Получение высококачественных транскриптомных данных из зерновых семян с помощью модифицированного метода профилирования экспрессии генов

Резюме

Представлен метод транскриптомного профилирования зерновых. Профилирование экспрессии генов на основе микроаррей начинается с изоляции высококачественной тотальной РНК от зерновых зерен и продолжается с генерацией кДНК. После маркировки cRNA и гибридизации микроаррей даются рекомендации по обнаружению сигналов и контролю качества.

Аннотация

Характеристика экспрессии генов зависит от качества РНК. При прорастании, развитии и созревании семян зерновых добыче высококачественной РНК часто препятствует высокое содержание крахмала и сахара. Эти соединения могут снизить как урожайность, так и качество извлекаемых РНК. Ухудшение количества и качества общей РНК может впоследствии оказать значительное влияние на транскриптомический анализ вниз по течению, который может не точно отражать пространственные и/или временные изменения в профиле экспрессии генов тестируемых образцов. В этом протоколе мы описываем оптимизированный метод извлечения общей РНК с достаточным количеством и качеством, который будет использоваться для анализа цельного транскриптома зерновых культур. Описанный метод подходит для нескольких вниз по течению приложений, используемых для транскриптомического профилирования развивающихся, прорастание, и зрелые семена зерновых. Показан метод профилирования транскриптома с помощью платформы microarray. Этот метод специально разработан для профилирования экспрессии генов зерновых с описанными последовательностями генома. Описана подробная процедура от обработки микроаррей до окончательного контроля качества. Это включает в себя синтез кДНК, маркировку cRNA, гибридизацию микроаррей, сканирование слайдов, извлечение функций и проверку качества данных. Данные, генерируемые этим методом, могут быть использованы для характеристики транскриптома зерновых во время прорастания, на различных стадиях развития зерна, или в различных биотических или абиотических условиях стресса. Представленные здесь результаты иллюстрируют высококачественные транскриптомные данные, поддающиеся анализу биоинформатики, таким как определение дифференциально выраженных генов (DEGs), характеристика сетей регулятивного гена и проведение исследования ассоциации в масштабах транскриптома (TWAS).

Введение

Транскриптом представляет собой полный набор рибонуклеиновой кислоты (РНК) стенограммы, выраженные генома организма в данный момент времени и, в частности, экологических и условий роста. Каждая клетка имеет свою индивидуальную транскриптом, которая отражает ее текущее физиологичебное и метаболическое состояние. Коллекция клеток, полученных из аналогичных тканей или органов используется в типичном исследовании транскриптома, но одноклеточные и пространственно-решенной транскриптомики становятся популярными¹. Транскриптомический анализ начинается с извлечения общей РНК из выбранной ткани в определенный момент времени и в определенных условиях роста. Для этого мы рекомендуем использовать недавно разработанный метод извлечения общей РНК из образцов с высоким содержанием крахмала или сахара, таких как семена зерновых². Сравнение транскриптомов между различными образцами приводит к идентификации молекул РНК с разным изобилием. Эти молекулы РНК считаются дифференциально выраженными генами (DEGs). Обилие транскриптов, полученных из конкретных генов маркеров, может затем использоваться для оценки состояния развития или определения реакции организма на колебания окружающей среды. Гены без обнаруживаемых изменений в их изобилии транскрипта через изыскивая времени развития часто использованы как справка или гены housekeeping.

РНК, как правило, обнаруживается и количественно определяется различными методами, такими как северная blotting и количественная обратная транскриптаза полимеразной цепной реакции (qRT-PCR), но нынешние методы транскриптомики высокой пропускной способности в значительной степени опираются на гибридизацию нуклеиновой кислоты с использованием технологии микроаррейка, а также секвенирования РНК (RNA-Seq). RNA-Seq очень популярен в настоящее время, поскольку он предоставляет несколько преимуществ для высокой пропускной транскриптомической приложений, как рассмотрены в другом месте^3,4. Хотя более старая технология, профилирование экспрессии генов с использованием микросхем микросхем по-прежнему широко используется, потому что это более устоявшаяся технология, которая требует меньше фона в биоинформатике. По сравнению с RNA-Seq наборы данных, полученные в результате экспериментов на микроархе, меньше и их легче анализировать. Кроме того, он является более рентабельным, особенно если речь идет о больших числах выборки. В нашей лаборатории мы регулярно используем транскриптомические анализы с использованием технологии microarray для определения роли центральных регуляторных центров, которые регулируют молекулярные сети и пути, участвующие в росте, развитии и метаболизме зерновых^5,6,7,8,9. Мы также регулярно использовать его для проведения генома всей генной экспрессии профилирования исследований для получения механистического понимания реакции зерновых зерновых на абиотических стрессов¹⁰, а также в проведении транскриптома всей ассоциации (TWAS) и ссылка картографических исследований для выявления генов, ответственных за качество зерновых зерна и питания^11,12. Другие группы также использовали технологию microarray в обеспечении разработки конкретных атлас экспрессии генов в ячмень¹³, рис^14,15,16, сорго¹⁷, и пшеница¹⁸.

Цель юга состоит в том, чтобы предоставить краткое текстовое резюме и подробное визуальное описание метода, который мы в настоящее время используем в нашей лаборатории для транскриптомического профилирования зерновых с использованием платформы Agilent microarray. Обратите внимание, что другие платформы microarray доступны, но не будут охвачены этим методом. Мы начинаем протокол с представления подробного описания извлечения РНК из развивающихся или прорастающих семян зерновых. Основываясь на нашем опыте, получение высококачественного и высокого количества транскриптома поддается вниз по течению транскриптомического анализа часто является узким местом при использовании тканей семян зерновых. Мы пробовали несколько коммерчески доступных комплектов извлечения РНК, но ни один из них не дал удовлетворительных результатов. Таким образом, мы разработали протокол химической добычи для получения сырой экстрактА РНК, который затем подвергается очистке колонки с помощью коммерчески доступного комплекта. Используя этот метод, мы регулярно и воспроизводим получать высокое качество РНК² (Рисунок 1), которые могут быть использованы для различных приложений вниз по течению для создания профиля транскриптома.

протокол

1. Общая добыча рнки и очистка

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда работать под дымом капот, как этот метод включает в себя использование вредных летучих органических растворителей. Предварительно разогреть микрофуговую трубку безнуцкой воды в теплоблоке в 50 градусов по Цельсию перед началом эксперимента. Эта безобразная вода будет использоваться для того, чтобы вычеркнуть общую РНК из спиновой колонки в шаге 1.8.

1. Отдельно измельчить образцы, каждый из которых имеет по крайней мере три биологических репликаты, в мелкий порошок с помощью стерилизованного раствора и пестика, которые предварительно охлаждаются в жидком азоте.
   1. Scoop порошкообразных образцов с помощью небольшого металлического шпателя, смоченного в жидком азоте и поместите порошкообразные образцы в 2,0 мл безнухлого микрофуза труб, также предварительно окунается в жидкий азот. Немедленно храните образцы в морозильной камере с ультранизкой температурой (-80 градусов по Цельсию) до дня, отведенного для выделения РНК-пакета (STOP POINT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы семян могут быть измельчена в мелкий порошок с или без dehusking. Для риса, мы обычно молоть образцы без dehusking потому что шелуха содержит кремнезем, который может помочь во время шлифования процесса.
      ПРЕДЕКТО: Этот шаг должен быть сделан быстро и в строго криогенных условиях. Одним из вариантов автоматизации является измельчение образцов с помощью криогенной шаровой мельницы, чтобы свести к минимуму деградацию РНК и ухудшение качества.
2. Получить сырой экстракт РНК, используя примерно 200 мг оригинального порошкового образца. Индивидуально добавить каждый образец в нуклеазно-бесплатной микрофуговой трубки, содержащей 750 кЛ рнк-извлечения буфера (100 мм Трис, рН 8,0, 150 мМ LiCl, 50 мМ EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-mercaptoethanol) и 500 л пленола.
   1. Смешайте все образцы в то же время в течение 5 минут при комнатной температуре с помощью смесителя для водоворотов с большой скоростью. Немедленно держите все трубы на льду в течение двух минут.
      ВНИМАНИЕ: Всегда работайте внутри капота дыма, особенно для всех шагов, связанных с фенолом, хлороформом и другими органическими растворителями. В идеале, используйте широкий капот дыма, который может вместить один скамейке центрифуги, вихревой смеситель, мульти-трубки вихревого смесителя, и мульти-трубки роторный смеситель.
3. Отделить сырой экстракт РНК из мусора центрифугированием на 14000 х г в течение 10 мин. У все шаги центрифугирования в тех же настройках для этого раздела.
   1. Перенесите около 800 л супернатанта в новую микрофужную трубку мощностью 2,0 мл, содержащую 400 л от 1,2 М NaCl и 700 л изопропанола. Смешайте раствор осторожно инверсией 5x.
   2. Осажьте РНК путем инкубации в обычном (-20 градусов по Цельсию) или ультранизкой температуре морозильник (-80 градусов по Цельсию), по крайней мере 1 ч (или на ночь).
      STOP или PAUSE point: просто держите образцы в обычном морозильной камере -20 градусов по Цельсию, чтобы приостановиться на несколько часов. Для ночлега или более длинной стоп-пойнта храните образцы в морозильной камере с ультранизкой температурой (-80 градусов по Цельсию).
4. Получить сырой РНК гранулы центрифугирования на 18800 х г в течение 15 минут. После отбрасывания супернатанта, очистить сырой РНК гранулы по колонке очистки с помощью мини-комплект (Таблица материалов).
   1. Растворите гранулы в свежеприготовленных 450 л из rlT Buffer (до использования, добавьте 100 л из й-меркаптоэтанола на 100 мл буфера RLT, приготовленного свежего ежедневно). Увеличьте растворение всех гранул путем смешивания всех труб при комнатной температуре в смесителе многотрубного вихря в течение по крайней мере 5 мин.
5. Очистите растворенные гранулы РНК, проходя через фиолетовый мини-колонку спина с 2 мл коллекции трубки. Центрифуга при комнатной температуре в течение 1 мин при 9000 х г и отбросить фиолетовый мини-колонки спина.
   1. Добавьте 0,5 тома абсолютного этанола (225 л) к очищенным лизату в трубке коллекции 2 мл. Смешайте раствор, используя тот же пластиковый наконечник, труба вверх и вниз несколько раз.
6. Соберите очищенную РНК, немедленно переведя раствор в розовую мини-колонку спина с трубкой сбора 2 мл. Центрифуга на 9000 х г в течение 15 с, чтобы собрать РНК на кремнезема мембраны розового мин спина колонки. Отбросить поток через и промыть РНК с 350 зл буфера RW1 центром при 9000 х г в течение 15 с.
7. Удалить загрязняющие геномные ДНК, добавив 80 qL разбавленного DNase 1 (50 л замороженных запасов DNase 350 Л RDD с помощью набора DNase) непосредственно на мембрану и переварить путем инкубации при комнатной температуре, по крайней мере 15 мин (PAUSE POINT).
   1. Смойте DNase 1, добавив 350 зл и спиннинг вниз на 9000 х г в течение 15 с. Повторите дважды, но на этот раз мыть с 500 Зл Буфер RPE. Перенесите в новую трубку коллекции 2 мл и закрутите при 9000 х г в течение 2 мин, чтобы высохнуть.
8. Перенесите высушенную спиновую колонку в новую трубку для сбора без nuclease 1,5 мл. Начните процесс elution для очищенного экстракта РНК, добавив 50 qL безнужной воды (предварительно разогретой при температуре 50 градусов по Цельсию) и инкубируя в течение 3 мин при 50-C тепловом блоке.
   1. После инкубации, увядительный общий экстракт РНК центрифугирование на 9000 х г в течение 1 мин. Немедленно поместите все образцы на лед.
9. Определите количество и качество общего экстракта РНК, запустив соответствующие разбавления (обычно 1:10) в Nanodrop и BioAnalyzer, используя соответствующие протоколы производителя. ЭкстрактЫ РНК должны иметь, по крайней мере, значение RIN 8.0 и концентрацию 50 нг/ЗЛ. На рисунке 1 показан типичный результат для экстрактов РНК, полученных из листьев ячменя и семян.
   STOP POINT: Храните образцы в -80 градусов до использования.

2. синтез кДНК с последующим транскрипцией и маркировкой cRNA

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг подходит для обработки 24 образцов одновременно. Предполагается, что весь шаг проводится непрерывно в один день, но определены дополнительные точки остановки и паузы. Не забудьте предварительно согреть три микрофуговых тепловых блока на 80 градусов по Цельсию, 65 градусов по Цельсию и 37 градусов по Цельсию, прежде чем начать шаги ниже. Эти параметры температуры будут изменены, как указано в приведенных ниже шагах. Например, теплоблок 37 градусов цельсия будет установлен на 40 градусов по Цельсию после того, как готовится Спайк Микс (или если он уже подготовлен). Подготовка одноцветный Спайк Mix, T7 Промоутер Mix и cDNA мастер смеси с использованием низкого ввода Быстрый Amp Джин Экспрессия Маркировка Kit (см. Таблица материалов) на основе инструкций производителя. Этот препарат зависит от количества стартовых экстрактов РНК, которые обычно варьируются от 10 до 200 нг для общей РНК или 5 нг для РНК Полиа. Мы обычно используем 50 нг общей РНК в качестве исходного материала для гибридизации микроarray² и для метода, который будет описан ниже. При подготовке мастер-микс для 24 образцов добавьте 2 дополнительных реакции, чтобы учесть вариации пипетки. Всегда используйте нуклизы-бесплатные микрофуги трубки и нуклеаза воды в этом шаге.

1. Из-за высокой урожайности, как правило, разбавляют экстракт РНК в 100 раз, чтобы поместиться в диапазоне 50-100 нг. Основываясь на результатах количественной оценки РНК в шаге 1.9, сделайте 1:100 разбавления, добавив 1 зл очищенного экстракта РНК до 99 л безядерной воды в микрофуговой трубке 1,5 мл. Определите фактическую концентрацию этого разбавления с помощью Nanodrop.
   1. Сделайте второе разбавление каждого общего образца РНК в 1,5 мл микрофуга трубки, чтобы сделать 50 нг общей РНК в окончательном объеме 1,5 л. Держите все образцы на льду.
2. Приготовьте Spike Mix на основе инструкций производителя. Этот шаг также кратко изложен в Пюффельд и др. 2019². Для этого используйте теплоблок 37 градусов по Цельсию. Храните первое и второе разбавление одноцветного шипа смешивать положительные элементы управления в морозильной камере сверхнизкой температуры (-80 градусов по Цельсию) и проходить только через восемь повторных циклов замораживания/оттепели.
   1. Приготовьте третье и четвертое разбавление свежей ежедневно. Оттепель и хранить третий и четвертый разбавления шип смеси на льду перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразуйте температуру теплоблока 37 градусов по Цельсию до 40 градусов по Цельсию, когда был подготовлен спайк Микс (или если он был предварительно подготовлен).
3. Подготовка T7 Промоутер Mix и хранить на льду до использования. Достаточно 24 образцов:
   20.8 Л t7 промоутер грунтовка
   26,0 л безнужной воды
   46,8 л от общего объема T7 Промоутер Mix
4. Добавьте 1,8 л T7 Promoter Primer Mix (Шаг 2.3) в каждую микрофужную трубку, содержащую 1,5 л 50 нг РНК образца из шага 2.1. Смешайте компоненты должным образом, трубацией несколько раз. Денатурируйте РНК шаблон-праймер смесь путем инкубации в 65 градусов по Цельсию теплоблока в течение 10 минут. Немедленно поместите микрофуговые трубки на лед в рамках подготовки к следующему шагу.
5. В то время как denaturing шаблон-праймер смеси (Шаг 2.4), предварительно тепло 5x First Strand буфера на 80 градусов по Цельсию, по крайней мере 4 мин. Быстро подготовить синтез кДНК Master Mix из низкого ввода Быстрый Amp Labelling Kit (см. Таблица материалов) на основе инструкций производителя. Достаточно 24 реакций:
   52,0 л предварительно прогретого 5x Первого стрэнда буфера (шаг 2.5)
   26,0 л 0,1 М ДТТ
   13,0 л смеси 10 мМ dNTP
   31,2 л RNase Block Mix
   122,2 л общего объема синтеза кДНК Master Mix
   1. Оттепель каждого компонента на льду. Смешайте каждый компонент нежным пипеттингом. Держите Master Mix при комнатной температуре перед использованием.
      ВНИМАНИЕ: RNase Block Mix следует немедленно поместить обратно в морозильную камеру -20 градусов после использования.
6. Удалите РНК шаблон-праймер смесь на льду (Шаг 2.4) и центрифуги кратко при комнатной температуре, чтобы спина вниз все содержимое на дно микрофуга трубки. Распределите 4,7 зликат кДНК Master Mix (Шаг 2.5) к каждой трубке, тщательно смешивая труба вверх и вниз. Общий объем при добавлении всех компонентов должен составят 8,0 л.
   1. Синтезируйте кДНК в течение 2 ч в 40-C тепловой блок. Во время инкубации 2 ч, сдвините температуру теплоблока 65 градусов по Цельсию до 70 градусов по Цельсию в рамках подготовки к тепловой инактивации (Шаг 2.7).
      ФАКЦИОННАЯ PAUSE POINT: Храните образцы при -80 градусов на ночь. Эксперимент может быть продолжен на следующий день после тепловой инактивации (Шаг 2.7).
7. Инкубируйте каждую трубку в тепловом блоке в 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут, чтобы нагреть-интровировать RNase Block Mix. Перенесите трубки на лед немедленно и инкубировать, по крайней мере 5 мин.
8. В то время как образцы находятся на льду в течение 5 мин (шаг 2.7), быстро подготовить транскрипции Master Mix. Все компоненты можно комбинировать при комнатной температуре, но оттепель компоненты на льду. Достаточно 24 образцов:
   19,5 л безнужной воды
   83,2 л 5x Транскрипционный буфер
   15,6 л 0,1 МД ДТТ
   26,0 л смеси NTP
   5,5 л T7 РНК Полимераза Смесь
   6,2 л цианина 3-CTP (Cy3)
   156,0 л общего объема Транскрипция Мастер Mix
   ВНИМАНИЕ: T7 RNA Полимераза Смесь должна храниться в морозильной камере -20 градусов и помещены обратно сразу после использования. Кроме того, Cy3 является светочувствительным. Таким образом, смешивание (Шаг 2.9) и диспансеризация (Шаг 2.10) должны быть сделаны в условиях низкой освещенности. Для этого мы обычно выключаем любой свет прямо над лабораторной скамейкой.
9. Поскольку трубки подвергались резкому нагреванию и охлаждению (Шаг 2.7), кратко вращайте содержимое каждого образца с помощью микроцентрифуги для сбора всей жидкости в нижней части каждой микрофуговой трубки. Добавьте 6 ЗЛ транскрипции Master Mix (Шаг 2.8), аккуратно пайпетируя вверх и вниз. Общий объем этой реакции на данном этапе должен составить 16 л. Инкубировать трубки при 40 градусах по Цельсию в течение 2 ч для генерации CRNA с маркировкой Cy3.
   ФАКЦИОННАЯ STOP POINT: Трубки могут храниться при -80 градусов по Цельсию после транскрипции.
10. При генерации кРНК (шаг 2.9) установите температуру теплоблока до 55 градусов по Цельсию. Добавьте по крайней мере одну микрофуге-трубку безнуцкой воды в теплоблок. Эта безродичная вода будет использоваться для утилиза очищенной кРНК.
11. После транскрипции и маркировки cRNA очистите маркированную cRNA с помощью мини-набора RNeasy, как описано в шаге 3.

3. очистка cRNA

1. Очистите маркированную cRNA с помощью мини-комплекта RNeasy (см. Таблица материалов). Подготовьте буферы на основе инструкций производителя. Например, Buffer RPE поставляется в комплекте в концентрированной форме. Перед использованием добавьте 4 тома молекулярной биологии абсолютного этанола (96-100%).
2. Добавьте 84 злител безнужной воды к каждому образцу, чтобы отрегулировать общий объем до 100 л. Затем добавьте 350 зл буфера RLT и 250 л абсолютного этанола к каждой трубке. Тщательно перемешайте путем пипетки.
3. Передача 700 л каждой смеси на мини-колонку спина с 2 мл трубки сбора. Соберите маркированную cRNA на мембрану центрифугированием при 4 градусах по Цельсию при 7,534 х г. Откажитесь от проточной жидкости.
4. Вымойте каждый образец в 500 зл буфера RPE. Центрифуга и отбрасывайте поток через, как на предыдущем этапе. Повторите этот шаг один раз, а затем перейти к следующему шагу.
5. Перенесите мини-колонку спина в новую трубку сбора. Высушите образцы центрифугированием, как в шаге 3.3.
6. Перенесите мини-колонку спина в нуклеазно-бесплатную 1,5 мл микрофуга трубки, которая поставляется с комплектом. Выделите каждый маркированный образец cRNA, добавив 30 qL безнужной воды (предварительно разогретой при 55 градусах Цельсия) непосредственно в мембранный фильтр. Увеличьте elution путем инкубировать в блоке жары 55 градусов по Цельсию для 60 s.
7. Соберите маркированную cRNA центрифугированием при комнатной температуре 30 с при 7535 х г. Откажитесь от вращательной колонки и закройте каждую микрофуге-трубку. Немедленно поместите каждую трубку на лед.
   ФАКЦИОННАЯ STOP POINT: Образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию после elution.
8. Количественноcировать cRNA с Nanodrop с помощью microarray функцию. Установите образец на РНК-40. Получить следующие значения и записи в таблице: концентрация цианина 3 красителя (пмол / КЛ), коэффициент абсорбции РНК (260 нм/280 нм), и концентрация cRNA (нг / Л).
   STOP POINT: Немедленно храните образцы cRNA при -80 градусах по Цельсию после прочтения.
9. Вычислите урожайность cRNA и конкретную деятельность, подробно описанную в Пюффельде и др. 2019².

4. Гибридизация и сканирование Microarray

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает всего 3-4 ч и, следовательно, гибридизация 24 образцов может быть начата после обеда. Один оператор может комфортно работать до 4 слайдов (32 образца). Утро следующего дня выделяется для мытья и сканирования микрорейрок. Дополнительные заезды могут быть выполнены во второй половине второго дня. Этот шаг повторяется до тех пор, пока все образцы не будут гибридизированы и отсканированы. Настоятельно рекомендуется использовать безцветные, без порошкообразных латексных перчаток для обработки и обработки слайдов, чтобы убедиться, что образцы не загрязнены цветными пигментами, которые могут помешать анализу микроаррей. Помимо коммерчески доступных microarrays, следующие пользовательские массивы разработаны нашей группой и доступны для заказа от Agilent: Order Code 028827 для ячменя (Hordeumvulgare), 054269 для риса (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 дляриса(Oryzasativa subs. Indica) и 0489.

1. Выполните гибридизацию микроаррей с помощью набора гибридизации экспрессии генов (см. Таблица материалов). Подготовка 10x Блокирующий агент в соответствии с спецификацией производителя². Aliquot 10x Блокирующий агент в 200 порций и хранить при -20 градусов до использования. Каждого аликота достаточно для 40 гибридизации и стабилен до 2 месяцев.
2. В день, отведенный для гибридизации микроаррей, оттаивает один 200 qL aliquot 10x Блокирующий агент на льду. Кроме того, предварительно разогреть духовку гибридизации до 65 градусов по Цельсию и предварительно разогреть тепловой блок до 60 градусов по Цельсию для использования во время фрагментации кРНК.
3. Подготовьте фрагментацию Mix для каждого образца, описанного производителем². В нашей лаборатории, мы регулярно используем 600 нг линейно усиленной Cy3-маркированной cRNA для гибридизации в 8-пакет microarray. В этом случае приведенный ниже список обобщает компоненты фрагментации Mix на выборку:
   600 нг линейно усиленной кРНК, цианин 3-метки
   5 qL из 10x Блокирующего агента
   Отрегулируйте объем до 24 qL с нуклеазой-свободной водой
   1 кл/ с буфером фрагментации 25x
   25 л общего объема Фрагментация Mix
   1. Смешайте образцы осторожно с помощью вихревого смесителя. Спин все образцы кратко с помощью микроцентрифуга.
4. Инкубировать все образцы в теплоблоке 60 градусов по Цельсию ровно 30 мин. Немедленно охладите каждую трубку на льду в течение одной минуты, а затем быстро переходите к следующему шагу.
5. Чтобы полностью остановить реакцию фрагментации, добавьте 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM к каждой трубке. Смешайте осторожно, пипетка вверх и вниз, принимая большую осторожность, чтобы не ввести любые пузырьки во время смешивания. Мы обычно используем 25 зл гибридизации буфера, чтобы остановить реакцию фрагментации для 8-пакет microarray формата.
6. Центрифуга все трубы в течение 1 мин при температуре окружающей среды 15,750 х г. Быстро поместите все трубки на лед и загрузите каждый образец как можно быстрее.
7. Перед отъездом из лаборатории на 17 ч ночной инкубации, подготовить гибридизации сборки^2, как подробно описано в видео.
   1. CRITICAL STEP: Передача каждой гибридизации смесь и обойтись медленно в центре каждого прокладки хорошо, наблюдая большую осторожность, чтобы не ввести любые пузырьки во время дозирования. Мы обычно используем 44 qL смеси гибридизации для формата microarray 8-пакетов. Также поместите 44 л 1x буфера гибридизации в любых неиспользованных скважинах.
   2. Сразу же поместите microarray слайд с правильной ориентацией на верхней части прокладки слайда. Это нужно сделать очень осторожно, чтобы не пролить жидкость. Закройте сборку гибридизации плотно и поверните ее, чтобы проверить, не были ли введены постоянные пузырьки воздуха. Все пузырьки должны двигаться внутри слайда прокладки.
8. Поместите сборку камеры гибридизации в ротатор гибридизации печи. При использовании 2x GEx гибридизации буфера, установить скорость вращения до 10 оборотов в /м/ и гибридизировать на 65 градусов по Цельсию ровно 17 ч.
9. Вымойте гибридизированные микроаррей с помощью набора буфера gene Expression Wash (см. Таблица материалов). Подготовьте джин экспрессии мыть буферов 1 и 2 на основе инструкций производителя². Добавьте 2 мл 10% Triton X-102 в оба буфера (чисто необязательно, но настоятельно рекомендуется уменьшить заболеваемость microarray мыть артефакты)².
10. Подготовьте три сборки стиральной камеры, как описано в предыдущей публикации². Подробная информация о каждой камере мытья таблица таблица ниже(Таблица 1).
11. Aliquot 500 мл мыть буфера 1 в бутылке реагента 1 л и оставить при температуре окружающей комнаты. Подготовьте дополнительную бутылку реагента 1 L и этикетку с "Wash Buffer 1 Повторное использование", чтобы сохранить буфер стирки из первой камеры. Кроме того, aliquot 500 мл мыть буфер абафт 2 в бутылке реагента и инкубировать в 37 градусов по Цельсию водяной бане на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не покидайте лабораторию, не подготовив шаги 4.9 до 4.11. Они необходимы для стирки на следующий день.
12. На следующий день подготовьте буферы для мытья, как подробно описано в таблице 2. Заполните каждое блюдо до трех четвертей их соответствующего буфера. Каждый буфер стирки хорош для до 4-5 слайдов.
13. После ровно 17 ч гибридизации, получить одну камеру гибридизации и разобрать на скамейке лаборатории выстроились с ворсом свободной бумаги, как подробно описано в предыдущей публикации².
    1. CRITICAL STEP: Перенесите сэндвич с микроаррейми в Блюдо 1. Убедитесь, что штрих-код microarray находится в наклонном положении, и избежать погружения всего слайда в буфер. Обработайте каждый слайд microarray от их концов и не прикасайтесь к активной стороне слайда.
    2. Разделите два стеклянных слайда с помощью щипцы². Пусть прокладка слайд падение мягко в нижней части Блюдо 1, в то же время обеспечение того, чтобы microarray слайд твердо удерживается для следующего шага.
14. CRITICAL STEP: Медленно поднимите microarray слайды в сторону и немедленно передать в microarray стойку в Блюдо 2, как подробно описано в предыдущей публикации². Очень важно, чтобы слайды microarray минимально подвержены воздействию воздуха.
    1. Повторите шаги 4.13 и 4.14 до тех пор, пока восемь горок не будут в стойке. Равномерно распределите микроаррейные горки вдоль стойки. Этот шаг может быть сделан одним оператором без посторонней помощи на срок до 4 слайдов. Прикрепите держатель стойки и перенесите всю установку Блюдо 2 на первый магнитный мешалку. Осторожно перемешать ровно 1 мин.
15. Во время перемешивания в течение 1 мин (шаг 4.14), передача Блюдо 3 из мини-инкубатора 37 градусов по Цельсию и место на вершине второго магнитного мешалки. Аккуратно поместите Вымыть буфер 2 (от 37 кк водяной бане) на блюдо 3. Избегайте образования пузырьков во время заливки.
    1. После 1 мин перемешивание делается (Шаг 4.14), осторожно и медленно поднимите горку стойку от Блюдо 2 и передать блюдо 3. Снимите держатель стойки и перемешайте ровно 1 мин.
16. Медленно и осторожно поднимите стойку слайда от Блюдо 3. Обязательно избегайте образования буферных капель^2. Сухие стороны каждого слайда, нежно касаясь без ворса бумаги. Поместите каждый высушенный пятном слайд в слайд-поле и повторите шаг 4.16 до тех пор, пока все слайды microarray не будут в поле слайда. Высушите около 15 мин.
    НЕОБЯЗАТЕЛЬНАЯ СТОП-ПОЙНТ
17. Поместите каждый слайд microarray в держатель слайда, гарантируя, что штрих-код находится вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни озона внутри комнаты microarray должны быть 50 ppb (100 мкг/м³⁾или меньше. Это чисто необязательно, но настоятельно рекомендуется: используйте озоновой барьер слайд-обложка, чтобы избежать озоновой деградации цианина красителей.
18. Поместите собранные держатели слайдов в сканирующую карусель. Загрузите образцы последовательно, на основе номера штрих-кода. Сканирование слайдов сразу же с помощью сканера microarray (см. Таблица материалов), как подробно описано в предыдущей публикации².
19. После запуска, обусловите данные, чтобы функция извлечения и проверки КК, как подробно описано в предыдущей публикации².

Результаты

Этот метод оптимизирован для извлечения образцов семян зерновых, содержащих значительное количество загрязняющих крахмала или сахара. Он предназначен для извлечения общей РНК из 24 образцов семян в день. Она должна проводиться непрерывно в один день, но по всему протоколу определяются дополнительные точки остановки и паузы. Кроме того, читатель может использовать свои предпочтительные комплекты извлечения РНК или ручной метод химической добычи. Однако, основываясь на нашем предыдущем опыте, коммерчески доступные наборы для извлечения РНК растений не подходят для семян из-за значительного количества крахмала, белков, сахара и/или липидного загрязнения. В описанном методе химическая добыча сырой РНК сопровождается очисткой столба с использованием коммерческого комплекта для извлечения РНК. Это обычно обеспечивает РНК с более высоким качеством и выходом. На рисунке 1 показан результат запуска BioAnalyzer для проверки качества извлечения РНК с помощью описанного здесь метода. Результаты представлены для листьев ячменя (образцы 1 и 2, представляющие низкое содержание крахмала образцы) и семена ячменя (образцы 3 и 4, представляющие высокий содержание крахмала образцов). Значение целостности РНК (RIN) для всех образцов составляет 10.

На рисунке 1 показан представительный гель очищенного экстракта РНК, где качество было протестировано с помощью биоанализа. Образцы 1 и 2 являются типичными результатами для образцов низкого содержания крахмала, таких как листья ячменя, где видны дополнительные полосы рРНК из хлоропластов. Образцы 3 и 4 являются репрезентативными результатами для образцов высокого содержания крахмала, таких как семена ячменя, показывающие 18S и 28S rRNA. Обратите внимание, что никакая автоматизированная стоимость RIN не может быть рассчитана для зеленых тканей растений, таких как образцы листьев, из-за хлоропластовой rRNA. Тем не менее, целостность и высокое качество могут быть визуально установлены на отсутствие каких-либо продуктов деградации, которая обычно появляется как низкий молекулярный мазок. Значение RIN для образцов семян высокого крахмала, таких как семена ячменя, как правило, 10 с использованием протокола, описанного в настоящей работе.

Кроме того, мы также представляем здесь репрезентативные данные эксперимента курса времени двух элитных линий ячменя (Sofiara и Victoriana), используемых для анализа качества солода¹⁹. Во время солодового процесса крахмал преобразуется в сахар. Поэтому в образцах представлены ткани с различной пропорцией содержания крахмала и сахара. Поскольку процесс промышленного солодовки похож на процесс прорастания, были проанализированы транскриптомы двух линий ячменя, отличающихся по качеству солодового. РНК были извлечены из прорастающих семян на 2, 24, 48, 72, 120, 144 и 196 h после впитывания в биологических трипликатов. Подготовка РНК и гибридизация к настроенному чипу микроаррей ячменя были выполнены, как описано выше. Рисунок 2 указывает на нормализованную сетку, зачитанную из гибридизации микроарла, приведенной в отчете по контролю качества (кВ)(рисунок 3)и графике гистограммы для обнаруженных сигналов. Сетка приводит пример производных сигналов из каждого угла чипа, включая фон и пик-в считывании точек, используемых для калибровки. Гистограмма указывает на отклонение обнаруживаемых точек с соответствующей интенсивностью сигнала. Успешная гибридизация дает широкую гауссовскую кривую с незначительными выбросами, как показано на рисунке. Неудачные гибридизации могут привести к сильному сдвигу в одну сторону ("зеленые монстры").

Наконец, репрезентативный результат приемлемых значений отображается в столбце 4 на рисунке 3. Чтобы показать надежность проведенных экспериментов, результаты оцениваются с помощью программного обеспечения GeneSpring. Собранные данные представлены в качестве основного компонентного анализа (PCA). PCA интегрирует значения выбранных точек (генов) в качестве вектора. Количество используемых точек может варьироваться от нескольких сотен до всего чипа и зависеть от используемого программного обеспечения. Каждый чип (образец) приводит к одному значению (вектору), которое является результатом интегрированной интенсивности сигнала для исследуемых точек. Таким образом, относительное положение в графике (PCA) указывает на сходство образцов друг с другом. Чем ближе образцы, тем они больше похожи. Технические репликации должны быть ближе друг к другу, чем биологические, а биологические репликации образца должны сгруппироваться ближе друг к другу, чем образцы из разных временных точек, тканей или условий.

Рисунок 1: Электрофорез файл запустить резюме, полученное после проверки качества РНК с Bioanalyzer. Образцы 1 и 2 представляют сярю ячмена, как указано дополнительными рибосомными полосами из хлоропластов. Образцы 3 и 4 представляют собой ткань семян ячменя с 18S и 28S rRNA полос ы показано. Коэффициент RIN не всегда рассчитывается для зеленых тканей, таких как листья, но в соответствии с гель, качество РНК очень хорошо. Значение RIN для образцов 3 и 4 составляет 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Отчет о КК от успешной гибридизации ячменя microarray. А- указывает на обнаруженные сигналы на сетке со всех углов чипа. Гистограмма показывает количество сигналов, классифицированных в соответствии с интенсивностью сигнала (флуоресценция) как logarithm после фонового вычитания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Резюме контроля качества (КК) после гибридизации и сканирования. Значения для гибридизированного слайда приведены в столбце 2 (значение), а диапазон приемлемых значений отображается в столбце 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Уош палата Ассамблеи	Содержимое и этикетка	Цель
Блюдо 1	Пустые, оставьте на лабораторной скамейке до следующего дня	Заполните с мытьем буфера 1 на следующий день, используется для разборки microarray слайды
Блюдо 2	Добавьте одну стойку слайда microarray и небольшую магнитную панель перемешивания; этикетка с "Wash Buffer 1", оставьте на лабораторной скамейке до следующего дня	Используется для мытья microarray слайды с мытью буфера 1 на следующий день
Блюдо 3	Добавьте одну небольшую магнитную панель перемешивания, наклейте этикеткой с надписью "Wash Buffer 2" и поместите в мини-инкубатор 37 градусов по Цельсию.	Используется для мытья microarray слайды с мытью буфера 2 на следующий день внутри 37 КК мини-инкубатор

Таблица 1: Подготовка сборок стиральной камеры.

Шаги	Блюдо	Вымойте буфер	Температура	Время
Разборка	1	1	Окружающей среды	Как можно быстрее
(Шаг 4.13)
Первая стирка	2	1	Окружающей среды	1 мин.
(Шаг 4.14)
Вторая стирка	3	2	37 кк	1 мин.
(Шаг 4.15)

Таблица 2: Температура инкубации и время сборки стиральной камеры.

Обсуждение

Описанный метод обеспечивает высоковоспроизводимые результаты для высокодоходных и высококачественных экстрактов РНК(рисунок 1). Основываясь на нашем опыте, мы рекомендуем три биологические репликации для одного генотипа, стадии или условия для анализа. Чтобы быть в состоянии обнаружить статистически значимые различия, общее изобилие мРНК должны быть рассмотрены. Пожалуйста, обратите внимание, однако, что начальное количество 200 мг образцов ткани требуется в трипликидляы для шага экстракции РНК. Следовательно, для экспериментов, которые имеют ограниченное количество образцов, таких как генетически модифицированные растительные материалы, этот метод может быть неуместным.

При гибридизации микроаррей наиболее важны следующие шаги: (1) загрузка образцов на горку прокладки (Шаг 4.7) и (2) промывание массивов после гибридизации (Шаги 4.13 и 4.14). Загрузка образцов должна быть сделана очень тщательно, чтобы избежать образования пузырьков и разлива жидкости. Осторожность необходима при размещении microarray слайд на прокладке слайд, содержащий загруженные образцы: ДНК-стороне (с пятнистыми зондами) должны быть лицом вниз, чтобы гибридизации. Для мытья микроаррей, второй шаг мытья особенно критично: здесь, удаление слайдов из буфера мытья 2 должно быть выполнено очень медленно (10 с), чтобы избежать буфера артефактов на слайдах, которые могут помешать сбору данных и анализу.

Для того, чтобы получить результаты эксперимента по гибридизации, которые имеют право на анализ биоинформатики ниже потока, следует следовать нескольким важным критериям. Отчет КК, который генерируется после выполнения вышеуказанного протокола, дает хорошее представление о том, что должно быть улучшено, а какие данные находятся в пригодном для использования состоянии(рисунок 3). Первая полученная информация является визуализированной сетки(рисунок 2). Здесь можно сразу увидеть, если все области для флуоресценции считывания правильно выровнены. При визуальном сдвиге это повлияет на все другие значения (фон, интенсивность сигнала и т.д.), и считывание этого чипа не может быть использовано. На обзоре (пространственное распределение всех выбросов) можно легко обнаружить любое загрязнение (например, пыль или волосы), которое повлияло на результат. Грязь может быть удалена путем мягкого дует и повторного сканирования чипа. Гистограмма сигнального участка, как упоминалось выше, должна привести к широкой кривой в форме Гаусса, и только незначительные выбросы (Рисунок 2). В зависимости от ткани проанализированы (Рисунок 1), эта кривая может выглядеть по-разному и может появиться иметь два пика, или один преобладающий пик с плечом. Это не повлияет на качество данных. Только сильный сдвинутый пик, или высокие сигналы по краям указывают на проблемы, такие как "зеленые монстры" (слишком высокая интенсивность флуоресценции), которые не могут быть удалены путем стирки и должны быть доведены до сведения производителя чипов. Кроме того, "График пространственного распределения для медианных сигналов" должен меняться вокруг общего значения. Это должно быть в диапазоне от 40 до 100, в зависимости от общей интенсивности считывания чипа проанализированы. Другим важным контролем качества является оценка всплеска данных: журнал-график для всплеска сигналов должен привести к линейной и регулярной линии. Наконец, таблица "метрики оценки" дает хорошее и надежное представление о полученных результатах. Здесь производитель предоставляет ряд значений, которые могут быть классифицированы как Отлично, Хорошо и оценить(рисунок 3). Согласно нашему опыту, некоторые ценности не всегда могут быть применены ко всем фишкам. Для чипсов, изготовленных на заказ риса, "неконтрольное значение" часто выходило из диапазона, но не оказывает существенного влияния на дальнейшую обработку данных. Кроме того, диапазон для "NegControl" может быть расширен, на основе ткани, организма и общего выхода чипа до злт;80. Диапазон для оценки значения E1 med CV может быть расширен до злт;9, а не lt;8 в соответствии с нашим опытом. После этого возможна надлежащая оценка всех данных, зачитаных чипами. В общем, всегда следует иметь в виду, что независимые биологические репликации всегда дают самый надежный результат.

Преимущество этого метода по сравнению с другими методами заключается в том, что он представляет собой экономически эффективный, высокопроизводительный метод транскрипционного профилирования. Кроме того, конвейер анализа данных ниже по течению проще и установиться. Несмотря на преимущества, существуют определенные ограничения этой техники, такие как количество генов, которые могут быть проанализированы. Микроаррей может только облегчить анализ генов, ранее замеченных зондов на массиве. Таким образом, этот метод применим только к видам растений с секвенированными геномами и полностью аннотированными генами. Мы предусматриваем, что транскриптомика на основе микроаррей будет по-прежнему очень полезной и актуальной не только для профилирования экспрессии генов, но и для других трубопроводов биоинформатики, таких как анализ регулятивной сети генов и исследование ассоциации в масштабах всей транскриптома.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ß-mercaptoethanol	Roth	4227.3	Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies		To determine quality and quantity of RNA extract
Crushed ice maker	Various brands		To keep samples on ice during sample processing
Dewar flask	Various brands		Used as liquid nitrogen container
Ethanol, absolute	Roth	9065.1
Gene Expression Hybridization Kit	Agilent Technologies	5188-5242	Kit components: 2X Hi-RPM Hybridization Buffer 25X Fragmentation Buffer 10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit	Agilent Technologies	5188-5325	Kit components: Gene Expression Wash Buffer 1 Gene Expression Wash Buffer 2 Triton X-102
Heat block	Various brands		It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes
Hybridization oven	Agilent	G2545A	Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.
Hybridization gasket slide kit	Agilent	G2534-60014
iQAir air cleaner			To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area
Isopropanol	Roth	9866.5
Lint-free paper, Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit	Agilent Technologies	5190-2305	Kit components: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small			Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.
Microarray scanner	Agilent Technologies		Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended
Microfuge tubes, nuclease-free	Various brands		2.0 mL and 1.5 mL volume
Microcentrifuge	Eppendorf	5810 R	It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes
Mini incubator	Labnet	I5110-230V	Any small incubator will do.
Mortar and pestle			Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Nanodrop 1000	Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water	Biozym	351900302
One-Color RNA Spike-In Kit	Agilent	5188-5282	Kit components: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit	Agilent	G2505-60550	Optional but highly recommended
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free	Stratagene	Z376426
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)	Roth	A156.2
Pipette tips, nuclease free, filter tips	Various brands		To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
Pipettor set	Various brands		For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
RNA Extraction Buffer	10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoethanol		We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily
RNase-free DNase set	Qiagen	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RW Buffer RPE Nuclease-free water
RNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	74904	Kit components: RNeasy mini spin column (pink) QIAshredder spin column (purple) 1.5 ml collection tubes 2 ml collection tubes Buffer RLT Buffer RLC Buffer RW1 Buffer RPE Nuclease-free water
Slide holders for DNA microarray scanner	Agilent	G2505-60525
Slide staining dish with removable rack	DWK Life Sciences 900200	Fisher Scientific 08-812	We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)
Sodium chloride	Roth	P029.1
Ultralow temperature freezer	Various brand		Capable of storing sample at -80 °C
Vortex mixer	Various brands		At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes