Непрерывное измерение биологического шума в Escherichia Coli с использованием замедленной микроскопии

Резюме

Эта работа представляет собой метод микроскопии, который позволяет живую визуализацию одной клетки кишечной палочки для анализа и количественной оценки стохастичного поведения синтетических цепей генов.

Аннотация

Разработанный здесь протокол предлагает инструмент, позволяющий компьютерному слежению за делением кишечной палочки и флуоресцентными уровнями в течение нескольких часов. Процесс начинается с скрининга для колоний, которые выживают на минимальных средств массовой информации, предполагая, что только Escherichia coli укрывательство правильной плазмиды сможет процветать в конкретных условиях. Поскольку процесс построения больших генетических схем, требующих сборки многих частей ДНК, является сложной задачей, компоненты цепи часто распределяются между несколькими плазмидами на разных числах копий, требующих использования нескольких антибиотиков. Мутации в плазмиде могут разрушить транскрипцию генов устойчивости к антибиотикам и вставить с ресурсами управления в клетке, что приводит к некрозу. Выбранная колония установлена на стеклянном дне чашки Петри и несколько плоскостей фокусировки выбраны для отслеживания микроскопии как в ярком поле, так и в флуоресцентных областях. Протокол сохраняет фокус изображения в течение более 12 часов при первоначальных условиях, которые не могут регулироваться, создавая некоторые трудности. Например, мертвые клетки начинают накапливаться в поле фокусировки линз после нескольких часов визуализации, что приводит к накоплению токсинов и сигналу к размытию и распаду. Истощение питательных веществ вводит новые метаболические процессы и препятствует желаемой реакции цепи. Температура эксперимента снижает эффективность индукторов и антибиотиков, что может еще больше повредить надежность сигнала. Минимальный медиа гель сжимается и высыхает, и в результате оптический фокус меняется с течением времени. Мы разработали этот метод для преодоления этих проблем в Escherichia coli, по аналогии с предыдущими работами разработки аналогичных методов для других микроорганизмов. Кроме того, этот метод предлагает алгоритм количественной оценки общего стохастичного шума в неизмененные и измененные клетки, вывод о том, что результаты согласуются с прогнозами анализатора потока, как показано на аналогичном коэффициенте изменения (CV).

Введение

Синтетическая биология является междисциплинарной области, которая возникла в последнее десятилетие и направлена на перевод инженерных принципов^{проектирования в рациональном биологическом дизайне 1,2,3}, в попытке достичь мульти-сигнал интеграции и обработки в живых^{клетках для понимания фундаментальных наук 4,}5 ,^{диагностических,терапевтических и биотехнологических приложений 6,7,8,9,10}. Наша способность количественно ввода-выходной реакции синтетических генных цепей была революционизирована в результате недавних достижений в одноклеточной технологии, включая анализатор потока и живую визуализацию клеток с помощью автоматизированной микроскопии^{замедленного действия 11}. Анализатор потока часто используется для измерения реакции этих цепей в^{устойчивом состоянии 1,12}, и перевернутая микроскопия используется для измерения динамической реакции синтетических цепей генов на уровне одной клетки³. Например, одна из ранних работ в синтетической биологии включала строительство генетических осцилляторных сетей в живых клетках с использованием циклов отрицательной обратной связи с^{задержкой 3.} Позже, генетические схемы осциллятора были применены, чтобы понять метаболический контроль в динамической среде живых^{клеток 4.} Автоматизированная микроскопия замедленного действия является одним из методов характеристики таких схем. Мы предполагаем, что клетки-хозяина, Escherichia coli, синхронизируют при формировании микро колоний, позволяя измерять сигнал и расчет шума без отслеживания точных отношений матери и дочери.

Шум является фундаментальным, неотъемлемым аспектом биологических систем, часто вытекающих из нескольких источников. Рассмотрим, например, биохимические реакции, связанные с сигналами, которые возникают от транспортировки дискретных случайных носителей, таких как^{диффузия белков 13}. Эти сигналы распространяются со случайными колебаниями¹⁴. Другими источниками шума являются наличие ресурсов, деление клеток и изменения в условиях окружающей среды, таких как температура, влажность и давление. Биологические сигналы, которые распространяются в синтетических генных схемах, часто имеют очень низкий коэффициент сигнала к шуму (SNR), что нарушает производительность таких схем. Таким образом, генетическая схема дизайна остается одним из самых сложных аспектов генной^{инженерии 15}. Например, в отличие от большинства подходов, которые вычисляют только среднее выражение гена (измеряется по всей популяции клеток), разница измеренного сигнала считается для того, чтобы инженер предсказуемого поведения через синтетические^{сети генов 12}. Таким образом, уровни изменчивости или шума в экспрессии белка играют доминирующую роль в проектировании и производительности аналоговых и цифровых^{генных схем 1,16,17.}

Многие подходы были разработаны для количественной оценки изменчивости клеток к клетке, в том числе в Escherichia coli^3,7,18. Эти методы часто используются для изучения активации генов и метаболических путей, однако с меньшим акцентом на изучение стохастичной динамики шума, как измерение и разобщание конкретных источников шума, особенно для генетических схем в живых клетках, где это фундаментальная проблема^19,20,21. Несколько факторов, оба унаследованных к самой цепи (внутренне) и выведенных от клеток хозяина (внешних), могут нарушить непрерывную работу генетических цепей. В этой статье мы разработали протокол, который направлен на количественную оценку общего шума в клетках кишечной палочки, включая внутренние и внешние^{источники шума 6,22}. Путем количественной оценки общего шума, а затем оценки SNR²³, дизайн генных схем может быть улучшена. Этот метод может быть изменен для измерения независимых источников шума отдельно, путем мониторинга нескольких флуоресцентных^{белков 6,20.} Для протокола, описанного здесь, мы держим условия окружающей среды хорошо контролируемыми и постоянно измеряем активность клеток без влияния внешних факторов. Мы измеряем сигнал от флуоресцентных белков в одиночных клетках с течением времени и одновременно изымаем их под подложку агарозы. Полученные изображения анализируются с помощью пользовательского MATLAB лаборатории.

В идеале, непрерывное измерение активности флуоресцентных белков в клетке в режиме реального времени будет производить точные данные через рост и деление клеток. Однако получение таких данных является сложной задачей. Это связано с деградацией флуоресцентных белков, известных как^{фотоотбеление 7}, когда они подвергаются воздействию радиации в процессе возбуждения. Кроме того, клетки кишечной палочки Escherichia также чувствительны для возбуждения, что может привести к фототоксичности⁷. Оба вопроса ограничивают количество фоторамок, которые могут быть приобретены, и время между приобретениями. Субстрат и средние типы (например, лизегенный бульон), который используется для выращивания клеток во время визуализации, также играют решающую роль. Мы настоятельно рекомендуем использовать минимальную среду, которая сводит к минимуму нефлуоресцентный фон и расширяет время деления клеток.

Кроме того, образец должен быть подготовлен с учетом следующих требований (1) Низкий уровень деления клеток позволяет менее частые воздействия для тщательного изображения цикла деления и снижения вероятности фототоксичности и фотоотчивания. Мы установили время приобретения примерно на половину прогнозируемого времени митоза (2) Низкая плотность клеток в начале эксперимента позволяет лучше единообразие и отслеживаемость деления. Плотность клеток зависит от коэффициента разбавления клеток кишечной палочки, что является важным параметром успеха этого протокола и должно быть определено для каждой лаборатории. Для того, чтобы установить соотношение, каждый новый штамм кишечной палочки или используемых средств массовой информации должны быть оснащены графиками темповроста (Дополнительный рисунок 1). Соответствующее соотношение было достигнуто, если клетки могут расти без дополнительной тряски после короткой инкубации от первоначальной_{плотности около OD 600nm} и 0,1. Клетки на этом этапе будут делиться в зависимости от температуры окружающей среды только (3) Ограничение движения клеток: движение клеток сильно зависит от упрямости субстрата (агарозной площадки). Твердость субстрата зависит от количества общей агарозы и времени затвердевания геля. Гели не могут быть оставлены для затвердеть на ночь при комнатной температуре, так как кишечная палочка Escherichia будет проходить митоз. Другие факторы, влияющие на стабильность субстрата, включают количество воды в образце и влажность. Дополнительные вопросы подробно обсуждаются в результатах представительов. Этот протокол содержит множество деталей и постепенно переходит от одного шага к другому. Протокол обеспечивает долгосрочную стабильность для экспериментов с изображениями и обеспечивает базовый инструмент обработки изображений.

протокол

1. Подготовка средств массовой информации и культуры

1. Подготовка запасов раствор 1000x карбенициллин (50 мг/мл) или соответствующие антибиотики.
   1. . Вес 0,5 г карбенициллина. Добавьте 10 мл стерильного H₂O. Полностью растворите.
   2. Стерилизовать запас карбенициллина через фильтр шприца 0,22 мкм. Aliquot раствор антибиотика и хранить при -20 градусов по Цельсию.
2. Для приготовления лизогенного бульона (LB) пластины смешайте 5 г триптона, 5 г NaCl, 2,5 г дрожжевого экстракта и 7,5 г бакто-агара с 0,5 л стерильного H₂O. Автоклав раствор при 121 градусе по Цельсию в течение 20 мин.
   1. Частично погрузите расплавленный гель-микс в водяную баню на 50 градусов Цельсия. Добавьте 1000 л карбенициллина (50 мг/мл).
   2. Приготовьте блюда Петри в стерильной среде. Оставьте тарелки установить перед хранением их в холодильнике.
3. Для минимальных медиа M9 приготовьте отдельные стоковые растворы: соли 5x M9 (56,4 г/л), 2 М глюкозы и 2% биотин-бесплатных казамино-кислот. Автоклав растворов при 121 градусе по Цельсию в течение 20 мин.
4. Для приготовления 5 пластин Петри смешайте 1125 мг низкоплавильного агара и 400 мг агара с 89,2 мл минимального м.с. (1x M9). Добавьте 10 мл 2% казамино-кислот (2% «vol/vol») в колбу Erlenmeyer длиной 250 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы налить средства массовой информации на внутренние губы колбы.
5. Микроволновая печь раствор короткими очередями от 3 до 4 секунд. Повторяйте до тех пор, пока решение не будет ясным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что не достичь точки кипения.
6. Поместите колбу Erlenmeyer 250 мл в ванну с горячей водой (60 градусов по Цельсию) для дальнейшего смешивания путем диффузии, и оставьте его остыть, пока его температура не упадет примерно до 45-50 градусов по Цельсию.
7. Зажми пламя на скамейке для заливки тарелки.
8. Быстро добавьте все решения в следующем порядке:
   800 йл 50% глицерол (0,4% «vol/vol»)
   100 МКЛ тиамина (B1)
   1100 МЛ глюкозы (2M)
   100 мкл карбенициллина (50 мг/мл).
9. Закружить колбу Erlenmeyer, чтобы обеспечить равномерное распределение всех ингредиентов по всему агару.
10. Откройте одну тарелку в то время, рядом с пламенем и начать заливки.
    1. Оставьте тарелки на скамейке на несколько минут до первоначальной затвердевания.
    2. Переверни пластины вверх дном, чтобы предотвратить капание конденсата воды на гель.
    3. Оставьте пластины затвердевать при комнатной температуре около 2 ч.
    4. После того, как пластины затвердевли и высохли, они могут храниться при 4 градусов по Цельсию в течение 3 месяцев.

2. Бактериальные штаммы и плазмиды строительства

ПРИМЕЧАНИЕ: Генетическая схема содержит одну часть; зеленый флуоресцентный белок (GFP), управляемый промоутером P_tetO, что приводит к составной экспрессии. Все плазмиды в этой работе были построены с использованием основных методов молекулярного клонирования и были преобразованы в Escherichia coli 10 ", используя стандартный протокол теплового удара²⁴. Окончательная конструкция была преобразована в штамм дикого типа Escherichia coli MG1655 для тестирования.

1. Превратите желаемую плазмиду в клетки Escherichia coli MG1655 со стандартным протоколом теплового удара^24.
2. Выращиваем преобразованные клетки на Агарной пластине LB на ночь при 37 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно держать чашки Петри от шага 2,2 до 3 дней для использования микроскопии.
3. Привить одну колонию в 5 мл бульона LB, дополненного соответствующими антибиотиками в стеклянной трубке.
4. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия при скорости встряхивания 250 об/мин в инкубаторе в течение 2 ч, пока жидкость не будет облачной.
5. Подготовка 1 мл раствора разбавления следующим образом:
   892 МКЛ минимальных средств массовой информации (1x M9)
   8 МКЛ 50% глицерол (0,4% «vol/vol»)
   100 йл 2% кислот Казамино (0,2% «wt/vol»)
   1 мл тиамина (B1)
   11 МКЛ глюкозы (2 М)
   1 мл соответствующих антибиотиков
   1. Смешайте и спина вниз.
6. Разбавить клеточной культуры (1:30) от шага 2,4 в 2 мл трубки, добавив 30 йл роста кишечной палочки до 1000 йл раствора разбавления (шаг 2,5).
7. Инкубировать трубку в течение 1 ч при тряске (250 об/мин) при 37 градусах Цельсия.
8. Рост 40 МКЛ - 60 МКЛ на пластинах M9, подготовленных в шаге 1.10. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая плотность (OD_600nm) для покрытия должна быть около 0,1.
9. Поместите на скамейку до трех стеклянных нижних пластин диаметром до 35 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стекло пластины имеет правильную толщину для используемых линз микроскопа.
10. Подготовь культуру для посева на гелеобразных пластинах, повторите шаги от 2,3 до 2,6 для колоний из пластины, подготовленной на этапе 2,9 измерения микроскопа.
11. Подготовьте следующее решение, чтобы сделать три микроскопа пластин.
    1. Разогреть водяную баню до 60 градусов по Цельсию.
    2. Смешайте 112,5 мг низкоплавильного агара и 40 мг агара с 8,92 мл минимальных средств массовой информации (1x M9) и добавьте 1 мл 2% казамино кислот (0,2% «vol/vol») в колбе 25 мл Эрленмейера.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы налить средства массовой информации на внутренние губы колбы.
12. Микроволновая печь раствор короткими очередями от 2 до 3 секунд. Повторяйте до тех пор, пока решение не будет ясным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что не достичь точки кипения.
13. Поместите колбу Erlenmeyer 25 мл в ванну с горячей водой (60 градусов по Цельсию) для дальнейшего смешивания путем диффузии, и оставьте его остыть на скамейке, пока его температура не упадет примерно до 45-50 градусов по Цельсию.

3. Подготовка агарозных прокладок

1. Чистая скамейка с 70% этанола. Растянуть ленту на очищенной скамейке. Убедитесь, что лента гладкая и выровнялась.
2. Подготовь два обложки: один на ленте и второй рядом. Подготовь прикрытие.
3. Снимите колбу (подготовленную на шаге 2.14) с водяной ванны, протрите внешнюю часть колбы чистой и оставьте ее остыть, пока ее температура не упадет примерно до 45-50 градусов по Цельсию.
4. Чтобы сделать гель решение, быстро смешать все решения в следующем порядке:
   80 йл 50% глицерол (0,4% «vol/vol»)
   1 мл 2% казамино-кислот (0,2% «wt/vol»)
   10 йл тиамина (B1)
   110 МКЛ глюкозы (2 М)
   10 мл соответствующих антибиотиков.
5. Налейте 1,5 мл геля на крышку и накройте его второй частью, сделав "сэндвич".
6. Верните Эрленмайера на горячую водяную баню. Накройте сэндвич крышкой и установите таймер на 20 минут.
7. В то же время, инкубировать трубку от шага 2.11 для 1 ч при 37 C со тряской (250 об/мин)
8. Через 20 минут переверните сэндвич (шаг 3.5), накройте его и оставьте на 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения лучших результатов оставьте "сэндвич" на отдых при 4 градусов по Цельсию в течение шага 3,8.
9. Семя Escherichia coli культуры от шага 3.7 путем трубопроводов образца на 35 мм блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трубопровод 6 йл клеток, как отдельные маленькие капли дает лучшие результаты.
10. Разрешить капли высохнуть, по крайней мере 15 минут и до 30 минут.
11. Выставить затвердеть гель бутерброда от шага 3.8 путем скольжения крышки прочь.
12. Вырезать бутерброд на небольшие отдельные прокладки с биопсией удар или наконечник.
13. Аккуратно наклоните его на образец (шаг 3.9). Оставьте блюдо на 20 минут на скамейке запасных.

4. Подготовка образца для микроскопии изображений

1. Снимите колбу с водяной бани с 3,6 шага. Протрите внешнюю часть колбы чистой и дайте остыть до комнатной температуры (25 градусов по Цельсию).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите колбу на шаге 4.1 примерно за 3 минуты до окончания таймера.
2. Налейте 3 мл геля постоянно по периметру пластины круговыми движениями. Оставьте затвердеть на несколько минут.
3. Печать пластин с лентой и проколоть несколько отверстий с 25 G иглы. Переверните все блюда, чтобы предотвратить конденсат воды капает на гель.
4. Инкубировать все блюда при 4 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы обеспечить полную затвердевание при предотвращении клеточного митоза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте образцы при 4 градусов по Цельсию для последовательных измерений, не более одного дня.
5. Запустите микроскоп в соответствии с инструкциями производителя.
6. Найдите начальную фокусировку с помощью объектива наименьшего усиления и завемите автоматическую фокус-систему (AFS).
7. Используйте масло, если это необходимо, утопить объектив с маслом и распространять его тщательно, перемещая пластины с контроллером платформы (не вручную) и AFS может быть вовлечен снова.
8. Используйте относительное поперечное сечение в направлении q, следуя предложению по умолчанию для поперечных сечений шага.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы принимали яркие изображения поля каждые 5 минут и флуоресцентные изображения каждые 20 минут. Иногда фокус должен быть скорректирован в течение первых 30 минут. Подогрев окна инкубатора микроскопа и масла, в то время как охлаждение образца, как правило, помогает уменьшить первоначальную потерю фокуса.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки данных микроскопии мы разработали компьютерное программное обеспечение в MATLAB. Это программное обеспечение облегчает идентификацию границ клеток от ярких изображений tiff поля и сегментов и сортирует ячейки по площади. Выход этого анализа изображений может быть использован в качестве маски на флуоресцентных изображениях tiff для получения уровней интенсивности клеток и отмены артефактов в флуоресцентном домене, таких как ореол клеток из-за ограничений разрешения микроскопа. Разработанное программное обеспечение было вдохновлено^{аналогичными работами 7,25,26,27,28,29,30} и обеспечивает элегантное решение с учетом лаборатории.

1. Во-первых, определить следующие параметры в main_code.m.
   1. Определите папку изображений приобретения.
   2. Определите период времени изображения - яркий шаг времени канала поля в минутах.
   3. Определите частоту GFP - скорость приобретения изображений GFP.
   4. Определите разрешение микроскопа (т.е. сколько пикселей равно 1 мкм).
   5. Определите диапазон гистограммы бен - диапазон области ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс классификации данных в зависимости от области ячейки аналогичен принципам gating в анализе данных цитометрии потока. Ворота расположены вокруг популяций клеток с общими характеристиками, как правило, вперед разбросаны и стороны рассеяны, чтобы изолировать и количественно этих групп, представляющих интерес. Микроскопия позволяет ворота, исследовать и количественно несколько групп клеток.
   6. Определить ядро свертки (3,3) - этот параметр определяет границы клеток путем глобального порога(count_cells.m).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка необходима только при смене лаборатории или микроскопа. Программное обеспечение требует, чтобы входной яркий полевой канал был помечен индексом c1, флуоресцентным каналом, помеченным как c2.
2. Запуск main_code.m, который будет работать все другие скриптыавтоматически (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
   1. Программа автоматически сегменты яркие изображения поля (см. Дополнительный рисунок 2-4).
   2. Объедините изображение сегментации с флуоресцентным изображением (GFP) для извлечения уровня интенсивности на ячейку.
   3. Рассчитайте график количества ячеек по времени и в соответствии с экспоненциальным ростом.
   4. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение (ЗППП) для диапазона каждой области ячейки.
   5. Рассчитайте соотношение сигнала к шуму (SNR) для каждого диапазона области ячейки.
   6. Участок и подходят распределения количества клеток по интенсивности.
   7. Рассчитайте коэффициент дисперсии (CV) и сравните с данными анализатора потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение даст в качестве выхода окончательные изображения сегментации для conv_kernel в новой папке "ваш фолдер / сегментированный". Программное обеспечение даст в качестве вывода графики в новой папке "вашfolder / Графики.
3. Для сравнения между экспериментами используйте compare_experiments.m.
   1. Определите каталоги сохраненных графиков и адрес каталога «CompareResult».
   2. Вы запустите файл.

Результаты

Программное обеспечение анализирует яркие изображения домена поля, которые являются небелые и черные. Escherichia coli будет выглядеть как черные продолговатые формы на белом фоне и динамический диапазон яркости должны показать всплеск в его центре (Рисунок 1). В флуоресц...

Обсуждение

В этой работе мы разработали протокол, который позволяет компьютерной трассировки Escherichia coli живых клеток, после деления и флуоресцентных уровней в течение нескольких часов. Этот протокол позволяет количественно оценить стохастичную динамику генетических схем в кишечной пал...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD - Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD - Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD - Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation