Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm Caenorhabditis elegans

Резюме

Здесь мы представляем протокол для простой изоляции конкретных групп живых нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок из трансгенных линий Caenorhabditis elegans. Этот метод позволяет различные исследования ex vivo сосредоточены на конкретных нейронов и имеет возможность изолировать клетки для дальнейшего краткосрочного культивирования.

Аннотация

В процессе старения многие клетки накапливают высокий уровень повреждений, приводящих к клеточной дисфункции, которая лежит в основе многих гериатрических и патологических состояний. Постмиотические нейроны представляют собой основной тип клеток, пострадавших от старения. Хотя существует несколько моделей старения нейронов млекопитающих, их установить сложно и дорого. Круглый червь Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения старения нейронов, так как эти животные имеют короткую продолжительность жизни, доступнынадежный генетический инструментарий, и хорошо каталогизированной нервной системы. Представленный в данном случае метод позволяет беспрепятственно осваить конкретные клетки на основе экспрессии трансгенного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Трансгенные линии животных, выражающие GFP под различными, клеточными типами,специфическими промоутерами, усваиваются для удаления внешней кутикулы и мягко нарушаются для производства шлама, содержащего различные типы клеток. Клетки интереса после этого отделены от non-target клеток через флуоресцентно-активированную сортировку клетки, или anti-GFP-соединенными магнитными шариками. Изолированные клетки могут быть культивированы в течение ограниченного времени или немедленно использованы для клеточного анализа ex vivo, таких как транскрипционный анализ количественного ПЦР в реальном времени. Таким образом, этот протокол позволяет быстро и надежный анализ клеточных реакций в различных нейронных популяций в C. elegans.

Введение

За последние несколько десятилетий, метазоановый модель организма Caenorhabditis elegans был огромный актив в изучении нейронов, нейронных схем и его роль в физиологических и поведенческих реакций, и старение связанных нейродегенеративных Заболеваний. Уникальной особенностью C. elegans является то, что животные прозрачны, что позволяет для линии всех взрослых соматических клеток, которые будут отображены¹. C. elegans также гавани управляемое количество нейронов, что приводит к морфологии и подключения нервной системы хорошо понимается². Инвариантная клеточная линия, короткая продолжительность жизни и обилие высокопроизводительных генетических инструментов, доступных для C. elegans, делают его идеальным модельным организмом для изучения старения в различных нейронных популяциях.

Старение нейронов и нейродегенеративных расстройств являются сложными, и каждое расстройство имеет уникальные патологические подписи, связанные с ним. Однако, для многих из этих расстройств, таких как болезнь Паркинсона и болезни Альцгеймера, общей чертой является прогрессирующая нагрузка неправильно сложенных белков^3,4,5. В обоих этих заболеваний, белки неправильно и совокупности в клетке, чтобы вызвать токсичность, в конечном счете, приводит к гибели клеток^4,5. Для правильного старения нейронов важен гомеостаз митохондрий, в частности белковый гомеостаз, так каквозмущения и дисхомеостаз могут привести к нейродегенерации 6,^7,8. Клетки оснащены различными механизмами для поддержания белка гомеостаза, один из которых разворачивается ответ белка (UPR) - классический путь, где сигналы от эндоплазмического ретикулума (ER) активировать внутриклеточного сигнала каскадов, что приводит к транскрипции ответ⁹. Сродни этому UPR^ER, метазоаны отображают аналогичный ответ на потерю митохондриального белка гомеостаза, так называемого митохондриального УПО (UPR^mt)^7,8. C. elegans, как представляется, наиболее базальный организм, чтобы иметь подтвержденный и четко определенный путь UPR^{MT 7}.

Функция /дисфункция конкретных нейронных популяций в рамках более широкой сети может быть трудно оценить из-за их внутренней связи и сложности³. Тем не менее, часто необходимо изучить различные нейронные популяции из-за клеточных типконкретных заболеваний со сложными патологиями, таких как те, которые связаны с нарушениями клеточного белка гомеостаза. В C. elegans, конкретные нейронные популяции могут быть генетически манипулировать позволяет легкого наблюдения in vivo. Нервная система C. elegans в основном состоит из нейронов, с небольшим процентом глиальных клеток. У взрослых червей гермафродита, Есть около 302 нейронов, подразделяются на более чем 100 различных классов^2,10. Нейроны, такие как холинергические нейроны преобладают в нервно-мышечных узлов, в то время как дофаминергические нейроны в первую очередь участвуют в сенсации^10,11. Как двигательная активность и сенсорные способности снижаются с возрастом, важно подробно механистические идеи о дефектах в этих отдельных нейронов^11,12. Таким образом, существует необходимость в простой и надежный метод для изоляции нетронутых клеток, представляющих интерес для последующих исследований ex vivo.

Здесь мы описываем оптимизированный эффективный метод быстрой изоляции специфических нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок (ГФП) от C. elegans. Этот метод изоляции может быть выполнен на личинки, несовершеннолетних или взрослых червей. Изоляция клеток от личинок червей была ранее опубликована Чжан и др.¹³ и не будет обсуждаться здесь. Важно отметить, что все черви должны быть на одной стадии жизни, чтобы предотвратить переваривание животных или загрязнения от животных в различных стадиях жизни. Через ферментативные и механические нарушения кутикулы нематод, экзоскелет с высоким содержанием коллагена и других структурных белков, широкий спектр клеток могут быть изолированы^13,14. Клетки могут быть изолированы через цитометрию потока или антитела помечены магнитные бусы. Как правило, РНК изолирована с помощью фенола и гуанидина изотиоцианата метод для обеспечения обогащения желаемой популяции клеток¹⁵. С большой осторожностью эти изолированные клетки могут быть сохранены в культуре колбу или несколько хорошо блюдо. Этот метод представляет собой уникальный и мощный инструмент в изучении конкретных нейронов и имеет возможность изолировать живые и функциональные клетки для дальнейшего культивирования.

протокол

1. Подготовка и сбор выдержанного червей для клеточной изоляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Объясняется ниже изоляция холинергических нейронов от трансгенных unc-17::GFP штамм (OH13083) полученные из Caenorhabditis Genetics Center (CGC) деформации репозиторий в Университете Миннесоты. Крайне важно поддерживать стерильные условия для предотвращения загрязнения от грибков или бактерий.

1. Подготовка и синхронизация червей с помощью метода отбеливания, как описано Т. Stiernagle¹⁶. Для экспериментов по старению, пластины червей на нематод среднего роста (NGM) пластины, содержащие 25 мкм водного раствора фтородеоксюридин (FuDR), чтобы уменьшить производство яиц и остановить яйцеклетки штриховки. Регулярно проверяйте агарные пластины, чтобы предотвратить загрязнение или вылупление яиц, так как это приведет к ненадежным результатам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для unc-17::GFP клетки, как правило, три 100 мм х 15 мм NGM пластины используются для изоляции достаточное количество клеток интерес¹⁶.
2. Собирайте червей и подготовьте буферы для изоляции клеток.
   1. Соберите червей в конической трубке 15 мл. Вымойте червей из тарелки с 1,5 мл буфера M9 (1 мМ MgSO₄, 85 мМ NaCl, 42 mM Na₂HPO₄7H₂O, 22 мМ KH₂PO, pH 7.0) и центрифуга для 5 мин на 1600 х г. Откажитесь от супернатанта и вымойте червей с 1 мл буфера M9. Повторите центрифугацию и мыть в общей сложности пять раз, чтобы удалить как можно больше e. coli загрязнения, как это возможно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков (50 мкг/мл), таких как ампициллин, на этом этапе может помочь уменьшить бактериальное загрязнение.
   2. Для двух образцов, подготовить 2 мл натрия dodecyl сульфат-дитиотрейтол (SDS-DTT) лиза буфера: 200 мм DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 мМ HEPES (pH 8.0), и 3% (w/v) сахарозы.
   3. Приготовьте 15 мл изоляционного буфера (118 мМ NaCl, 48 мм KCl, 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂, 25 мМ HEPES (pH 7.3) и храните его на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как sDS-DTT lysis буфер и изоляция буфер должен быть свежим перед каждым экспериментом.
3. Нарушение кутикулы и одноклеточная изоляция
   1. Центрифуга животных, собранных в шаге 1.2.1 за 5 мин при 1600 х г. Удалите все супернатанты и приостановить червей в 1 мл M9 средств массовой информации и передачи на 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
   2. Гралет черви с центрифугированием на 1600 х г в течение 5 мин.
   3. Добавьте 200 зЛ буфера лисиса SDS-DTT к червям и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Черви должны казаться "подмигнул" вдоль тела, если рассматривать под легким микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие буфера лиза SDS-DTT может привести к гибели червей, которые могут контролироваться путем наблюдения за червями. Черви, которые мертвы удлинит и не будет скручиваться.
   4. Добавьте 800 л ледяного изоляционного буфера и смешайте, аккуратно щелкнув трубкой.
   5. Гранулы черви в течение 1 мин при 13000 х г при 4 градусах Цельсия, удалить супернатант и промыть 1 мл изоляционного буфера.
   6. Повторите шаг 1.3.5 в общей сложности пять раз, тщательно удаляя буфер изоляции каждый раз.
   7. Добавьте 100 л смеси протеазы из Streptomyces griseus (15 мг/мл)(Таблицаматериалов), растворенного в изоляционном буфере, в пеллету и инкубировать в течение 10-15 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с буфером лизиса SDS-DTT, расширенное пищеварение протеазы может привести к чрезмерному расщеплению белков вдоль плазменной мембраны, предотвращая изоляцию поверхностного воздействия GFP с помощью магнитных бусинок.
   8. Во время инкубации с помощью смеси протеазы нанесите механические нарушения, прокладав образцы вверх и вниз по дну микроцентрифуговой трубки 1,5 мл с наконечником микропипетка 200 мл в течение 60-70 раз. Держите кончик пипетки против стенки микроцентрифуги трубки с постоянным давлением, чтобы правильно отмежеваться клетки.
   9. Чтобы определить стадию пищеварения, удалите небольшой объем (1-5 л) смеси пищеварения, опустите ее на стеклянную горку и осмотрите его с помощью микроскопа культуры тканей. После инкубации от 5–7 минут фрагменты червя должны иметь заметно ежемое кутикулу, и суспензия клеток будет легко видна.
   10. Остановить реакцию с 900 зл и с помощью доступных холодных Лейбовиц L-15 среды дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и пенициллина-стрептомицина (окончательная концентрация на 50 U/mL пенициллин и 50 мкг/мл streptomycin).
   11. Пеллеты изолировали фрагменты и клетки центрифугированием в течение 5 мин при 10 000 х г при 4 градусах Цельсия. Вымойте гранулированные клетки с 1 мл холодных L-15-дополненных носителей в два раза больше, чтобы обеспечить избыток мусора и кутикулы удаляется.
   12. Отдохните пеллетные клетки в 1 мл L-15-дополненных носителей и оставить на льду в течение 30 минут. Возьмите верхний слой, примерно 700-800 л, в трубку микроцентрифуга. Этот слой содержит клетки без клеточного мусора и будет использоваться в последующей изоляции клеток, представляющих интерес.
   13. Следуя инструкциям производителя, используйте автоматический счетчик клеток или гемоситометр для измерения плотности клеток в 10–25 л изолированных клеток.

2. Изоляция GFP-положительных клеток через цитометрию потока или анти-GFP магнитные бусы

ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два метода, которые могут быть развернуты для изоляции определенных типов клеток. Первый метод заключается в использовании флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS), в то время как второй метод использует антитела конъюгированные магнитные бусы для пула клеток, выражающих различные плазменные мембраны локализованных белков. Последний метод требует локализации GFP в плазменной мембране, таким образом, доступны для взаимодействия с антителами связанных магнитного биса.

1. Изоляция GFP-положительных клеток цитометрией потока
   1. Из изолированной суспензии клеток, собранной в шаге 1.3.12, центрифуги клетки в течение 5 минут при 10000 х г при 4 c. Откажитесь от супернатанта и приостановить гранулированных клеток в L-15-дополненной среде к плотности клеток не более 6 х 10⁶ клеток / мл, чтобы избежать перегрузки цитометра потока.
   2. Сортировать клетки по GFP-положительному выражению с помощью цитометра потока, способного сортировать образцы. GFP-отрицательные клетки могут быть использованы в качестве контроля для неклеточного типа конкретного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как уже упоминалось выше, альтернативный подход к изоляции GFP-положительных клеток может быть использован, если GFP-тегами белка интерес локализована в плазменной мембране клеток. В этом случае протокол, описанный в разделе 2.2, может быть использован.
2. Изоляция GFP-положительных клеток с помощью анти-GFP магнитных бусин
   1. Из изолированной суспензии клеток, собранной в шаге 1.3.12, центрифуги клетки в течение 5 минут при 10000 х г при 4 c. Откажитесь от супернатанта и приостанавливают клетки в 485 Л L L-дополненной среды L-15. Добавьте к раствору 15 qL ddH₂O предварительно промытых в растворе антитела, связанные с антителами.
   2. Инкубировать клетки с магнитной суспензией на 4 кв. м на 1 ч с очень нежным поворотом. Чрезмерное поворотное повреждение клеток.
   3. После инкубации, центрифуга образца в течение 5 мин при 10000 х г при 4 кв С, затем мыть гранулы 2x с 1 мл L-15-дополненный среды для удаления GFP-отрицательных клеток.
3. Культирование изолированных клеток
   1. Плита изолированных клеток в стерильной 6-хорошо многоколодцной пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пластины могут быть покрыты арахисовым лектином для увеличения вложения клеток; однако, если клетки должны быть использованы немедленно, этот шаг может быть проигнорирован.
   2. Поместите пластину в пластиковый контейнер и инкубировать клетки при 20 градусах Цельсия с влажной салфеткой или мягкой бумагой (добавить 50 мкг/мл ампициллин ddH₂O, чтобы обеспечить отсутствие роста бактерий на салфетке), чтобы добавить влаги в клетки. Не инкубировать в инкубаторco_CO 2, так как повышенные уровни CO₂ могут повредить клетки.

3. Флуоресцентная визуализация изолированных GFP-положительных клеток

1. Включите флуоресцентную лампу перевернутого микроскопа с флуоресценцией и дайте ему прогреться около 10 мин.
2. Удалить клеточную культуру из инкубатора и установить на стадии перевернутый микроскоп с флоресценции вложения. Сдвиньте фильтр GFP в канавки под стадией микроскопа.
3. Просмотр ячеек с увеличением 50x. Успешно изолированные GFP-положительные ячейки будут легко видны. Сфотографируйте с помощью вложения камеры на микроскопе.

4. Извлечение РНК из изолированных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Извлечение РНК должно быть выполнено сразу же после клеточной изоляции для обеспечения высокого качества материала. Изолированная РНК может быть использована для производства кДНК и последующего измерения уровней транскрипта количественными ПЦР (qPCR). Все трубки, наконечники и реагенты должны быть без РНЗа, а рабочее пространство должно быть вымыто этанолом до извлечения РНК.

1. Из изолированных клеток, собранных на шаг 2.1.2, центрифуги клеток в 1,5 мл стерильных, RNase свободной микроцентрифуги трубки5 мин при 10000 х г при 4 кс. Если клетки изолированы через магнитные бусины, следуйте сбору клеток, как указано выше.
2. Используя микропипетт, удалите супернатант из центрифугированной микроцентрифуговой трубки и добавьте 100 Зл Л средней M9, чтобы смыть L-15-дополненную среду. Клетки центрифуги 5 мин при 10 000 х г при 4 градусах Цельсия и удаляют супернатант. Чтобы убедиться, что все носители удалены, повторите в общей сложности три стирания тщательно удаления супернатант каждый раз.
3. Добавить 1 мл фенола и гуанидина изотиоцианат раствор(Таблица материалов) в клетки и пипетка подвески вверх и вниз тщательно. Инкубировать смесь на RT в течение 5 мин.
4. После инкубации добавьте 250 фенола и гуанидина изотиоцианата
5. Centrifuge раствор в течение 5 мин при 10000 х г при 25 градусах Цельсия.
6. Тщательно удалите как можно больше верхнего ваквого слоя с помощью микропипетта, не нарушая нижних органических слоев, и перенесите нижний слой на новую микроцентрифугную трубку без 1,5 мл. К новой трубке добавьте 500 л изопропанола и перемешайте, инвертируя трубку. Инкубировать это решение на RT в течение 5 мин.
7. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 20 мин при 25 градусах Цельсия.
8. Сохраняя образцы на льду, удалите как можно больше изопропанола с помощью микропипетта и аккуратно добавьте 1 мл 70% (v/v) этанола в RNase-free ddH₂O в трубку. Убедитесь, что не выбрасывать раствор непосредственно на дно трубки; нанесите этанол/водяную смесь на сторону трубки.
9. Центрифуга при 10 000 х г в течение 5 мин при 25 градусах Цельсия.
10. Удалите большую часть этанола и высушите воздух на льду в течение 3-5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол должен быть удален после этого шага; однако, тщательный осмотр дна пробки важн для того чтобы обеспечить никакой этанол выйдн.
11. После того, как трубка высохнет, добавьте 15-20 л dNase ddH₂O и измерьте концентрацию РНК и чистоту с помощью спектрофотометра на 260 нм длины волны. Чистота образца должна измеряться как соотношение 260 нм/280 нм. Это соотношение должно быть примерно в 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированная РНК может быть заморожена и храниться при -20 градусов по Цельсию. Это, однако, весьма предпочтительнее использовать комплект синтеза кДНК как можно скорее для обеспечения высокого качества производства кДНК. Количественные ПЦР могут следовать с помощью инструкций, предоставляемых производителем термоциклора, используемого в лаборатории.

Результаты

Протокол, описанный здесь, допускает конкретную изоляцию unc-17::GFP-положительных холинергических нейронов от круглого червя C. elegans для последующих исследований ex vivo, таких как профилирование экспрессии генов типа клеток и в конечном итоге кратковременное куль...

Обсуждение

Круглый червь C. elegans является устоявшейся и мощной моделью для изучения нейронального здоровья и болезни². С достаточным и генетическим инструментом для манипулирования этими животными и управляемым количеством точно отображенных различных типов нейронов, большое к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetic beads	MBL	D153-11