JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод использует масс-спектрометрическую визуализацию (MSI) для понимания метаболических процессов в листьях S. alba при воздействии ксенобиотиков. Метод позволяет пространственно локализовать интересующих соединений и их прогнозируемые метаболиты в пределах специфических, интактных тканей.

Аннотация

Представленный способ использует масс-спектрометрическую визуализацию (MSI) для установления метаболического профиля листьев S. alba при воздействии ксенобиотиков. Используя нецелевой подход, растительные метаболиты и ксенобиотики, представляющие интерес, идентифицируются и локализуются в тканях растений для выявления конкретных моделей распределения. Затем in silico выполняется прогнозирование потенциальных метаболитов (т.е. катаболитов и конъюгатов) из идентифицированных ксенобиотиков. Когда ксенобиотический метаболит находится в ткани, регистрируется тип фермента, участвующего в его изменении растением. Эти результаты были использованы для описания различных типов биологических реакций, происходящих в листьях S. alba в ответ на накопление ксенобиотиков в листьях. Метаболиты были предсказано в двух поколениях, что позволило документировать последовательные биологические реакции для преобразования ксенобиотиков в тканях листьев.

Введение

Ксенобиотики широко распространены по всему миру благодаря деятельности человека. Некоторые из этих соединений являются водорастворимыми и поглощаются почвой1,и попадают в пищевую цепь при накоплении в тканях растений2,3,4. Растения поедаются насекомыми и травоядными животными, которые являются добычей других организмов. Прием некоторых ксенобиотиков и их влияние на здоровье растения были описаны5,6,7,8,но только недавно на тканевом уровне9. Поэтому до сих пор неясно, где и как происходит метаболизм ксенобиотиков, или коррелируют ли специфические растительные метаболиты с накоплением ксенобиотиков в конкретных тканях10. Более того, большинство исследований упускают из виду метаболизм ксенобиотиков и их метаболитов в растениях, поэтому мало что известно об этих реакциях в тканях растений.

Предложен способ исследования ферментативных реакций в биологических образцах, которые могут быть связаны с тканевой локализацией субстратов и продуктов реакций. Метод может нарисовать полный метаболический профиль биологического образца в одном эксперименте, так как анализ не является целевым и может быть исследован с использованием пользовательских списков интересующих аналитов. Предоставляется список кандидатов, отслеживаемых в исходном наборе данных. Если в образце отмечен один или несколько интересующих аналитов, конкретная локализация ткани может предоставить важную информацию о связанных биологических процессах. Интересуемые аналиты затем могут быть модифицированы in silico с использованием соответствующих биологических законов для поиска возможных продуктов/метаболитов. Полученный список метаболитов затем используется для анализа исходных данных путем идентификации вовлеченных ферментов и локализации реакций в тканях, тем самым помогая понять происходящие метаболические процессы. Ни один другой метод не предоставляет информацию о типах реакций, происходящих в биологических образцах, локализации интересующих соединений и связанных с ними метаболитах. Этот метод может быть использован на любом типе биологического материала, как только свежие и неповрежденные ткани доступны, а представляющие интерес соединения могут быть ионизированы. Предлагаемый протокол был опубликован в Villette et al.12 и подробно описан здесь для использования научным сообществом.

протокол

1. Пробоподготовка

  1. Получите биологический образец и либо сохраните его свежим и неповрежденным (например, не заставляйте его в пробирку), либо заморозьте его. Предлагаемый протокол применяется к любому типу твердого биологического образца (т.е. растительных, животных или тканей человека) для локализации соединений в конкретных тканях.
  2. Охладить криомикротом до -20 °C. Держите держатель образца и лезвие при одинаковой температуре.
  3. При необходимости встраивают объект во встраиваемую среду М1 для сохранения его во время резки.
    1. Вылейте немного матрицы в пластиковую форму, помещенную в криомикротомную камеру. Быстро добавьте образец и залейте еще немного встраиваемой среды, чтобы покрыть его. Поддерживайте образец в центре формы, когда матрица затвердевет при охлаждении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание не является необходимым для всех биологических объектов. Однородные объекты, такие как мозг мыши, не нуждаются во встраивающей среде и могут быть заморожены.
  4. Поместите внедренный или замороженный образец на держатель криомикротома и вырежьте его острым лезвием. Толщина 5–30 мкм хороша для образцов растений, которые трудно обрезать из-за их неоднородности. Адаптируйте толщину и температуру резания к образцу, сделав несколько разрезов, чтобы найти наилучшие условия. В приведенном примере образец разрезали при -20°C. Рассмотрите возможность сохранения образца при 0 °C, чтобы избежать деградации образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование бинокулярного микроскопа, размещенного рядом с криомикротомом, может помочь определить качество срезов. Ткани должны оставаться нетронутыми.
  5. Осторожно переместите срез на слайд, покрытый ITO, с помощью щипцов или небольшой кисти, затем поместите палец под слайд, чтобы разогреть и высушить образец. Держите слайд в криомикротомной камере до тех пор, пока все образцы не будут готовы. Медленно вынимайте затвор из камеры, чтобы избежать теплового удара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить, какая сторона горки покрыта ITO, поместите каплю воды на горку при комнатной температуре (RT). Капля останется круглой на стороне с покрытием ITO или сплющенной на стороне без покрытия.
  6. Нарисуйте метки на слайде с помощью тонкого маркерного пера или корректирующей жидкости и отсканируйте его с помощью сканера высокого разрешения перед наложением матрицы. Метки будут использоваться для определения точного положения образца на слайде, когда он находится в масс-спектрометре. Лучший способ получить точные точки отсчета — нарисовать крест.

2. Матричное осаждение

  1. Приготовьте матрицу MALDI: взвесьте 70 мг матрицы α-циан-4-гидроксициннамовой кислоты (HCCA) и разбавьте ее в 10 мл раствора воды и метанола (50:50) с 0,2% TFA. Обуславливать матрицу ультразвуком в течение 10 минут на RT. После ультразвуковой обивки может появиться сверхтвердая матрица.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные типы матриц MALDI могут быть использованы в зависимости от интересующих аналитов.
  2. Очистите матрицу робота для осаждения 100% метанолом.
  3. Используя метанол и прецизионную протирку, очистите слайд, удерживая образцы, не прикасаясь к ним и не удаляя следы. Добавьте чистый обтекаемый лист поверх слайда в области без образца. Эта часть слайда затем помещается над оптическим детектором для отслеживания матричного осаждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптического отслеживания толщины матрицы слайд и крышка должны быть очень чистыми.
  4. Используйте робота для матричного осаждения: поместите в резервуар только 6 мл матричного раствора и добавьте 2 мл 100% метанола на общий объем 8 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запись толщины матрицы вдоль осаждения происходит автоматически и может быть восстановлена с помощью USB-накопителя. Разработка метода распыления здесь не детализирована.

3. Сбор данных

  1. Поместите 1 мкл матрицы на пластину MALDI для калибровки масс-спектрометра, используя матричные пики в качестве эталонов. Разработка метода сбора на масс-спектрометре здесь не детализирована.
    1. Вставьте пластину MALDI в источник, нажмите«Load Target»в программном обеспечении ftmsControl и дождитесь загрузки пластины.
    2. Выберите положение пятна матрицы, щелкнув по месту на изображении, представляющем пластину MALDI.
    3. Укажите имя образца и папку на вкладке"Сведения об образце"программного обеспечения.
    4. Начните приобретение, нажав кнопку«Приобретение».
    5. Слегка переместите пластину во время захвата с помощью указателя мыши на вкладке«MALDI video»так, чтобы лазер указывал на разные места.
    6. Когда сбор будет завершен, перейдите на вкладку«Калибровка»,выберите список калибровки HCCA в квадратичном режиме и нажмите «Автоматически». Глобальный результат калибровки указывается в окне«Калибровочная диаграмма»и должен быть менее 0,2 ppm для SolariX XR 7T.
    7. Если калибровка хорошая, нажмите«Принять»и сохраните метод.
  2. После завершения матричного осаждения на образцах поместите слайд в адаптер для слайдов и извлеките положение меток с помощью пластиковой крышки.
  3. В программном обеспечении flexImaging настройте новый запуск образа с помощью первого окна, которое откроется вместе с программным обеспечением.
    1. Присвойте имя запуску образа, выберите каталог результатови нажмите кнопку Далее.
    2. Укажите размер растров (т.е. определяемую пользователем область измерения), выберите используемый метод (откалиброванный в разделе 3.1) и нажмите кнопку Далее.
    3. Загрузите оптическое изображение слайда, полученное на шаге 1.6, после сканирования слайда и нажмите кнопку Далее.
    4. Изображение откроется в более широком окне. Используйте метки на слайде, чтобы научить положению слайдов: в ftmsControlпоместите цель видеоокна MALDI на точное положение метки, затем вернитесь в felxImaging и нажмите на ту же точку на оптическом изображении. Повторите это для трех независимых точек. Пластиковая крышка с маркировкой помещается на пластину MALDI, чтобы восстановить свое положение и облегчить обучение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если отметки были сделаны маркером, добавление белой корректировочной жидкости в задней части слайда может выделить их во время обучения.
  4. Нарисуйте интересующие области в образцах в программном обеспечении flexImaging с помощью инструментов«Добавление областей измерения».
  5. Сохраните запуск образа ипоследовательность AutoXecute,если необходимо проанализировать несколько образцов.
  6. Запустите последовательность с помощью"AutoXecute Batch Runner",если проанализировано несколько образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно синхронизируйте данные с безопасным местом.

4. Обработка данных

  1. Импортируйте необработанные данные в программное обеспечение визуализации (SCiLS Lab) и создайте набор данных. Это делается в два отдельных шага в этом программном обеспечении.
    1. Используйте инструмент«Batch Importer»и выберите необработанные данные, укажите целевой каталог и нажмите«Импорт».
    2. После импорта можно объединить несколько наборов данных для дальнейшего анализа. Для объединения наборов данных используйте параметр"Файл| Новинка| Набор данных".
    3. Выберите тип инструмента, используемого для сбора, добавьте импортированные наборы данных, нажав кнопку «+», и упорядочить изображения, щелкнув и перетащив объекты.
    4. Проверьте настройки диапазона масс или при необходимости измените его, указав интересующий диапазон. Нажмите кнопку Далее, чтобы просмотреть сводку импорта и запустить импорт.
  2. Визуализируйте m/z интереса в различных тканях образца и/или в разных образцах. Просто нажмите на спектры, чтобы выбрать интересующих m/z или введите значение в поле m/z.
    1. Выполняйте статистические тесты, если это необходимо для поиска колокализованных или дискриминативных значений между различными тканями и / или различными образцами, чтобы определить интересующее м/з. Инструменты доступны в меню«Инструмент»и не будут описаны в этом протоколе.
  3. Экспортируйте интересующих m/z (например, колокализованные, дискриминирующие соединения) в виде файла .csv с вкладки Объект. Весь набор данных также может быть экспортирован, если он не слишком велик (т. Е. Максимум 60 000 строк). Нажмите на значок«Экспорт»в правой части интересуемой области, обозначенной красной стрелкой.
  4. Импортируйте файл .csv, чтобы создать новый набор данных в программном обеспечении для аннотаций (Metaboscape). Нажмите на "Проекты | Импорт CSV проекта". Имейте в виду, что будет учитываться только точный m/z, и изотопный профиль будет потерян.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Версия программного обеспечения 5.0 позволяет напрямую импортировать данные из программного обеспечения визуализации, что позволяет более точно аннотировать, поскольку можно рассмотреть изотопный профиль.
  5. Аннотировать с помощью пользовательских списков анализируемых материалов, которые могут быть получены из общедоступных баз данных. Шаблон предоставляется программным обеспечением для создания списков анализируемых материалов.
  6. Используйте программное обеспечение для прогнозирования (Metabolite Predict) для выполнения in silico прогнозирования метаболитов аннотированных соединений. Необходима разработанная формула соединения процентов, либо нарисованная пользователем в программном обеспечении, либо импортированная в виде файла .mol. Тогда метод представляет собой простой пошаговый протокол.
  7. Восстановите список метаболитов, создайте список анализируемых и используйте его в программном обеспечении для аннотаций для аннотирования необработанных данных с предсказанными метаболитами. Альтернативно, если список метаболитов короткий, вручную выполните поиск на шаге 4.8.
  8. Визуализируйте тканевое распределение метаболитов в необработанных данных в программном обеспечении визуализации.
  9. Восстановите названия ферментов, участвующих в метаболических процессах, в программном обеспечении прогнозирования, щелкнув правой кнопкой мыши на прогнозируемом метаболите, представляющим интерес.

Результаты

Этот протокол был применен к свежим листьям, отобранным из дерева S. alba, подвергаемого воздействию ксенобиотиков в окружающей среде. Процесс показан на рисунке 1. Первым шагом является приготовление тонких кусочков интересуемого образца. Образцы растений часто тру?...

Обсуждение

Важнейшей частью этого протокола является пробоподготовка: образец должен быть мягким и неповрежденным. Резка является наиболее сложной частью, так как температура и толщина образца могут варьироваться в зависимости от типа исследуемого образца. Ткани животных обычно однородны и их ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Шарля Пино, Мелани Лагарриг и Режиса Лавиня за их советы и рекомендации по подготовке образцов для визуализации образцов растений MALDI.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cover slipsBruker Daltonics267942
CryomicrotomeThermo Scientific
ExcelMicrosoft corporation
flexImagingBruker Daltonics
ftmsControlBruker Daltonics
GTX primescanGX Microscopes
HCCA MALDI matrixBruker Daltonics8201344
ImagePrepBruker Daltonics
ITO-coated slidesBruker Daltonics237001
M1-embedding matrixThermoScientific1310
Metabolite PredictBruker Daltonics
MetaboscapeBruker Daltonics
MethanolFisher ChemicalsNo specific reference needed
MX 35 Ultra bladesThermo Scientific15835682
Plastic moldsNo specific reference needed
SCiLS LabBruker Daltonics
SolariX XR 7TeslaBruker DaltonicsThe method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrepBruker Daltonics8261614
TFASigma AldrichNo specific reference needed

Ссылки

  1. Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
  2. Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
  3. Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
  4. Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
  5. Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
  6. He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
  7. Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
  8. Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
  9. Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
  10. Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
  11. Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
  12. Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
  13. Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

160MSISalix albaMALDI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены