JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описаны три экспериментальных подхода к изучению динамики ВИЧ-инфекции у гуманизированных мышей. Первый позволяет изучать события хронической инфекции, в то время как два последних позволяет для изучения острых событий после первичной инфекции или вирусной реактивации.

Аннотация

Гуманизированный рецептор NOD/SCID/IL-2, который являетсянулевой мыши, резюмирует некоторые особенности иммунитета человека, которые могут быть использованы в фундаментальных и доклинических исследованиях инфекционных заболеваний. Здесь описаны три модели гуманизированных иммунодефицитных мышей для изучения динамики ВИЧ-инфекции. Первая основана на внутрипечетической инъекции CD34и гематопоиетических стволовых клеток у новорожденных мышей, что позволяет восстановить несколько кровяных и лимфоидных тканей, ограниченных клетками, а затем инфекцию с эталонным штаммом ВИЧ. Эта модель позволяет контролировать до 36 недель после инфекции и, следовательно, называется хронической модели. Вторая и третья модели называются острыми и реактивационными моделями, в которых периферийные моноядерные клетки крови интраперитонеально вводятся взрослым мышам. В острой модели клетки здорового донора прививаются через интраперитонеальный путь, за которым следует инфекция с эталонным штаммом ВИЧ. Наконец, в модели реактивации клетки ВИЧ-инфицированного донора в рамках антиретровирусной терапии прививаются по внутриперегитонне. В этом случае безнаркотическая среда в мыши позволяет реактивацию вируса и увеличение вирусной нагрузки. В представленных здесь протоколах описывается обычный экспериментальный подход к гуманизированным, иммунодефицитным моделям мыши ВИЧ-инфекции.

Введение

Гуманизированный NOD/SCID/interleukin (IL)-2 рецептора Q-цепиnull (в дальнейшем именуемый huNS q-цепнойnull) мышь модель была широко использована для изучения патогенеза инфекций, аутоиммунных и раковых заболеваний, а также для доклинических исследований лекарств и человеческих клеточных терапии1,2. Эти мыши основаны на не-ожирения диабетической (NOD) фон, с научной мутации и целенаправленной мутации на рецепторЕ IL-2-цепь локус (общий q-цепи для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, и IL-21), которые вызывают серьезные нарушения в развитии мыши T-, B-, и природных киллеров (NK)1. Таким образом, они поддерживают прививок человеческих тканей, человеческих CD34и гематопоитических стволовых клеток (HSCs), и человеческих периферических клеток крови (PBMCs)3,4,5. Кроме того, трансгенное выражение гематопоитических факторов человека, таких как фактор стволовых клеток (СКФ), гранулоцит/макрофаг колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF), и IL-3 способствует инпланировке популяций миелоидов человека6,7,8.

Для исследований в области ВИЧ, несколько huNS-цепинулевой мыши модели были описаны, которые отличаются в штамм мыши, тип человеческих клеток, используемых, тип тканей для прививки, и происхождение клеток (т.е., здоровые против. ВИЧ-инфицированный донор)9,10. Оригинальный штамм, однако, широко используется из-за высокого уровня человеческих клеток прививок и вирусной репликации после инфекции с эталонным штаммом ВИЧ11,12,13. Аналогичные иммунодефицитные штаммы мыши с трансгенным выражением гематопоитических факторов человека (например, NOG-EXL или NSG-SGM3) или с имплантатами тканей печени человека и тимуса (костного мозга-печени-тимуса (BLT) мышей) полезны для оценки роли популяций миелоидов в анти-ВИЧ иммунный ответ, воздействие ВИЧ на эти ткани, и их участие в качестве вирусных резервуаров14,15. Кроме того, некоторые штаммы с трансгенным выражением молекул антигена лейкоцитов человека (HLA), а также BLT мышей, могут быть использованы для изучения Т-клеток ответ на ВИЧ-инфекцию16,17.

В целом, у этих мышей гуманизация зависит от клеточного происхождения, маршрута родов (интраперитонеальный, внутрипеченевой, внутривенной, внутривенной, внутрисердечной) и мышиного возраста на момент прививки18,19,20. Что касается происхождения клеток, человека CD34и HSC, полученных из пуповинной крови, печени плода, или мобилизованной периферической крови могут быть введены в новорожденных или молодых мышей3,21. Кроме того, взрослыенулевые мыши могут быть гуманизированы путем инъекции PBMC (здесь, именуемые hu-PBL-NS q-цепнойнулевой мышей), что позволяет височной циркуляции этих клеток в крови, вторичных лимфоидных органов, и воспаленные ткани22,23,24.

Описан освоенным здесь подробный протокол для создания huNS-цепинулевая мышь модели для изучения ВИЧ-инфекции. Во-первых, это хроническая модель, в которой человека CD34и HSCs, полученных из пуповинной крови от здорового донора вводятся у новорожденных мышей, а затем инфекции с эталонным штаммом ВИЧ после 14 недель восстановления иммунной системы человека. Эта модель позволяет контролировать мышей в течение 36 недель после заражения. Вторая модель представляет собой острую модель, в которой ПБМК, полученных от здорового донора, вводятся у взрослыхнюловых мышей NS и цепи, за которой следует инфекция с эталонным штаммом ВИЧ после 3 недель расширения Т-клеток человека в мыши. Наконец, третьей моделью является модель реактивации, в которой ПБМК, полученные от ВИЧ-инфицированного донора в рамках подавлятельной антиретровирусной терапии (АРТ), вводятся взрослым н.п. цепинулевых мышей. В этом случае безнаркотическая среда позволяет реактивацию вирусной терапии и увеличению вирусной нагрузки. Две последние модели позволяют осуществлять мониторинг в течение 9 недель после прививки.

В целом, эти три модели полезны для вирусологических исследований, доклинических исследований новых препаратов и оценки воздействия ВИЧ-инфекции на глобальный иммунный ответ. Важно также учитывать, что использование ВИЧ-инфицированных гуманизированных мышей требует рассмотрения и одобрения Со стороны Институционального комитета по биобезопасности (IBC), а также Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) перед любым экспериментом. Это гарантирует, что исследование следует всем внутренним и внешним институциональным нормам использования опасного биологического материала и гуманной обработки экспериментальных животных.

протокол

В этой работе все процедуры по уходу за животными и процедуры выполнялись в соответствии с протоколами, рассмотренными и утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Университета Мэриленда (протокольные номера 1018017, 1018018 и 0318009).

1. Человек CD34- HSC прививка новорожденных мышей

  1. Всегда используйте одноразовые средства индивидуальной защиты (PPE), в том числе стерильные скрабы, перчатки, специальную обувь, бахилы, маску, очки, капот для волос/бороды и стерильные лабораторные пальто.
  2. Повторно приостановить 1 х 106 замороженных CD34и HSCs (см. Таблица материалов) в 10 мл RPMI 1640 сми 10% FBS под сертифицированным шкафом биобезопасности и поддерживать стерильные условия.
  3. Используйте 10 зЛ подвески для подсчета (для обеспечения наличия ожидаемого количества клеток) и проверить жизнеспособность клеток путем trypan синий исключение окрашивания в гемоцитометр.
  4. Центрифуга при температуре 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта и приостановите в холодном 1x PBS до требуемой концентрации (1,4 х 105 cd34и HSCs в 50 Л). Держите клетки на льду до инъекций.
  5. Поместите щенков (NS-цепнойnull щенки обоих полов от 1-4 дней) в стерильные 100 мм2 Петри блюдо вместе с небольшим количеством постельных принадлежностей материала из клетки заводчика. Кроме того, руб чистые постельные принадлежности между руками для дальнейшей маскировки любых посторонних запахов на получателей щенков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это сводит к минимуму посторонние запахи время пропитанной на щенков, тем самым улучшая шансы матерей, принимающих их щенков обратно в клетки после процедуры.
  6. Положите чашку Петри в чистую транспортную клетку и поместите клетку в чистую клетку микроизолатора мыши, чтобы защитить щенков от окружающей среды. Обложка транспортной клетки с крышкой площадку, чтобы избежать воздействия животных на внешний свет во время транзита в облучение комнате.
  7. Облученные щенки с 100 cGy облучение всего тела (WBI) при воздействии 137 Cs источника. Очистите интерьер обилия дезинфицирующим раствором, поместите мышей в облучение и включите поворотный круг так, чтобы все щенки облучались однородно. Закройте облучение и нажмите выключатель питания, чтобы инициировать процесс облучения. Подождите, пока время облучения будет завершено и немедленно удалить мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку облучение не генерирует стресс у мышей, предыдущая анестезия не требуется.
  8. 2-4 ч после процедуры облучения, поместите щенков в шкаф биобезопасности внутри охлажденной стерильной чашке Петри, покрытой стерильной марлей на льду, пока анестезируется (5–10 мин). Достаточная анестезия достигается, когда грубые движения прекращаются.
  9. Загрузите шприц с прикрепленной иглой (29 G, 0.5") с 50 qL суспензии клетки и 1.4 x 105 CD34и HSCs под сертифицированным шкафом биобезопасности.
  10. Для прививки через печеночные инъекции, сдерживайте детенышей большим и указательным пальцами. Чтобы свести к минимуму удерживание мыши (30-45 с), пусть один следователь держать щенка и управлять инъекции, и второй следователь загрузить шприц с Подвеской HSC. Очистите место инъекции с 70% алкоголя и доставить 50 л клеток непосредственно в печень. Используйте неглубокий угол иглы при инъекциях, чтобы избежать полного пирсинга печени. В качестве контроля, вводить мышей с 50 Л 1x PBS в печень.
  11. Поместите щенков на предварительно разогретую стерильную чашку Петри, покрытую стерильной марлей в течение 1-5 мин, чтобы можно было восстановиться. Предварительно разогреть блюдо с помощью инфракрасного потепления площадку для грызунов при 20 градусов по Цельсию, чтобы убедиться, что щенки не будут чрезмерно нагреваться.
  12. Непосредственно перед возвращением детенышей к родителям, применять небольшое количество ментол- и эвкалипта основе мази, используя большой и указательный пальцы, к морде обоих родителей, чтобы избежать каннибализма или отказа от детенышей.
  13. Проверяйте клетки каждый день, ища любые признаки трансплантата против хозяина болезни (GVHD) в щенках, таких как сухая кожа, без кормления, сыпь, и облысение. Эвтаназия животных, если любой из этих признаков наблюдаются.
  14. Мышей wean в возрасте 3 недель, группируя их по полу. Не кладите более 5 животных на клетку. Проверить прививки в периферической крови с помощью цитометрии потока в 14 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешность прививок составляет от 80%-100%.

2. Человеческий PBMC прививок несовершеннолетних мышей

  1. Для острого и реактивации моделей, вводить 6-8 недельных NS-цепиnull мышей интраперитонева с человеческими ПБМК, полученных от здорового донора или ВИЧ-инфицированного пациента, который был под АРТ, соответственно. В обе их модели, включают мышей вводили с ПБМК от здорового донора без ВИЧ-инфекции (обман) в качестве контроля.
  2. Слой 15 мл цельной крови в 5 мл стерильной плотности градиента среды в 50 мл конической трубки.
  3. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин на RT, без тормозов, чтобы избежать буффи пальто становится смешанным с плотностью градиента среды.
  4. Тщательно соберите фракцию моноядерных клеток (между градиентной средой и супернатантом плотности) и перенесите шубу в 15 мл центрифуги, содержащую 10 мл 1x PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT.
  5. Откажитесь от супернатанта и удалите оставшиеся красные кровяные тельца, лизацией с 5 мл буфера ACK, добавленного в пеллетные клетки. Инкубировать в течение 4 мин на RT.
  6. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT. Отбросьте супернатант и отбросьте в 10 мл 1x PBS или RPMI 1640 среды.
  7. Используйте 10 зЛ суспензии клетки для подсчета клеток и проверки жизнеспособности путем trypan синий исключение окрашивания в гемоцитометр. Как правило, 1-2 х 106 клеток получаются на каждые 1 мл крови, с более чем 95% жизнеспособности.
  8. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT. Отбросьте супернатант и отрегулируйте номер клетки до необходимой концентрации (в этом случае 3,5 х 106 ячеек в 200 кл. 1x PBS).
  9. Загрузите шприц с прикрепленной иглой (28 G, 0.5) с 3.5 x 106 PBMCs в 200 ЗЛ 1x PBS под сертифицированным шкафом биобезопасности.
  10. Снимите мышь из клетки и удерживайте ее за хвост, чтобы она сжимала сетку, применяя нежную тягу назад. Затем поместите указательные и пальцы большого пальца на плечи животного, захватив свободную кожу шеи и используя средний палец, чтобы стабилизировать спину.
  11. Сдвиньте голову мыши назад так, чтобы ее спина была над головой. Это позволяет внутренности в брюшной полости быть смещены назад и снижает риск прокола внутренних органов во время инъекции.
  12. Очистите место инъекции с 70% алкоголя.
  13. Проникайте в шприц, используемый в шаге 2.9 через брюшную стенку и аспирировать перед введением клеток, если какой-либо материал аспирируется, удалить шприц и отказаться от него. В противном случае, вводить клетки медленно в интраперитонеальной полости, удалить шприц и отбросить его. Вводят 1x PBS для борьбы с мышами.
  14. Верните животное в клетку.
  15. Проверить прививки в периферической крови по течению цитометрии на 3 недели после инъекции.

3. Послетрансплантационный уход

  1. Определите мышей по пометке уха.
  2. Наблюдайте мышей используемых в этих экспериментах близко 2x в день после каждой процедуры для клинических знаков дистресса.
  3. После трансплантации клеток человека, контролировать мышей для GVHD. Для мониторинга симптомов ГВХД у новорожденных, несовершеннолетних и взрослых мышей, оценить животных на появление кожных заболеваний (например, цвет, сухость, сыпь, облысение), в дополнение к измерению веса тела. Оцените животных, которые показывают эти признаки ветеринаром рассмотреть ранней эвтаназии.

4. Процедура ВИЧ-инфекции и процедура фиктивной инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для хронических и острых моделей, мыши инфицированы ШТАММом ВИЧ-бейл на 14-й и 3-й неделе после трансплантации, соответственно. Инъекции с ВИЧ вводятся интраперитоневом виде в нижние брюшные квадранты.

  1. Выполните процесс загрузки вируса/PBS в шприцы, используя 28 G 0.5 " иглу, в шкафах BSL2 после процедур ABSL2. Общее количество вводимого вируса составляет 15 000 медианных инфекционных доз культуры тканей (TCID50) в 200 л стерильных RPMI 1640.
  2. Снимите мышь из клетки и удерживайте ее за хвост, чтобы она сжимала сетку, применяя нежную тягу назад. Затем поместите указательный палец и большой палец на плечи животного, хватая свободную кожу шеи и используя средний палец, чтобы стабилизировать спину.
  3. Сдвиньте голову мыши назад так, чтобы ее спина была над головой. Это позволяет внутренности в брюшной полости быть смещены назад и снижает риск прокола внутренних органов во время инъекции.
  4. Очистите мышей с предварительно увлажненным алкоголем колодки в левом нижнем / правом квадранте живота. Вводят 15 000 TCID50 вируса ВИЧ-балов, содержащегося в 200 Зл стерильных RPMI 1640.
  5. После инъекции верните мышь в домашнюю клетку.

5. Сбор крови путем ретроорбитального прокола

ПРИМЕЧАНИЕ: Ретроорбитальные кровотечения позволяют быстро ездовые крови, тем самым уменьшая общее время сбора и повышая стабильность маркеров лимфоцитов человека. Используйте трубки EDTA для сбора крови мышей.

  1. В хронической модели, на 14 недель после инъекции HSC, собирать кровь через ретроорбитальные вены. В острой и реактивации моделей, выполнить эту процедуру на 3 недели после инъекции PBMC.
  2. Анестезия животных с помощью 250 л изофлюранинга до сбора крови в биобезопасности капот класса B2, который продуктивается изветины изофруранов.
  3. Распределите Isoflurane в ватные палочки под проволочной сеткой в прозрачной 1 L банку в биобезопасности кабинет вентилируемые за пределами здания. Использование сетки гарантирует, что животные не контактируют с пропитанной изофровной прокладкой, которая может вызвать раздражение кожи и потенциальное переутомление, так как изофруран также поглощается через кожу. Кроме того, положить мягкое бумажное полотенце между сеткой и животных, чтобы избежать травм конечностей.
  4. После того, как банку насыщенизомана (примерно 1 мин после его добавления), ввести животное и наблюдать скорость дыхания, которая будет увеличиваться, то уменьшается. Проверьте на клиническое указание на глубокую плоскость анестезии, которая включает в себя отсутствие выправа рефлекс (при опрокидывании банку мягко) и отсутствие валовых движений. Начните процедуру кровотечения, как только животное полностью расслаблено и не хватает щепотки ногой рефлекс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Так как изофлуран испаряется, обойтись больше наркотиков, если никаких признаков анестезии не наблюдается.
  5. Для ретроорбитального кровотечения прижмите мышь внешней яремной вены caudal к нижней челюсти с большим пальцем, и с той же рукой, осторожно поднять верхнее веко с указательным пальцем.
  6. Вставьте гематокриттрубкую трубку в медиальную канту с глаз и направьте ее в вентролатеральном направлении до тех пор, пока кровь не начнет меняться.
  7. Соберите не менее 100 кл крови. После получения желаемого объема крови (объем не превышает 1% массы тела животного) прекратите внешнее яремное давление и удалите гематократную трубку.
  8. Убедитесь, что гемостаз завершается, применяя прямое давление на глаз с помощью стерильной марли в течение как минимум 30 с.
  9. Нанесите тетракаин капли в глаз. Мониторинг животного, пока он полностью оправился от анестезии и поместить его обратно в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 100 л собранной крови используется для оценки уровня прививки человекаCD45 и других популяций клеток крови, а также для оценки плазменной вирусной нагрузки.

6. Скрининг уровня прививок и анализа цитометрии потока

  1. Следуйте обычной цитометрии потока окрашивания протокол для всей крови, которая включает в себя инкубацию фторхромных маркировки античеловеческих антител (для предлагаемой панели потока, см. Таблица материалов), а затем лиза красных кровяных телец и стирки шаги13,15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для скрининга уровня прививок, включите античеловеческое антитело CD45. Для сравнения, антитела CD45 антимышки также могут быть использованы. Включите контроль компенсации, а также образец крови человека, окрашенный той же смесью антител, неокрашенные образцы крови мыши и человека, и негуманизированный контроль для проверки перекрестной реактивности реагентов. После окрашивания всегда есть какой-то фоновый сигнал; однако все позитивные сигналы четко отличаются от отрицательных и кросс-реактивных элементов управления.
  2. В соответствующем цитометре потока, приобрести по крайней мере 10000 событий на воротах лимфоцитов (FSC-A против SSC-A). Для анализа цитометрии потока, после дублирования исключения, определить процент человеческих клеток CD45и, а также других групп клеток, представляющих интерес.

7. Оценка плазменной вирусной нагрузки

  1. Оцените вирусную нагрузку у ВИЧ-инфицированных животных в 1 раз в неделю после заражения.
  2. После ретроорбитального кровотечения (примерно 100 л) получить плазму, собирая супернатант после центрифугации антикоагулягированной крови при 3500 х г в течение 3 мин в микроцентрифуге. Гранулы используются для фенотипирования клеток крови.
  3. Используйте коммерческий вирусный комплект для извлечения РНК (см. Таблица материалов)для получения РНК от 40 qL плазмы.
  4. Преобразуйте РНК в кДНК с помощью первой смеси синтеза штамма (см. Таблица материалов)и кляп ВИЧ грунтовки SK431.
  5. Выполните количественные ПЦР в реальном времени с использованием ВИЧ Gag праймеры SK38/SK39 и флуоресцентные зеленые красители (например, SYBR зеленый), как описано в предыдущих исследованиях13,25.

8. Применение антиретровирусной терапии

  1. Администрирование оральной АРТ по крайней мере через 3 недели после инфицирования, когда наблюдается высокая вирусная нагрузка, в хронических, острых и реактивационных моделях.
  2. Рассчитайте дозы тенофовир дисопроксил фуумарат (TDF), эмтрицитабин (FTC), и raltegravir (RAL), в соответствии с км значения 37 и 3 для людей и мышей, соответственно26. Как правило, эквивалентные человеку дозы TDF, FTC и RAL составляют 61,7 мг/кг/день, 40,7 мг/кг/день и 164 мг/кг/день, соответственно.
  3. Для введения в питьевой воде, раздавить таблетки наркотиков и добавить соответствующее количество в бутылку с водой, гарантируя, что каждая мышь в клетке приобретает свою суточную дозу. Так как порошок препарата может образовывать осадок в бутылке, периодически встряхивая бутылку воды для достижения однородной подвески.
  4. Каждую неделю меняйте бутылку с водой свежерастворимыми препаратами.
  5. Сбор крови через ретроорбитальные вены каждую неделю или каждые 2 недели после начала АРТ для оценки изменений в вирусной нагрузке и соотношении CD4:CD8.

9. Эвтаназия мыши, сбор вторичных лимфоидных органов и изоляция моноядерных клеток

  1. Эвтаназия выполняется в трех гуманизированных моделях мышей, периодически вдоль инфекционного времени, или в конце эксперимента.
  2. Выполните эвтаназию взрослых мышей с помощью CO2 асфиксии, а затем вывихшей шейки матки. Для удушья используйте незаряженную камеру, распределите CO2 из коммерческого цилиндра с регулятором фиксированного давления и в линию ограничителя, контролирующего поток газа в пределах 20%-30% от объема камеры/минуты в соответствии с руководящими принципами AVMA 2013 года.
  3. Поддержание потока CO2 для мониторинга остановки дыхания (который может занять до 5 минут), а затем вывих шейки матки для обеспечения эвтаназии.
  4. Эвтаназия новорожденных злт;7 дней назад физическим методом (т.е. с помощью острых ножниц).
  5. Визуализируйте подмышечные, медиалистические и мезентерические лимфатические узлы (которые обычно наблюдаются) и извлекайте их с помощью пинцета и острых ножниц. Также извлеките селезенку, расположенную в верхней левой стороне перитонеальной полости.
  6. Депозит лимфоидных тканей в 1,5 мл центрифуговых труб, содержащих стерильные RPMI 1640 среды.
  7. Немедленно обработайте лимфоидные ткани в 70-миллиметровом поро-размерном нейлоновом штамме, собирая клетки в трубке 50 мл. Не аспирируйте ткани.
  8. Вымойте клетки с 5 мл RPMI 1640 среды дополнили 1% FBS для облегчения фильтрации клеток.
  9. После дезагрегации тканей центрифугия клеток суспензия на 3500 х г в течение 10 мин в микроцентрифуге.
  10. Откажитесь от супернатанта и resuspend клетки с 500 Зл 1x PBS.
  11. Перенесите подвеску клеток в центрифужную трубку 1,5 мл, содержащую 500 л стерильной среды градиента плотности.
  12. Центрифуга при 3500 х г в течение 3 мин в микроцентрифуге, без тормозов, чтобы предотвратить баффи пальто от смешивания с плотностью градиента среды
  13. Тщательно соберите фракцию моноядерных клеток (между градиентной средой и супернатантом плотности) и перенесите шубу в центрифугу мощностью 1,5 мл, содержащую 500 л 1x PBS. Центрифуга при 3000 х г в течение 3 мин.
  14. Удалите оставшиеся эритроциты, лизинируя 500 qL буфера ACK, инкубируя в течение 4 минут на RT.
  15. Центрифуга при 3000 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант и отбросьте в 1 мл 1x PBS или среднего.

Результаты

Как описано выше, в 14 недель после HSC инъекции (хроническая модель) или на 3 недели после PBMC инъекции (острые и реактивации моделей), мышей кровоточат для скрининга уровня человеческих клеток прививок потокцитометрии. Репрезентативная стратегия gating для оценки 1) человека CD45- реконст...

Обсуждение

Важные достижения были достигнуты в развитии иммунодефицитных штаммов мыши для гуманизации, с рядом различных вариантов, которые могут быть использованы в соответствии с интересом исследования1. Здесь приведен общий протокол для гуманизации н.с. цепинулевых мышей и...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана IHV клинического отдела внутренних средств в JC.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3745.S.X
10 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0010
15 ml conical tubesStellar scientificT15-600
25 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0025
5 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0005
50 ml conical tubesStellar scientificT50-600
ACK lysis bufferQuality biological118-156-101
Alcohol prep padsFisher scientific06-669-62Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1Biolegend300439APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4Biolegend317420AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1Biolegend368522BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
BonnetFisher scientific17-100-900Single use cap for basic protection
CavicideMetrex13-1000Surface desinfectant
CD34+ cellsLonza2C-101As many vials available from a single donor
CentrifugeBeckman65-6KR
Clear jarAmazon77977
Cotton gauze padFisher scientific22-415-468Sterile
Disposable lab coatsFisher scientific19-472-422
EDTA micro tubesGreiner bio-one450480
Face MaskFisher scientific17-100-897
FACS lysing solutionBD340202
FBS premium HIAtlanta biologicalsS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
Flow cytometerWe used FACS Aria II
Flow cytometry tubesFalcon3520545 ml polystyrene and round bottom
HIV BaLPrepared in our uQUANT core facility
Human PBMCsHIV positive and negative volunteers
Infrared warming padVenet scientificDCT-25Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I irradiatorEquipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
MicrocentrifugeEppendorf
Mouse ear tagsNational Band & Tag company1005-1L1
Natelson blood collection tubesFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
NSG miceJackson5557Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldehyde 16%Electron microscopy sciences15710
PBS 1X pH 7.4Gibco100-10-023
Petri dishesFisher scientific08-757-28
Quantistudio qPCR machineThermoQS3
Reagent reservoirsCostar4870
RPMI media 1640 1XGibco11875-093
Shoe coversFisher scientific17-100-911
Sterile disposable GlovesMicroflexSUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMixInvitrogen10080-400cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2BD329-461
Syringes 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabine and TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blueSigmaT8154Cell count and viability
Vick VaporubSchool health43214Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology gradeQuality biological351-029-131

Ссылки

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

154CD34PBMC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены