JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для флуоресцентного антитела-опосредованного обнаружения белков в целых препаратах эмбрионов зебры и личинок.

Аннотация

Иммуногистохимия является широко используемым методом для изучения экспрессии белка и локализации в нормальных состояниях развития и болезни. Хотя многие протоколы иммуногистохимии были оптимизированы для тканей и тканей млекопитающих, эти протоколы часто требуют модификации и оптимизации для немлекопитающих модельных организмов. Зебрафиш все чаще используется в качестве модели системы в основных, биомедицинских и трансляционных исследованиях для исследования молекулярных, генетических и клеточных биологических механизмов процессов развития. Зебрафиш предлагает много преимуществ в качестве модели системы, но и требуют модифицированных методов для оптимального обнаружения белка. Здесь мы предоставляем наш протокол для всемонтированной флуоресценции иммуногистохимии в эмбрионах зебры и личинок. Этот протокол дополнительно описывает несколько различных стратегий монтажа, которые могут быть использованы и обзор преимуществ и недостатков каждой стратегии обеспечивает. Мы также описываем изменения в этом протоколе, чтобы позволить обнаружение хромогенных субстратов в целой ткани крепления и обнаружение флуоресценции в секционированных личитульных тканях. Этот протокол в целом применим к изучению многих стадий развития и эмбриональных структур.

Введение

Зебрафиш(Danio rerio) стала мощной моделью для изучения биологических процессов по нескольким причинам, включая короткое время генерации, быстрое развитие и удобство генетических методов. В результате, зебрафиш обычно используются в высокой пропускной связи малых молекул экранов для токсикологических исследований и открытия наркотиков. Зебрафиш также является привлекательной моделью для изучения процессов развития, учитывая, что одна женщина может регулярно производить 50-300 яиц за один раз, а оптически прозрачные эмбрионы развиваются внешне, что позволяет эффективно визуализировать процессы развития. Тем не менее, ранние исследования опирались главным образом на передние генетические экраны с использованием N-этил-N-нитросуреа (ENU) или других мутагенов из-за проблем в создании обратных генетических методов. Примерно два десятилетия назад, морфолинос были впервые использованы в зебрафиш для нокдауна целевых генов1. Morpholinos являются небольшие антисмысловые олигонуклеотиды, которые препятствуют переводу целевой мРНК после микроинъекции в эмбрион на ранней стадии развития. Основным недостатком морфинос является то, что они разбавляются по мере деления клеток и, как правило, теряют эффективность на 72 часа после оплодотворения (hpf). В то время как морфолиносы остаются мощным инструментом для нарушения гена зебры, транскрипционный активатор- эффектоподобный эффект (TALENs), нуклизы цинка-пальца (ЗФН) и кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPRs) в последнее время используются для непосредственной цели генома зебры2,3. Эти обратные генетические стратегии, в сочетании с вперед генетики и высокой пропускной технологии экраны, создали зебры в качестве мощной модели для изучения экспрессии генов и функции.

Способность изучать функцию генов обычно требует оценки пространственно-временного распределения экспрессии генов или генных продуктов. Два наиболее часто используемых методов визуализации таких моделей выражения в начале разработки на месте гибридизации (ISH) и целом горе иммуногистохимии (IHC). На месте гибридизация была впервые разработана в 1969 году и опирается на использование помеченных антисмысловых зондов РНК для обнаружения экспрессии мРНК в организме4. В отличие от этого, помеченные антитела используются в иммуногистохимии для визуализации экспрессии белка. Идея маркировки белков для обнаружения восходит к5 1930-х годов и первый эксперимент IHC был опубликован в 1941 году, когда FITC помечены антитела были использованы для обнаружения патогенных бактерий в инфицированных тканях6. ISH и IHC значительно эволюционировали и значительно улучшились в течение последующих десятилетий и в настоящее время оба регулярно используются в молекулярно-диагностической исследовательской лаборатории7,8,9,10,11. Хотя оба метода имеют преимущества и недостатки, IHC предлагает ряд преимуществ по сравнению с ISH. Практически, IHC гораздо меньше времени, чем ISH и, как правило, дешевле в зависимости от стоимости первичного антитела. Кроме того, выражение мРНК не всегда является надежным показателем экспрессии белка, как было продемонстрировано у мышей и людей, что только около трети вариации изобилия белка можно объяснить изобилием мРНК12. По этой причине, IHC является важным дополнением для подтверждения данных ISH, когда это возможно. Наконец, IHC может предоставить данные субклеточной и совместной локализации, которые не могут быть определены ISH13,14,15. Здесь мы описываем пошаговый метод надежного обнаружения белков иммуногистохимией в целых эмбрионах зебры и личинках. Целью данной методики является определение пространственного и временного выражения белка, интересуемого во всем эмбрионе. Эта технология использует антиген-специфические первичные антитела и флуоресцентно помеченные вторичные антитела. Протокол легко адаптируется к использованию на слайд-установленных секциях тканей и для использования с хромогенными субстратами вместо флуоресценции. Используя этот протокол, мы демонстрируем, что развитие скелетных мышц зебры выражает ионотропные рецепторы глутамата, в дополнение к рецепторам ацетилхолина. NMDA-типа глутаматных рецепторов субъединиц обнаруживаются на продольной мышцы на 23 л.с.

протокол

Процедуры работы с разведением зебры взрослых и эмбрионов, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию при Университете штата Мюррей.

1. Коллекция и фиксация эмбрионов

  1. Подготовка нереста танки, поместив взрослых зебры смешанных половых пар или групп в цистернах с сеткой или прорези лайнер аполируется системной водой на ночь.
  2. При включении света, изменить нереста воды для пресной системы воды для удаления кала. Используйте 14 ч/10 ч светлый темный цикл с огнями, поступающими в 9 утра.
  3. После того, как яйца будут отложены, верните взрослых в домашние резервуары.
  4. Соберите яйца, рисуя их с помощью передачи пифет или заливки их в сетку ситечко.
  5. Перенесите яйца в блюда Петри, заполненные на полпути со средой эмбриона (например, 30% Данио или E2 эмбриона среды с 0,5 мг / л метиленовый синий), ограничивая количество эмбрионов на блюдо до 50.
  6. Удалите любые яйца, которые мертвы или не делятся.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мертвые эмбрионы могут быть легко идентифицированы, поскольку они становятся непрозрачными и часто появляются "облачно". Если метилен синий добавляется к эмбриону среды, мертвые эмбрионы принимают на темно-синий вид.
  7. Инкубировать блюда из яиц при 28,5 градусах Цельсия, пока они не достигнут желаемой стадии. Для этого эксперимента, поднять эмбрионы до 23 л.с.
  8. Дополнительно) Передача эмбрионов на 24 л.с. до 200 мкм 1-фенил 2-тиура (ПТУ) в эмбрионе среды для предотвращения меланогенеза16,17. Кроме того, отбеливатель эмбрионов после фиксации (см. необязательный раздел 5).
  9. Изменение эмбриона среднего или PTU среднего ежедневно.
  10. Дехорионат без вылупленных эмбрионов с помощью сверхтонких щипцов под стереомикроскоп. Кроме того, химически дехорионат эмбрионов путем инкубации в 1 мг /мл Pronase в эмбрионе среды в течение нескольких минут при комнатной температуре. Удалить эмбрионы из Pronase и мыть три раза с эмбриона среды.
  11. Дехорионированные эмбрионы будут прилипать к пластику. Храните их в стеклянных или пластиковых чашках Петри, покрытых 1-2% агарозой, растворенного в среде эмбриона. Перемещение дехорионированных эмбрионов с помощью огневой полированной пастерной пастерной плеты, чтобы свести к минимуму ущерб.
  12. Перенесите эмбрионы в 1,5 мл центрифуговых трубок с помощью пластиковой или огневой трубы.
  13. Удалить эмбрион среды с микропипеттом. Оставьте только достаточно жидкости, чтобы просто покрыть эмбрионы после каждого изменения жидкости.
  14. Подготовка 4% параформальдегида (PFA) в 1x фосфат-буфера солей (PBS) в химический капот дыма.
    ВНИМАНИЕ: ПФА является опасным материалом. Носите перчатки и утилизировать загрязненные жидкости и твердые вещества в специально отведенных местах.
  15. Исправить эмбрионы в 4% PFA для 1-2 ч с нежным качания при комнатной температуре. Кроме того, исправить эмбрионы 4 ч на ночь при 4 градусах Цельсия.
  16. Вымойте три раза в 1x PBS и 1% Triton-X (PBTriton) в течение 5 мин.
  17. Используйте эмбрионы немедленно или хранить при 4 градусах Цельсия в течение 1 недели.
  18. Для длительного хранения обезвоживать эмбрионы в 100% метанола (MeOH) 2 ч или на ночь при -20 градусах Цельсия. Храните эмбрионы при -20 градусов по Цельсию в MeOH в течение нескольких месяцев.
    ВНИМАНИЕ: MeOH является опасным материалом. Носите перчатки и утилизировать загрязненные жидкости и твердые вещества в специально отведенных местах.

2. Подготовка эмбрионов

  1. Регидратация эмбрионов через последовательные инкубации при комнатной температуре.
    1. Инкубировать в 75% MeOH/25% 1x PBS в течение 5 мин, качания.
    2. Инкубировать в 50% MeOH/50% 1x PBS в течение 5 мин, качания.
    3. Инкубировать в 25% MeOH/75% 1x PBS в течение 5 мин, качания.
    4. Инкубировать в 100% PBTriton в течение 5 мин, качания.
  2. (Необязательно) Приготовьте свежий протеиназу K рабочий раствор (10 мкг/мл в PBTriton) на льду, добавив 10 л свежеоттая протеиназа K (10 мг/мл).
    1. Пермяки эмбрионов путем переваривания до 30 мин в Proteinase K.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемое время является lt;24 hpf: нет пищеварения; 24 л.с.ф.: 15 мин. и 7 дней: 30 мин пищеварения.
    2. Промыть пермяковые эмбрионы в PBTriton и повторно исправить в 4% PFA в течение 20 минут при комнатной температуре.
    3. Вымойте эмбрионы три раза в PBTriton в течение 5 минут при комнатной температуре с нежным раскачиванием.

3. Первичная инкубация антител

  1. Выберите коммерческое блокирующее решение или сыворотку, соответствующую вторичным видам антител(напротив, 10% сыворотки для коз в PBTriton) с или без 2 мг/мл Сыворотки крупного рогатого скота (BSA).
  2. Блок эмбрионов в блокирующий раствор для 1-3 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию во время раскачивания.
  3. Инкубировать в первичных антителах, разбавленных в блокирующем растворе или 1% сыворотки в PBTriton на ночь при 4 градусах Цельсия во время раскачивания. В этом эксперименте, основные антитела, используемые были анти-NMDAR1, анти-пан-АМРА рецептор, и анти-фосфо-Histone H3, каждый разбавленной до окончательной концентрации 1:500 в 1% козьей сыворотки в PBTriton.
  4. Вымойте пять раз в PBTriton в течение 10 минут при комнатной температуре во время качания.

4. Вторичная инкубация антител

  1. Выберите вторичное антитело на основе вида хозяина первичного антитела и желаемой длины волны.
  2. Инкубировать во вторичном антителах, разбавленных блокирующим раствором или 1% сыворотки на 2 ч при комнатной температуре (или на ночь при температуре 4 градусов По Цельсию) во время раскачивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные вторичные антитела светочувствительны. Мы использовали 1:500 коза-анти-мышь Alexa488 разбавленной в 1% козьей сыворотки в PBTriton.
  3. Обложка труб с алюминиевой фольгой или крышка с светоблокирующей коробке для этого и всех последующих шагов.
  4. Вымойте три раза в PBTriton в течение 10 минут при комнатной температуре во время качания.
  5. Перенесите эмбрионы на 50% глицерол раствор в PBS на кровати 2% агарозы в эмбрионе среды и перейти к документации или приступить к дальнейшей обработки шагов ниже.

Дополнительные шаги

5. Отбеливание

  1. Подготовка раствора отбеливателя в трубке 1,5 мл, добавив 810,7 л ddH2O, 89,3 л 2 М КН, и 100 л 30% H2O2.
  2. Перевернуть трубку три раза, чтобы перемешать.
  3. Пипетка 1 мл направления раствора отбеливателя к эмбрионам.
  4. Откройте крышку трубки эмбриона, чтобы позволить газу бежать. Аккуратно коснитесь трубки на скамейке, чтобы выбить пузыри.
  5. Мониторинг процесса отбеливания (при необходимости использовать микроскоп) и остановить реакцию при достаточном удалении пигмента (примерно 5 мин для 24 л.с. или 10 мин за 72 л.с.).
  6. Тщательно удалите отбеливание раствора с помощью микропипетты и трижды промыть эмбрионы в 1 мл ПБТритона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы липкие в этом шаге.
  7. Приступайке к документации или дальнейшей обработке ниже.

6. Вскрытие эмбрионов и дейолкинг

  1. Чтобы удалить желток, перенесите небольшое количество (200 евро или достаточно, чтобы полностью покрыть эмбрион, но достаточно ограничительный, чтобы ограничить, где он может плавать) 1x PBS в депрессию слайд или простой слайд стекла.
  2. Используйте пластиковый трубчатый перенос для перемещения 1 или более эмбрионов в капля PBS.
  3. Используйте ультра-тонкие щипцы и 00 булавок насекомых, чтобы разбить желток и очень мягко соскребать гранулы желтка от брюшной поверхности эмбриона (см. также Cheng et al., 2014)18.
  4. Удалите желтковые гранулы и пополнить PBS по мере необходимости.
  5. Повторяйте до тех пор, пока эмбрион не будет достаточно свободен от желтка.

7. Плоский монтаж на слайдах

  1. Передача deyolked эмбрионов на заряженную стеклянную горку с пластиковой пипеткой или 1 мл микропайпетса с обрезанным кончиком (для уменьшения напряжения сдвига). Ориентируйся по желанию с наконечником микропайпета 200 л или булавкой для насекомых.
  2. Wick от избыточного PBS с Ким протрите или бумажное полотенце.
  3. Добавьте 2-3 капли монтажных носителей на слайд и обложку.
  4. Воздух сухой в течение примерно 5 до 10 мин.
  5. Запечатайте крышку стекла на горку с прозрачным лаком для ногтей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Края крышки стекла должны быть полностью покрыты тонким, непрерывным слоем лака для ногтей.
  6. Дайте высохнуть примерно за 10 минут до визуализации.

8. Монтаж в Агароза

  1. Подготовка 1% агарозы в эмбрионе среды, добавив 0,5 г агарозы до 50 мл эмбриона среды в микроволновой безопасной колбе или стакан по крайней мере 3x больше объема, чем хотелось бы.
  2. Тепло в микроволновой печи, закрученного каждые 30 с, пока агароза полностью растворяется.
  3. Сделать 1 мл aliquots в 1,5 мл центрифуговых труб. Храните aliquots при комнатной температуре.
  4. Крышка трубки крышки с крышкой замки перед нагреванием.
  5. Поместите агарозные трубки в держатель плавающей трубки в стакан, наполовину заполненный водой.
  6. Микроволновая печь стакан с плавающими трубками в течение 2-3 мин, или пока агароза полностью расплавлена.
  7. Перенесите эмбрион на стрижку с помощью пластиковой пипетки или микропипетты объемом 200 л с обрезанным наконечником (для уменьшения напряжения сдвига).
  8. Расположите эмбрион на прямоугольном облике с помощью булавок насекомых и добавьте примерно 20 плавить агарозы непосредственно к эмбриону.
  9. Быстро ориентируйте интересуемый регион, используя 00 булавок насекомых.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это перевернутое горе.
  10. Вернуть трубку агарозы в трубку горячей воды плавать между каждым использованием и микроволновой печи по мере необходимости.
  11. Изображение с помощью микроскопа, когда агароза затвердевает. Держите установленный эмбрион вверх дном для использования на перевернутом микроскопе. Переверните coverslip над (так агароуз находится под coverslip) для использования на вертикальном микроскопах.

9. Монтаж на мостах слайдов

  1. Чтобы сделать мостовые горки, клей квадрат охватывает охватывает стеклянную горку с помощью небольшой точки суперклея.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Между крышками должно быть корыто шириной не менее 5 мм. Два #1 крышки высокой, как правило, подходит для 24-48 л.с. эмбрионов в то время как три coverslips высокой может быть необходимо для 72 л.с.
  2. Передача 1-2 deyolked эмбрионов на мостовой слайд с пластиковой пипеткой или 200 мл микропайпетс с обрезанным кончиком (для уменьшения напряжения сдвига).
  3. Уик от лишней жидкости с Ким протрите или бумажное полотенце.
  4. Добавьте каплю глицерола 80% непосредственно в эмбрион.
  5. Накрыть стеклом прямоугольной крышки. Капли глицерола должны коснуться крышки стекла.
  6. Добавьте больше глицерола в пространство между стеклом крышки и слайд по мере необходимости, чтобы полностью покрыть эмбрион с запасом глицерола по бокам эмбриона.
  7. Сдвиньте прямоугольное стекло крышки осторожно, чтобы свернуть эмбрион в положение для визуализации.

10. DAB окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел начинается после шага 4.2 выше и заменяет остальную часть шага 4.

  1. Инкубировать эмбрионы в блокирующий раствор с пероксидаза-конъюгированных вторичных антител для 2 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию во время качания.
  2. Вымойте три раза в PBTriton в течение 10 минут при комнатной температуре.
  3. Перенесите эмбрионы на культурную пластину или скольжение депрессии с помощью перекладины.
  4. Смешайте 50 л 1% DAB (3,3'-диаминобензидин) растворяется в ddH2O и 50 Л 0,3% перекиси водорода и довести до 1 мл с PBS.
    ВНИМАНИЕ: DAB является опасным материалом. Носите перчатки и утилизировать DAB загрязненных жидкостей и твердых веществ в специально отведенных местах.
  5. Обложка HRP-окрашенных эмбрионов с dAB решение подготовлено выше и контролировать для развития цвета (обычно 1-5 мин) под микроскопом.
  6. После достижения желаемого уровня развития цвета, промыть эмбрионы кратко в PBS.
  7. Перед фиксацией перенесите эмбрионы обратно в трубку длиной 1,5 мл.
  8. Повторно исправить эмбрионы в течение 15-20 мин в 4% PFA при комнатной температуре.
  9. Вымойте эмбрионы три раза в PBTriton в течение 5 мин.
  10. Приступай к документации.

11. Измененный протокол для окрашивания секционированных тканей, установленных на слайдах

  1. Окружить ткани, которые будут окрашены пап перо.
  2. Перенесите слайды во влажную камеру.
  3. Добавьте 1 мл PBS непосредственно к слайду.
  4. Инкубировать 7 мин при комнатной температуре, чтобы удалить встраивающую среду.
  5. Налейте PBS путем инвертирования слайда.
  6. Регидратировать 1 мин в до 1 мл тротила буфера (100 мм Tris pH 8.0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween20).
  7. Блокируйте до 1 мл блокирующего раствора (коммерческого или 10% сыворотки и 2% BSA) на 1 ч при комнатной температуре.
  8. Инкубировать на ночь в первичных антителах, разбавленных в 1% сыворотке или блокирующем растворе при 4 градусах Цельсия.
  9. Вымойте пять раз в до 1 мл тротила буфера при комнатной температуре.
  10. Инкубировать во вторичном антителах в течение 2 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию. Накройте камеру фольгой или используйте темную крышку.
  11. Вымойте пять раз в тротиловом эквиваленте при комнатной температуре. Вылейте последнюю стирку.
  12. Гора с 2-3 каплями крепления среднего и coverslip. Пусть сидит 5-10 мин.
  13. Печать крышки стекла на слайд с помощью прозрачного лака для ногтей. Дайте полностью высохнуть перед визуализацией.

12. Документация

  1. Запись полной процедуры и любых отклонений в лабораторном блокноте.
  2. Запись концентрации, имя, номер каталога, производитель, и номер партии первичного антитела.
  3. Поместите надлежащим образом установленный образец на стадии микроскопа. Найдите интересуемый регион.
  4. Выберите относительно яркий пример. Установите экспозицию камеры и получить так, что сигнал достаточно яркий без насыщения.
  5. Сравните интенсивность окрашивания одной и той же области интереса, используя одни и те же настройки экспозиции при сравнении между экспериментальными эмбрионами с маркировкой антител и контрольными антителами (например, IgG) эмбрионами.

Результаты

Целая гора иммуногистохимии использует антитела для обнаружения пространственной картины экспрессии белка в нетронутом животном. Основной рабочий процесс иммуногистохимии (изображенный на рисунке 1)включает в себя разведение зебры, выращивание и пр...

Обсуждение

Иммуногистохимия является универсальным инструментом, который может быть использован для характеристики пространственно-временного выражения практически любого белка, интересующегося организмом. Иммуногистохимия используется на самых разнообразных тканях и модельных организмах....

Раскрытие информации

Авторы не раскроют информацию.

Благодарности

Финансирование из гранта NIH 8P20GM103436 14.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseFisher ScientificBP160-100
Aluminum foil, heavy dutyKirklandAny brand may be substituted
Anti-NMDA antibodyMillipore SigmaMAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002Millipore Sigma05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)Millipore SigmaMABN832
Bovine serum albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
Centrifuge tubes, 1.5 mLAxygenMCT150C
Clear nail polishSally HansonAny nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slideElectron Miscroscopy Sciences71878-01
DiaminobenzidineThermo Scientific1855920
Embryo medium, Danieau, 30%17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E27.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holderThermo Scientific59744015
Fluorescence compound microscopeLeica BiosystemsDMi8
Fluorescence stereomicroscopeLeica BiosystemsM165-FC
Glass coverslips 18 mm x 18 mmCorning284518
Glass coverslips 22 mm x 60 mmThermo Scientific22-050-222
Glass slidesFisher Scientific12-544-4
GlycerolFisher ScientificBP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488InvitrogenA11001
HEPES solutionSigma AldrichH0887
Humid chamber with lidSimportM920-2
Hydrogen peroxide, 30%Fisher ScientificH325-500
Immunedge pap penVector labsH-4000
Insect pins, size 00Stoelting5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O)Sigma Aldrich63138
Mesh strainerOneidaAny brand may be substituted
MethanolSigma Aldrich34860
Methylene blueSigma AldrichM9140
Micro-tube cap lockResearch Products International145062
Microwave ovenToastmaster
Mouse IgGSigma AldrichI8765
Normal goat serumMillipore SigmaS02L1ML
Nutating mixerFisher Scientific88-861-044
ParaformaldehydeFisher Scientific04042-500
Pasteur pipettesFisher Scientific13-678-20C
PBTriton1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting mediumFisher ChemicalSP15-500
Petri dish (glass)Pyrex3160100
Petri dish (plastic)Fisher ScientificFB0875713
1-phenyl 2-thioureaAcros Organics207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4Gibco70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl)Sigma AldrichP9333
Potassium Hydroxide (KOH)FisherP250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PronaseSigma Aldrich10165921001
Proteinase KInvitrogenAM2544
Sodium Chloride (NaCl)Sigma AldrichS7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)Sigma AldrichS7907
Spawning tank with lid and insertAquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost + slidesFisher Scientific12-550-15
Superglue gel3M Scotch
TNT100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipetteFisher13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)Sigma AldrichT6399
Tris BaseFisher ScientificS374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500
Ultrafine forcepsFisher Scientific16-100-121
Water, ultrapure/double distilledFisher ScientificW2-20

Ссылки

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

155

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены