласие перед сбором проб, и эксперименты проводятся в соответствии с утвержденным протоколом исследования. Представленный протокол выполняется с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных в Медицинской школе Вашингтонского университета и соответствует руководящим принципам, описанным в руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка человека сердечных тканей Specimens

1. Флеш высаживал сердца, консервируя левую и правую коронарную артерию ostia и надоеть с 200 мл холодного солевого раствора.
2. Промыть LVAD апикальных корированных тканей, cannulating эпикардиального сосуда и пронзать с 50 мл холодного сольника.
3. Вскрыть образец ткани из апкальной или боковой стенки левого желудочка в холодном солевом растворе или HBSS с помощью стерильных ножниц.
4. Тщательно вскрыть эпикардиальный жир и акдиновые тендины из образца с помощью тонких ножниц.
5. Рассекать куски ткани на куски весом около 200 мг с помощью стерильного лезвия или ножниц.

2. Подготовка мышиного сердца

1. Эвтанизировать мышь путем удушья CO₂ или вывихшей шейки матки.
2. Откройте грудную полость с помощью острых ножниц. Используйте тупые гемостаты, чтобы поднять сердце вверх. Пронизыруйте сердце холодным PBS, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 5 мл. Perfuse, пока сердце появляется бланшированный в цвете.
3. Снимите сердце и поместите в стерильную чашку Петри на льду.

3. Подготовка одноклеточной подвески

1. Поместите части сердечной ткани человека (200 мг) или сердце мурин в стерильное блюдо Петри. Мелко фарш ткани с помощью стерильного лезвия или ножницы.
2. Настройка пищеварений:
   1. Используйте окончательный объем пищеварения 3 мл на кусок сердечной ткани человека (200 мг) или на одно сердце мурина. Окончательные концентрации ферментов следующие: Коллагеназе1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).
   2. Для каждой реакции пищеварения добавляйте DMEM и все ферменты в коническую трубку 15 мл. С помощью чистых щипцов, поместите мелко рубленые ткани в каждой реакционной трубки. Хорошо перемешайте нежным вихрем.
3. Дайджест для 1 ч при 37 градусах По Цельсия в тряся инкубаторе установлен на низкой и средней скорости возбуждения.
4. После 1 ч пищеварения, вынуть трубки из инкубатора и поместить на лед. Установите 50 мл конических труб с 40 мкм ячейки ситечко на вершине. Влажные фильтры с 2 мл фермента деактивацивирования (ED) буфера.
5. Деактивируйте ферменты пищеварения, добавив 8 мл буфера ЭД в каждую трубку пищеварения. Затем залить в результате 13 мл общей смеси через 40 мкм ячейки ситечко в 50 мл конических труб. Перенесите образцы обратно в свежую коническую трубку 15 мл. Это обеспечивает оптимальную пеллетирование клеток и сводит к минимуму потерю клеток во время центрифугирования.
6. Спин образцы на 400 х г в течение 6 мин (Центрифуга установлен при 4 кв С). Откажитесь от супернатанта, оставляя 0,5 мл носителей. Отрежируйте клеточные гранулы нежным пайпетированием и добавьте 1 мл буфера асис-лисиса. Аккуратно закружайте трубку и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут для выполнения красная кровь (РБК) лиза.
7. После 5 минут в буфере ACK добавьте 9 мл DMEM в образец. Положите крышку обратно на трубки и осторожно инвертировать трубки, чтобы смешать, и фильтр через 40 мкм ячейки ситечко. Соберите фильтрат в 15 мл конических труб.
8. Центрифуга труб на 400 х г в течение 6 мин и отбросить супернатант.
9. Добавьте 1 мл буфера FACS и приостановите гранулы. Затем перенесите в клетки в буфере FACS в микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Центрифуга снова на 400 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и отбросите гранулы в 100 л буфера FACS. Одноклеточная подвеска теперь готова к окрашиванию антител.

4. Запятнание антител

1. Типичная панель антител человека состоит из следующих антител: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1. Добавьте все антитела к образцам сердца в 1:50 разбавления и инкубировать в течение 30-40 мин при 4 градусах По цельсию в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
2. Для стромальных клеток (эндотелиальных клеток, фибробластов, гладких мышечных клеток) добавьте DRA-5 (1 ММ конечная концентрация) и CD45-percpCy5.5. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1. Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
3. Для макрофагов сердца мурин добавляются следующие антитела: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 и Ly6G-FITC. Пожалуйста, обратитесь к таблице 2. Добавьте все антитела к образцам сердца в 1:100 разбавления и инкубировать в течение 30-40 мин при 4 градусах Цельсия в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
4. Дважды вымойте образцы в буфере FACS. Для каждой стирки добавьте 1 мл буфера FACS, аккуратно вихрь, и центрифуга на 400 х г в течение 5 минут, resuspend в 350 л буфера FACS и добавить DAPI (1 ММ, окончательная концентрация). Образцы теперь готовы для анализа/сортировки FACS.

Результаты

Описанный протокол позволяет отделять макрофаги от мыши и миокарда человека. Используя тот же протокол, но с другой стратегией окрашивания и гатинга, стромальные клетки также могут быть собраны из миокарда человека. Результаты FACS, представленные здесь, были приобрете...

Обсуждение

Протокол позволяет извлечения различных подмножеств макрофагов из миокарда человека. Протокол прост и занимает от 3 до 4 часов, чтобы подготовить одноклеточную подвеску, готовую к анализу FACS. Хотя протокол относительно прост в исполнении, есть определенные технические аспекты, которые...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conocal Tubes	Thermo Fisher	14-959-53A
40 µm Cell Strainers	Thermo Fisher	50-828-736
50 mL Conical Tubes	Thermo Fisher	352098
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2058
Collagenase 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
DNAse 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0.5 M pH 8	Corning	46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer			490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer			976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M)
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3840201
Forceps	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
Hemostats	VWR	63042-052
Hyaluronidase type 1-s	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
Petri dishes	Thermo Fisher	172931
Razor Blade	VWR	55411-050
Scissors	VWR	82027-578