JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

В этой статье описывается полуавтоматизированный, микромасштабированный протокол ChIP-Seq областей ДНК, связанных с конкретной модификацией гистонов (H3K27ac) с использованием платформы обработки жидкости ChIP, с последующей подготовкой библиотеки с использованием тегментации. Процедура включает в себя контрольную оценку для целей качества и количества и может быть принята для других модификаций гистонов или факторов транскрипции.

Аннотация

Иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием (ChIP-Seq) является мощным и широко используемым подходом к профилированию ДНК хроматина, связанного со специфическими модификациями гистонов, такими как H3K27ac, чтобы помочь идентифицировать цис-регуляторные элементы ДНК. Ручной процесс завершения ChIP-Seq является трудоемким, технически сложным и часто требует большого количества клеток (>100 000 клеток). Метод, описанный здесь, помогает преодолеть эти проблемы. Подробно описана полная полуавтоматизированная, микромасштабированная процедура H3K27ac ChIP-Seq, включающая фиксацию клеток, сдвиг хроматина, иммунопреципитацию и подготовку библиотеки секвенирования, для партии из 48 образцов для ввода количества клеток менее 100 000 клеток. Полуавтономная платформа снижает техническую изменчивость, улучшает соотношение сигнал/шум и значительно сокращает трудозатраты. Таким образом, система может снизить затраты, позволяя уменьшить объемы реакции, ограничивая количество дорогостоящих реагентов, таких как ферменты, магнитные шарики, антитела и требуемое практическое время. Эти усовершенствования метода ChIP-Seq идеально подходят для крупномасштабных эпигенетических исследований клинических образцов с ограниченным количеством клеток в высоко воспроизводимым способом.

Введение

Широкое применение анализов ChIP-Seq для определения фрагментов ДНК, связанных со специфическими модификациями гистонов, отчасти обусловлено его способностью идентифицировать цис-регуляторные элементы ДНК, включая активные энхансеры, промоторы, глушители, гетерохроматин и другие1,2,3,4. Идентификация некодирующих регуляторных областей по всему геному показала ценную информацию для лучшего понимания регуляции генов в здоровье и заболеваниях4. Предыдущая работа лаборатории использовала ChIP-Seq, чтобы показать, чтоцис-регуляторныеэлементы могут играть важную роль в различных типах клеток5. Анализы транскрипционного фактора (TF) ChIP были использованы для демонстрации связанных с заболеванием рисков однонуклеотидных полиморфизмов6.

Использование ChIP-Seq с клиническими образцами человека является сложной задачей, в основном из-за ограничения количества клеток или желаемого образца ткани. В результате в этой области были предприняты согласованные усилия по улучшению и микромасштабированию этих методов, и в результате появилось несколько анализов, таких как CUT & TAG5,7,8,9,10,11,12. Этот анализ использует транспозазу для маркировки и выделения геномных областей, связанных специфическим антителом9. Этот метод смог уменьшить количество клеток до 1000 и в некоторых случаях до одной клетки, однако использование этого метода в трансляционных исследованиях и клинической установке показало ограничения из-за требований использования живых клеток для этого метода9,12. Требование живых клеток делает клинические образцы логистически трудными для обработки и может привести к пакетным эффектам, если образцы не обрабатываются одновременно. Другие оптимизировали микромасштабируемые методы для клеток, фиксированных формальдегидом, включая разработку ChIPmentation11,которая адаптирована здесь с высокой пропускной способностью. Использование фиксированных ячеек позволяет хранить образцы до сбора и последующей обработки всех образцов вместе, чтобы свести к минимуму эффекты пакетов.

Здесь описан полуавтоматизированный микромасштабированный анализ ChIP-Seq, который сокращает экспериментальное практическое время для профилирования модификаций гистонов10. Полуавтоматизированный метод позволяет проводить высокопроизводительные анализы ChIP-Seq, что позволяет полностью обработать и подготовить к секвенированию до 48 образцов всего за 5 дней, всего за 10 000 клеток на образец с использованием жидкостного обработчика ChIP. Обработчик завершает иммунопреципитацию (IP) и последующую промывку автономным образом, что помогает уменьшить изменчивость между образцами. Полуавтоматизированный метод сокращает как практическое время более чем на 15 ч для 48 образцов, так и техническую изменчивость, что позволяет проводить крупномасштабные эпигенетические исследования воспроизводимым и быстрым образом для первичных или культивируемых клеток. Протокол объясняет процесс от начала до конца для высококачественного ChIP-Seq. Если конкретные машины недоступны, протокол по-прежнему будет полезным ресурсом для настройки и устранения неполадок в экспериментах ChIP-Seq вручную.

Анализ проводился с тремя различными типами первичных иммунных клеток человека и одной культивируемой клеточной линией (HUT78 – ATCC: TIB-161). Для ясности протокол был разделен на семь разделов: фиксация клеток, сдвиг хроматина с помощью ультразвука, автоматизированная иммунопреципитация хроматина, подготовка библиотеки путем тегментации фрагментов ДНК, амплификация библиотеки, очистка библиотеки с последующей количественной оценкой ДНК. Для буферных рецептов, пожалуйста, обратитесь к Дополнительной таблице 1.

протокол

Институциональный наблюдательный совет (IRB) Института аллергии и иммунологии Ла-Хойя (LJI; Протокол IRB no. SGE-121-0714) одобрил исследование. Здоровые добровольцы были набраны и предоставлены образцы лейкафереза после письменного информированного согласия.

1. Фиксация клеток

  1. Доведите концентрацию клеточной суспензии до 1-2х 10 6 клеток/мл с полной питательной средой клеток в пробирке 15 мл (<10 мл суспензии) или 50 мл (10-30 мл клеток). Если <1 х 106 клеток, используйте 0,5 мл среды в пробирке 1,5 мл.
  2. Осторожно вихрейте суспензию ячейки, добавьте 10-кратный буфер фиксации ячейки по каплям (1:10; об:об) и вращайте на низкой скорости в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
  3. Остановите реакцию, осторожно вихрев и добавьте 2,5 М глицина в соотношении 1:20 (об:об). Переверните трубки несколько раз и высиживайте на льду не менее 5 минут.
  4. Выполняйте остальные шаги при 4 °C или на льду. Раскрутите пробирки при 800 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
  5. Осторожно повторно суспендировать гранулу 5 мл ледяного 1x PBS и инкубировать в течение 2 мин на льду.
  6. Повторите 1,4 и 1,5 с 1 мл ледяного холода 1x PBS и перенесите образец в предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл (помеченную для длительного хранения). Если применимо, рекомендуется приготовление аликвот.
  7. Раскрутите трубки при 1 200 х г при 4 °C и удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу клетки. Заморозьте гранулы в жидком азоте. Хранить при температуре -80 °C.
    ВНИМАНИЕ: Принимайте соответствующую защиту при обращении с жидким азотом.

2. Стрижка хроматина

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для хроматиновой резки гранул с 0,3 до 3 х 106 клеток в трубках с низким связыванием 0,65 мл.

  1. Снимите пробную трубку с замороженными гранулами клеток при -80 °C и храните на сухом льду, чтобы избежать оттаивания гранул перед добавлением буфера лизиса. Этот шаг имеет решающее значение.
  2. Добавьте к грануле 70 мкл свежего, полного лизисного буфера RT и выдержите на RT в течение 1 мин.
  3. Повторно суспендировать гранулу в течение 1 мин без введения каких-либо пузырьков, а затем инкубировать клеточную суспензию на RT в течение 1 мин перед помещением образца на лед.
  4. Переложите повторно суспендированную гранулу в трубку с низким связыванием 0,65 мл и держите на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить воспроизводимую обработку ультразвуком, предварительно нагрейте ультразвуковой аппарат, запустив его только с пустыми трубками в течение 3-6 циклов перед обработкой образцов ультразвуком.
  5. Поместите образцы в держатель трубки ультразвукового аппарата и заполните любые промежутки балансными трубками, заполненными 70 мкл воды. Оставьте образцы на водяной бане примерно на 1 мин перед началом обработки ультразвуком.
  6. Выполняйте обработку ультразвуком в течение x циклов (в зависимости от типа ячейки) с 16 с ON / 32 s OFF за цикл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг потребует проверочных экспериментов для определения оптимального количества циклов для эффективной обработки ультразвуком.
  7. После каждых 3 циклов извлекайте образцы из ультразвукового аппарата, осторожно вращайте трубки, вращайте трубки, прежде чем поместить их обратно в держатель. Убедитесь, что на внешней стороне трубки нет мелких капель, так как это может вызвать образование пузырьков.
  8. После завершения необходимых циклов отжимают образцы при >14 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Переложите супернатант в новую, предварительно охлажденную, низкосвязанную трубку 0,65 мл и держите на льду.
  9. Рассеивайте часть образцов, обработанных ультразвуком, чтобы проверить эффективность обработки ультразвуком.
    1. Переложите 1-7 мкл супернатанта (эквивалентно примерно 250 нг срезанного хроматина) в ПЦР-трубку 0,2 мл и сделайте объем до 10 мкл с кратковременным буфером лизиса на РТ.
    2. Добавьте 1 мкл РНКазы А и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C при 800 об/мин, затем добавьте 1 мкл протеиназы К.
    3. Инкубировать в течение 2 ч при 55 °C с встряхиванием при 1 000 об/мин.
  10. Удалите 2 мкл размещенного образца для количественной оценки ДНК с помощью флуоресцентного количественного анализа10 (спектрофотометр не рекомендуется, так как мыло и деградированный белок могут привести к смещению результатов).
  11. Запускают оставшийся образец на 1,2% агарозном геле в течение 1 ч при 70 В. Окрашивают красителем нуклеиновой кислоты (1:20 000) и считывают гель с помощью УФ-трансиллюминатора.
  12. Подготовьте запасы хроматина к хранению (разбавьте образец до 25 нг/мкл в 20 мкл с полным буфером лизиса). Хранить весь стриженый хроматин при -80 °C.

3. Автоматизированный ChIP-Seq для модификации гистонов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для работы на обработчике жидкостей ChIP. Хотя система может использовать настраиваемые буферы, все буферы поставляются с комплектом ChIP. Полосы ChIP с 8 трубками, используемые в этом разделе, специфичны для жидкостного погрузчика ChIP.

  1. Перенесите 16 образцов аликвот с 500 нг срезанного хроматина в 20 мкл от -80 °C и поместите их на лед, чтобы медленно разморозить хроматин. После полного размораживания вихрь ненадолго и импульсно-спин.
  2. Препарат хроматина
    1. Пипетка 100 мкл буфера tC1, дополненная 1x ингибитором протеазы и 20 мМ бутирата натрия (полный буфер tC1) в две полоски ChIP 8-tube.
    2. Перенесите 20 мкл каждого образца хроматина в соответствующую пробирку из полосок ChIP 8-tube, содержащую 100 мкл полного буфера tC1. Промыть хроматиновые трубки, добавив 80 мкл полного буфера tC1 к хроматиновым пробиркам, а затем перенести обратно в соответствующую трубку полосок ChIP 8-tube для конечного объема 200 мкл.
  3. Препарат антитела
    1. Рассчитайте объем антитела таким образом, чтобы в каждой пробирке находилось 0,5 мкг антитела.
      Объем антител = (количество образцов x антитело на реакцию) / концентрация антител
    2. Добавьте рассчитанное количество антител в 500 мкл буфера tBW1. Быстро вихревое и импульсно-спиновое.
    3. Пипетка 70 мкл tBW1 в каждую из двух полосок ChIP 8-tube и добавление 30 мкл антитела + tBW1 в каждую из пробирок. Это позволит довести общий объем в каждой из пробирок до 100 мкл.
  4. Приготовление магнитного шарика
    1. Тщательно вращайте раствор бусин белка А. Для 0,5 мкг антител пипетки 5 мкл шариков в новый набор ChIP 8-трубочных полосок и импульсного спина.
  5. Заполните последнюю строку жидкостного погрузчика ChIP пустыми полосками ChIP с 8 трубками.
  6. Следуйте спецификациям программы ChIP-16-IPure-200D для размещения всех полос в машине для обработки жидкостей ChIP. Добавьте буферы в правильное положение, но используйте tW4 вместо буфера tE1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Организуйте день таким образом, чтобы обработчик жидкости ChIP выполнял ChIP в течение ночи. Программа будет работать около 16 часов для 16 образцов. Это знаменует собой конец Дня 1.

4. Транспонировать интеграцию библиотечных адаптеров для подготовки библиотек

  1. Предварительно установите термомикшер на 37 °C и 500 об/мин. Охладите магнит для полосок трубки объемом 0,2 мл на льду.
  2. Для 16 образцов подготовьте 440 мкл буфера биржирования на льду. Пипетка 53 мкл в одну новую 8-трубочную полосу и держится на льду.
  3. В новую 8-трубочную полосу объемом 0,2 мл добавьте 220 мкл холодного буфера tC1 и держите на льду. 8 ленточных трубок могут удерживать этот объем и при этом быть закрытыми.
  4. Извлеките ленточную трубку "IP samples" из машины для обработки жидкости ChIP (строка 12) и закройте трубки крышкой перед импульсным вращением. Захватите бусины с помощью магнита на 8-трубочных полосках в течение 2 мин и аккуратно извлеките супернатант.
  5. Переложите 25 мкл буфера тегментации на бусины с помощью многоканального соединения, извлеките из магнита и аккуратно перемешайте, пока бусины не станут однородными (примерно в 5 раз вверх и вниз с пипеткой, установленной на 20 мкл).
  6. Закройте пробирки и поместите в предварительно нагретый термомикшер и инкубируйте в течение 3 минут. Увеличение времени снизит эффективность подготовки библиотеки.
  7. Переложите трубки в охлажденную металлическую стойку и добавьте 100 мкл охлажденного буфера tC1 к каждому образцу. Установите многоканальную пипетку на 80 мкл и перемешайте образец до тех пор, пока шарики не станут однородными, остановив реакцию тагментации.
  8. Поместите образцы обратно в обработчик жидкости ChIP и приступайте к процедуре промывки Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Убедитесь, что промывка выполняется дважды с буфером tC1 и дважды с tW4. Элюирование должно быть завершено в соответствии с разметкой программы, с буфером tE1.
  9. Декроссинг ДНК
    1. Удалите полоски ChIP с 8 трубками в последнем ряду жидкостного погрузчика ChIP и добавьте 2 мкл РНКазы А к каждому образцу.
    2. Закройте трубки, импульсно-спинните, аккуратно перемешайте шарики с многоканальной пипеткой, пока смесь не станет однородной, и повторно закройте трубки.
    3. Инкубируйте образцы в термомиксаторе в течение 30 минут при 37 °C и 900 об/мин.
    4. Извлеките образцы из термомикшера, добавьте 2 мкл протеиназы К. Следуйте той же процедуре, что и 4.9.2 после добавления.
    5. Инкубируйте образцы в термомиксаторе в течение 4 ч при 55 °C и 1 250 об/мин, а затем 65 °C при 1 000 об/мин в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это конец Дня 2.

5. Очистка помеченных фрагментов ДНК

  1. Пометьте шестнадцать пробирок объемом 1,5 мл с соответствующим номером образца и добавьте 400 мкл ДНК-связывающего буфера из набора для очистки ДНК к каждой.
  2. Снимите 8-трубные полоски с термомикшера и импульсно-открутите полосы, чтобы убедиться, что любой испарившийся продукт сохраняется. Поместите полоски на 8-полосный магнит, чтобы захватить бусины.
  3. Перенесите 100 мкл размещенной ДНК в каждую из пробирок объемом 1,5 мл. Добавьте 100 мкл буфера связывания ДНК к 8-трубочным полоскам для промывки шариков, а затем переложите в соответствующую пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Вихрь в течение примерно 10 с и импульсно-спин 1,5 мл трубок.
  5. Загрузите колонки 600 мкл, содержащим буфер связывания ДНК и образец ChIP.
  6. Отжимайте образцы в течение 20 с при 10 000 х г и перезагружайте колонну с проточным потоком. Снова вращайтесь с теми же условиями и отбрасывайте сквозной поток.
  7. Дважды промывайте колонны с помощью промывочного буфера объемом 200 мкл (то же центрифугирование, что и на предыдущем этапе) и отбрасывайте сквозной поток.
  8. Высушите колонны центрифугированием в течение 2 мин при 12 000 х г.
  9. Перенесите колонку в новую коллекторную трубку объемом 1,5 мл и добавьте 9 мкл теплого TE-буфера (предварительно нагретого до 55 °C) непосредственно в матрицу колонны. Дайте колонке инкубироваться в течение 1 мин перед центрифугированием в течение 1 мин при 10 000 х г.
  10. Переложите 9 мкл элюта на соответствующий новый набор из 8-трубочных полосок.
  11. Завершите элюирование еще раз с помощью 8 мкл TE Buffer, как и раньше. Переложите элют в соответствующие 8-пробирочные полоски (конечный объем 17 мкл на образец) и держите на льду.

6. Усиление и подбор размера очищенных образцов

  1. Следующие шаги используют qPCR для определения количества циклов, необходимых для оптимального усиления (CtD – Ct определение)
  2. Подготовьте смесь CtD для всех образцов, умножив содержимое буфера CtD Mix на количество образцов.
  3. Дозируйте 3,6 мкл смеси CtD в пластину qPCR и добавьте 1,4 мкл меченых образцов ДНК (~10% от общего объема). Выполните следующие qPCR: 98 °C в течение 3 мин, 72 °C в течение 5 мин, 98 °C в течение 30 с, 26 циклов 98 °C в течение 10 с, 63 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с.
  4. Подготовьте Amp Mix для всех образцов, умножив содержимое буфера AMP Mix на количество образцов. Дозируют 14 мкл меченой ДНК в отдельные лунки ПЦР-пластины, затем добавляют 2,5 мкл двух праймеров индекса секвенирования (25 мкМ) к каждому образцу (конечный объем реакции составляет 50 мкл).
  5. Смешайте сэмплы с помощью многоканальной пипетки и выполните программу усиления, используемую в CtD, с соответствующим количеством циклов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошая остановка, так как усиленные образцы могут храниться при -20 °C в течение нескольких недель. Однако очищение может быть завершено в тот же день. Для 48 образцов этапы 3 - 6.5 были завершены двумя другими отдельными партиями, а затем усилены в одной партии, как описано ниже.
  6. Выполните постамплификацию, выбор размера и количественную оценку меченой ДНК, как описано ниже. Обычно это может быть завершено 48 образцами (может быть завершено с меньшим количеством образцов по желанию).
    1. Добавьте в каждую лунку 90 мкл парамагнитных шариков (соотношение 1:1,8), перемешайте и дайте ей инкубироваться на RT в течение 2 мин.
    2. Захватите бусины с помощью пластинчатого магнита и выбросьте супернатант. Вымойте бусины 3 раза 200 мкл свежего 80% этанола, не нарушая гранулу бусины.
    3. Удалите избыток этанола с помощью кончиков 20 мкл после окончательной стирки и оставьте бусины сохнуть в течение 10 минут или до появления трещин в гранулах бусины.
    4. Когда пластина все еще находится на магните, добавьте 40 мкл предварительно нагретой воды в каждую лунку. Запечатайте пластину, тщательно вихрь и ненадолго вращайте пластину.
    5. Захватите шарики, поместив пластину обратно на магнит и перенесите элют 40 мкл на новую пластину «образца». Образцы теперь очищаются, и следующие шаги обогащают фрагменты в диапазоне от 200 до 1000 bp.
    6. Дополнительный шаг контроля качества: извлеките 4 мкл из образцов и перенесите на пластину контроля качества. Добавьте 4 мкл воды обратно в образцы. Это определяет процент крупных фрагментов.
    7. Добавьте к образцам 22 мкл парамагнитных шариков (соотношение 1:0,55), тщательно перемешайте и инкубируйте на RT в течение 2 мин.
    8. Поместите на магнит для захвата бусин на 5 мин и переложите супернатанты на колонки 7-12 пластины «образец». Снимите пластину с магнита и добавьте 30 мкл бусин (конечное соотношение 1:1,3). Тщательно перемешать и дать постоять на RT в течение 2 мин.
    9. Захватите бусины в течение 5 минут, а затем выбросьте супернатант.
    10. Промыть все бусины 3 раза 200 мкл свежего 80% этанола, как описано выше (этап 6.6.2 – 6.6.3).
    11. Как только гранулы высохнут, элюируйте ДНК с предварительно нагретым буфером TE 8 мкл в каждую лунку, все еще находясь на магните.
    12. Извлеките пластину из магнита, запечатайте и тщательно вихрь. Дайте пластине инкубироваться в течение 2 мин при RT, импульсно-спине и поместите пластину обратно на магнит на 2 мин. Перенесите супернатант на новую пластину (пластина 2).
    13. Для максимального восстановления повторите элюирование дополнительными 8 мкл предварительно нагретого буфера TE. Поместите образцы в соответствующие скважины таким образом, чтобы каждый образец имел 16 мкл конечной библиотеки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого этапа должно быть две пластины (одна, если не была заполнена табличка QC). Пластина QC будет иметь предварительно выбранные фрагменты, а вторая пластина должна иметь 48 скважин конечной библиотеки (всего 16 мкл).

7. Количественная оценка окончательных библиотек и образцов контроля качества с помощью флуоресцентного анализа

  1. Полная количественная оценка ДНК с использованием флуоресцентного количественного анализа или аналогичного метода.
  2. Если количественная оценка QC была завершена, определите процент потерь образца, которые были < 1000 bp. Потерь должна быть не более 20% - если бы их было больше, могла бы возникнуть проблема с применяемыми соотношениями бусин.
  3. Определить размер фрагментов каждого образца, предпочтительно с помощью аппарата капиллярного электрофореза. Для расчета молярной концентрации используют следующее уравнение: [Библиотечная концентрация (нг/мкл) * 106]/[660 * Средний размер фрагмента (bp)]).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотеки готовы к объединению (эквимолярным объемам) и секвенированию в соответствии со стандартными процедурами секвенирования следующего поколения.

Результаты

В качестве доказательства концепции ChIP-Seq был завершен для шести человеческих доноров с тремя наборами иммунных типов клеток: наивные CD4 Т-клетки (CD4), классические моноциты (MO) и естественные клетки-киллеры (NK), обогащенные сортировкой FACS, как описано выше13. Подчеркнутая процедура состоит из девяти различных процедур, как показано на рисунке 1.

figure-results-498
Рисунок 1: Общая блок-схема для процедуры. (A) Карикатура на общую процедуру (сгенерированная в BioRender). (B)Блок-схема для всех основных этапов протокола и расчетное практическое и общее время, связанное с каждым днем. Секвенирование может произойти в конце 5-го дня или позже с несколькими раундами. Временная шкала также может быть сдвинута в течение недели, где последовательный день 3-4 может быть завершен несколько раз в неделю для создания 48 образцов ChIP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

После выделения клеток методом проточной цитометрии13,отсортированные клетки центрифугировали, а клетки фиксировали и хранили, как описано выше. После того, как все образцы были собраны, образцы были лизированы и подготовлены к хроматической стрижке партиями по 12 штук, как описано выше. Для каждого образца количество циклов для достижения оптимальной обработки ультразвуком было завершено10. Количественные измерения, а также измерения размера фрагмента хроматина показали большую воспроизводимость нашего метода на трех наборах иммунных клеток(рисунок 2А). Различные иммунные клетки человека обрабатывали ультразвуком отдельными партиями и давали очень последовательно с > 70% образца между 100 - 500 bp в течение 14 циклов (16 с ON, 32 s OFF за цикл). На данный момент образцы с большими фрагментами после обработки ультразвуком (< 70% образца между 100 - 500 bp) считались несостоявшимися. Эти образцы могли либо обрабатываться ультразвуком в течение 1-2 дополнительных циклов, либо выбрасывались и заменялись позже клетками из другой гранулы. Наш метод показал, что ни один из образцов не требовал большего количества ультразвука или не был исключен, что свидетельствует об абсолютной надежности процедуры.

figure-results-2671
Рисунок 2: Примеры QC предварительного секвенирования. (A)1,2% агарозных гелей показывают воспроизводимость обработки ультразвуком. Образцы ультразвука для 6 доноров в трех типах клеток: наивные CD4 Т-клетки (CD4), классические моноциты (MO) и естественные клетки-киллеры (NK). Образцы обрабатывали ультразвуком в течение 14 циклов (16 с ON, 32 s OFF за цикл). Для каждого образца около 200 нг размещенного хроматина были загружены на 1% агарозный гель. Образцы считались хорошими, если более 70 % фрагментов находятся в пределах 100-500 bp. (B) Top - Анализ кривых усиления qPCR для определения оптимального числа циклов для усиления (Ct там, где есть 1/2 максимальной интенсивности). Идеальные образцы имеют Ct около 15 и усиление может быть завершено до 2 циклов больше измеренного Ct. Стрелка является примером плохого примера, где Ct больше 18. Внизу - Показан пример плохого набора образцов, которые имеют Ct больше 18. Эти образцы также показали более низкую интенсивность флуоресценции. (C) Слева - Следы электрофореза анализатора фрагментов показали распределение конечных помеченных библиотек после усиления и выбора размера. Образцы с более чем 85% библиотеки фрагментов, лежащей в пределах 200-1000 bp, считались хорошими образцами. Измерение пиковой интенсивности флуоресценции также рассматривается как важный параметр QC, действительно, если сигнал низкий, образец вряд ли будет хорошо секвенироваться. Справа - Приведены примеры положительных образцов в CD4, MO и NK. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

После количественной оценки образцы были запущены на жидкостном обработчике ChIP с антителами H3K27ac с последующей маркировкой ферментом транспозазы Tn5. Для определения соответствующего количества циклов усиления с помощью qPCR было использовано 10% маркированных образцов. Для определения числа циклов для усиления образцов находим цикл, при котором интенсивность образца составляет половину среднего максимума для определения цикла(рисунок 2В). Образцы со значениями Ct более 18 не показали хороших результатов после секвенирования, и их значение Ct, таким образом, указывало на неудачный выборку ChIP. Эти образцы, как правило, также давали меньшее количество ДНК после амплификации. Образцы (вход 100 000 ячеек) со значением Ct, равным или меньшим 15, были идеальными, а образцы между 15 и 18 были приемлемыми, но менее последовательными постсеквенированием. Для образцов с менее чем 100 000 входных ячеек значения Ct обычно находили между 15 и 18, но не требовалось более 18 циклов, чтобы получить достаточный продукт для секвенирования.

После амплификации, помеченной ДНК, библиотеки были очищены и выбраны по размеру для получения идеального распределения по размеру, в диапазоне от 200 до 1000 bp, для секвенирования NextGen. Оценка распределения размеров по каждой из библиотек была завершена, поскольку наилучшие данные секвенирования были получены, когда более 85% фрагментов ДНК находились в диапазоне от 200 до 1000 bp(рисунок 2C). Примечательно, что, поскольку было загружено такое же количество ДНК (измеренное количественной оценкой флуоресценции), было замечено, что образцы с более низкой интенсивностью флуоресценции обычно плохо секвенированы(рисунок 2C).

Постсеквенирование, стандартный контроль качества на основе руководящих принципов ENCODE ChIP-Seq были применены5,14,15.

figure-results-6626
Рисунок 3: Воспроизводимость образцов иммунных клеток. (A)Треки H3K27ac (UCSC Genome Browser, максимальная интенсивность, функция сглаживания 4, все с одинаково масштабированной осью Y) для 6 доноров (100 000 клеток на репликат) в каждом типе клеток (CD4, MO и NK). Показаны четыре примерных локуса, два с (локус IL2RA и PTPRC) и два без обогащения для H3K27ac (CCR4 и MS4A1). (B) Корреляция Пирсона между донорами и соответствующими корреляционными графиками, сгенерированными с использованием расширения 300 bp и окна 500 bp в пакете MEDIPS для каждого типа клеток реплицирует16. (C) Объединенные донорские файлы для каждого типа клеток, показывающие треки H3K27ac (максимальная интенсивность UCSC Genome Browser, функция сглаживания 4) в областях, специфичных для типа клеток (IL17R для CD4, CCR2 для MO и KLRC1 для NK) и домашний ген B2M, присутствующий во всех типах клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для визуального контроля качества были подготовлены дорожки обогащения H3K27ac для отображения в браузере генома UCSC. Для четырех генных локусов отдельные треки для каждого образца показали высокое качество картирования и отношение сигнал/шум, что отражает высокую согласованность и надежность нашего анализа(рисунок 3A). Два локуса слева содержат хорошо экспрессированные гены в этих типах клеток, в то время как гены в двух локусах справа не экспрессируются и служат фоновыми контрольными элементами13 (рисунок 3A). Кроме того, пакет анализа MEDIPS был использован в качестве переменной постсеквенирования для оценки индекса корреляции между техническими репликами(рисунок 3B)5,16,17,устанавливая степень корреляции для уровня обогащения считывания для 500 bp bins16. Для большинства попарных сравнений индексы корреляций Пирсона показали более 90% корреляции, что свидетельствует о высоком уровне согласованности между биологическими репликами(рисунок 3B). Реплики с приемлемой корреляцией были объединены для увеличения отношения сигнал/шум. В то время как клеточные тип-специфические локусы показали высокое обогащение в соответствующих клетках, ген домохозяйства (B2M) показал очень последовательную модификацию гистона(рисунок 3C). Для анализа слияние треков из реплик увеличит обогащение, усилит специфический сигнал, в том числе для важных энхансеров типа клеток, и уменьшит межиндивидуальную изменчивость, присущую человеческим образцам5.

Хотя для этого исследования было использовано 100 000 клеток, была высокая воспроизводимость всего для 10 000 клеток в культивируемой человеком Т-клеточной линии (HUT78). Корреляционный анализ между набором данных ChIP-Seq, выполненный из образцов с менее чем 100 000 клеток, показал высокую воспроизводимость и корреляцию до 10 000 клеток(рисунок 4A).

figure-results-10123
Рисунок 4: Воспроизводимость образцов с низким входом. (A) Примеры консистенции H3K27ac ChIP-Seq для клеток от 100 000 до 10 000 в клетках HUT-78 (клеточная линия Т-клеточной лимфомы). Треки (UCSC Genome Browser, максимальная интенсивность, функция сглаживания 4, все с одинаково масштабированной осью Y) показывают локус IL4. (B) Корреляции Пирсона реплик с использованием расширения 300 bp и окна 500 bp в пакете MEDIPS16.  (C)Корреляции Пирсона между различными группами чисел клеток (100 000, 50 000 и 10 000 клеток) с использованием тех же параметров MEDIPS, что и в (B)16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Корреляционный анализ Пирсона показал высокий корреляционный индекс (от 83% до 92%), предполагающий поддержание сигнала в образцах с низким числом клеток. Тем не менее, наблюдалось увеличение фона по мере уменьшения числа клеток, а также снижения коэффициентов корреляции(рисунок 4B). Для поддержания низких фоновых сигналов были объединены технические дубликаты, а корреляция тестировалась между группами(рисунок 4C).

10X буфер фиксации ячеек
СоединениеКонечная концентрация
Раствор формальдегида11%
НаКл100 мМ
ЭДТА, рН 8,01 мМ
ЭГТА, рН 8,00,5 мМ
HEPES, pH 7,550 мМ
Полный буфер лизиса
СоединениеКонечная концентрация
Трис-HCI, рН 8,050 мМ
ЭДТА, рН 8,010 мМ
СДС0.25%
Бутират натрия20 мМ
Коктейль ингибитора протеазыв 1 раз
Краткосрочный буфер лизиса
СоединениеКонечная концентрация
Трис-HCI, рН 8,050 мМ
ЭДТА, рН 8,010 мМ
СДС0.25%
Тегментация Микс
СоединениеКонечная концентрация
Трис-HCI, рН 8,010 мМ
МгCl25 мМ
N,N-диметилформамид10%
Фермент тегментации Illumina1:24 об:об
CtD Микс
СоединениеНа образец (мкл)
NextEra Индексная букварь A (25 мкМ)0.275
Индекс NextEra Букварь B (25 мкМ)0.275
2X KAPA HiFi HotStart Готовый микс2.75
1:1000 SYBR Зеленый краситель0.11
Пассивный краситель ROX0.11
ВодаЗаливка до 4 мкл
AMP Микс
СоединениеНа образец (мкл)
2X KAPA HiFi HotStart Готовый микс27.5
ВодаЗаполнение до 31 мкл

Дополнительная таблица 1: Буферные рецепты.

Дополнительная таблица 2: Корреляции образцов Спирмена и Пирсона для 6 доноров и каждого типа клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Описанный здесь способ расширяет процедуру11ChIPmentation, которая реализует протокол подготовки библиотеки тегментации до очистки ДНК путем автоматизации и микромасштабирования протокола. С момента появления ChIP-Seq необходимое количество клеток было резко сокращено, с примерно 20 миллионов клеток для гистонов до сотен и даже одиночных клеток1,7,10,12,18,19,20,21. Эти недавно разработанные методы позволили глубже понять, как цис-регуляторныемеханизмы работают в клетках, повышая чувствительность и позволяя тестировать редкие клинические популяции клеток5,6,12,17. Например, одна из более поздних и популярных процедур, называемая CUT&TAG, как надежная и чувствительная альтернатива ChIP-Seq9. Он производит отличное соотношение сигнал/шум, поскольку фермент Tn5 ковалентно связан с белком A и распознает цепь Fc антитела ChIP с высокой специфичностью9. Фоновая активность Tn5-фермента снижается, так как фермент не функционирует до связывания с целевым антителом9. Однако реализация этого метода в клиническом контексте ограничена, поскольку для него требуются нефиксированные, живые клетки. Кроме того, удаление фрагментов ДНК из гипотонического ядра может иметь негативные последствия для хроматина, поскольку он удаляется во время анализа. Необходимое требование для работы со свежими и живыми клетками является источником проблем для редких клинических образцов и для больших когорт образцов, поскольку большим когортам может потребоваться несколько лет, чтобы собрать5. Другой тип метода, drop-ChIP, элегантно использует устройство микрофлюидики для генерации метки на основе капель перед обработкой ChIP19. Тем не менее, он использует узкоспециализированное микрофлюидное устройство и, хотя можно завершить одноклеточный ChIP-Seq, он также ограничен использованием живых клеток7,8,9,18,19. Новые методы, основанные на ChIP-Seq, такие как PLAC-Seq или HiChIP, пытаются понять 3-мерные (3D) взаимодействия между пиками ChIP-Seq22,23. Эти 3D-методы интересны, поскольку они идентифицируют цис-регуляторныеили TF-опосредованные взаимодействия по всему геному и лучше понимают регуляцию экспрессии генов в интересующих типах клеток, в здоровых тканях и в контексте заболевания.

Есть несколько критических шагов, которые следует учитывать для успеха протокола, таких как качество ультразвукового хроматина и качество антитела. Эффективность резки имеет решающее значение, если хроматин плохо обрабатывается ультразвуком, эффективность анализа резко снижаетсяна 24. Обработка ультразвуком является сложным аспектом ChIP-Seq из-за требуемого количества клеток. На ультразвуковом аппарате, используемом в протоколе, эффективность была резко снижена до 300 000 ячеек. Это сложный аспект в ChIP-Seq, поскольку для обработки ультразвуком на этом уровне часто требуется ферментативная фрагментация, которая менее беспристрастна. В результате обработка ультразвуком является основным ограниченным фактором для истинного микромасштабирования ChIP-Seq. Другие платформы обработки ультразвуком и коммерчески доступные наборы были протестированы на обработку ультразвуком хроматина, но используемый здесь ультразвуковой аппарат имел самые надежные и воспроизводимые результаты. Еще одним преимуществом ультразвукового аппарата является отсутствие необходимости приобретать специализированные трубки для выполнения обработки ультразвуком, что снижает затраты при работе с большим количеством образцов. Для оптимальной обработки ультразвуком, во-первых, важно предварительно нагреть ультразвуковой аппарат, как описано выше. Во-вторых, чтобы лизировать гранулу, рекомендуется, чтобы наконечник пипетки касался нижней части трубки во время лизирования, чтобы разбить клетки с большим количеством физических ограничений. В-третьих, любое образование пузырьков перед обработкой ультразвуком препятствует способности образца равномерно обрабатываться ультразвуком. Если во время лизиса образовались какие-либо пузырьки, важно удалить их пипеткой. Это может быть сложной задачей без удаления большого количества образца, но если наконечник слегка прижат к пузырю, его можно медленно вытягивать без потери большого количества образца. Наконец, при определении количества циклов пройдите временной курс, где каждые три цикла образец удаляется, очищается и запускается на агарозном геле. Избегайте чрезмерной / недостаточной обработки образцов ультразвуком, так как это снижает эффективность ChIP. Если образец находится под ультразвуком, крупные фрагменты могут оказать негативное влияние на качество ChIP-Seq24. С другой стороны, если образец чрезмерно обработан ультразвуком, существует риск того, что эпитоп мишени потеряется в процессе.

Другой важной частью ChIP-Seq является качество антитела. Перед проведением любого масштабного исследования необходимо оптимизировать антитело, которое будет использоваться. Цель состоит в том, чтобы получить значительно высокое отношение сигнал/шум известных областей генома, а еще одним является воспроизводимость. Если антитело вытягивает много фонового сигнала, может быть рекомендовано использовать больший вход или попробовать другой лот / поставщика. Это добавит времени перед началом масштабного эксперимента, но это важный шаг. Для тестирования сигнал-шум рекомендуется использовать qPCR с областями, которые, как известно, являются мишенью вашего антитела, и другой областью, которая, как известно, отсутствует. Было замечено, что модификации гистонов более надежны и их легче оптимизировать, чем TF.

Протокол, описанный выше, обеспечивает надежный метод для высокопроизводительной гистон-модификации ChIP-Seq полуавтономным, микромасштабированным способом. Метод ограничивает количество практического времени и повышает воспроизводимость по сравнению с ручным ChIP-Seq. Предыдущие исследования, завершенные в лаборатории, использовали ручной ChIP на технических репликах и получили среднее значение корреляции Спирмена0,50 5,однако с полуавтоматизированной системой корреляция Спирмена между различными донорами со средним значением NK-клеток 0,66(Дополнительная таблица 2). Это также было завершено примерно на 40% меньше практического времени. Метод, описанный здесь, был оптимизирован для модификаций гистонов (H3K27ac показан здесь, но протокол не должен нуждаться в каких-либо модификациях для других) и потребует только незначительных изменений для реализации для TF ChIP-Seq. Несмотря на качество антитела, основная модификация будет касаться времени обработки ультразвуком и, возможно, буферов, используемых во время ИС. Обычно для анализов TF ChIP метод может лучше работать с немного более длинными фрагментами хроматина (с диапазоном около 350-800 bp), поскольку комплексы TF: DNA, вероятно, менее способны поддерживаться с помощью строгой обработки ультразвуком6. Буферы также могут потребоваться изменить на пользовательский микс или другие доступные в отрасли наборы, поскольку TF могут вести себя иначе, чем модификации гистонов.

Хотя автоматизированный обработчик жидкости ChIP был протестирован всего на 10 000 клеток, наблюдалось заметное снижение воспроизводимости при более низких концентрациях хроматина. Из-за этого протокол не был рекомендован менее чем 10 000 клеток, причем 100 000 клеток были оптимальными условиями. Протокол также был завершен с использованием отраслевых буферов ChIP, что было дополнительным расходом, но обеспечивало более высокое качество данных. Протокол может быть изменен в отношении условий обработки ультразвуком (при условии, что срезанный хроматин хранится в том же диапазоне), буферы могут быть настроены для иммунопреципитации (IP; может потребоваться оптимизация), или жидкостный обработчик ChIP может не использоваться. Ограничением протокола является использование жидкостного обработчика ChIP, который может быть дорогостоящей инвестицией и может запускать только 16 образцов одновременно. Обработчик жидкости ChIP ограничен мелкомасштабными реакциями, и количество клеток, превышающее один миллион, не рекомендуется. Тем не менее, протокол может быть завершен без него, выполнив шаги IP и промывки вручную. Если IP и стирки были выполнены вручную, время на завершение анализа увеличится, а воспроизводимость может уменьшиться, но это руководство все равно будет полезно при проведении высококачественного эксперимента ChIP-Seq. Следует отметить, что другие обработчики жидкости могут быть адаптированы для запуска полуавтоматизированных реакций ChIP.

Подводя итог, можно сказать, что основными преимуществами этой системы является высокая пропускная способность, поскольку этапы IP и мойки выполняются автономно. Таким образом, последовательные раунды экспериментов ChIP могут быть завершены, что позволяет полностью обработать и подготовить к секвенированию до 48 образцов за 5 дней с ограниченным практическим временем по сравнению с ручными экспериментами ChIP-Seq. Другим преимуществом является повышенная воспроизводимость, поскольку ChIP-Seq может быть трудно получить высоковоспроизводимые результаты. Другие методы либо требуют живых клеток, сложных систем микропипетирования, либо работы, которые должны быть выполнены вручную. Эта система должна быть оптимизирована для образцов с низким входом (<10 000 клеток), что в конечном итоге позволит проводить одноэлементные chIP-реакции. Система также может быть адаптирована для новых методов ChIP, таких как PLAC-Seq и HiChIP22,23.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим членов лаборатории Виджаянанд за техническую помощь и конструктивные обсуждения, а также д-ра Шаррона Скваццо и г-на Джеффри Берге из Diagenode за техническую помощь с машиной и протоколами обработки жидкости sonicator и ChIP. Эта работа была поддержана грантами NIH AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) и S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap stripsDiagenodeC30020002Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip
AMPure XP for PCR PurificationBeckman CoulterA63880SPRI beads
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge TubeCorningMCT-060-C0.65 mL low binding tube
Bioruptor Pico SonicatorDiagenodeB01060010Sonicator used in the lab but others can be used
ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns)Zymo ResearchD5205DNA clean-up kit
Dynabeads Protein A for ImmunoprecipitationThermoFisher10001D
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-freeThermoFisherAM9260G
EGTA pH 8.0Millipore SigmaE3889-25G
Eppendorf ThermoMixer CEppendorf2231000667
Formaldehyde solutionMillipore Sigma252549-1L
GlycineMillipore Sigma50046-250G
H3K27ac polyclonal antibody - PremiumDiagenodeC15410196
HEPES (1 M) pH 7.5ThermoFisher15630080
IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual IndexesIllumina20027213
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small KitIllumina20034197
IP-Star Compact Automated SystemDiagenodeB03000002Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK2601PCR mix
Medium reagent container for SX-8G IP-Star CompactDiagenodeC30020003
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM)ThermoFisherR0971
N,N-DimethylformamideMillipore SigmaD4551-250MLCAUTION - low flash point
NaCl (5 M), RNase-freeThermoFisherAM9760G
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011044
PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical capsUSA Scientific1402-47008 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip
Proteinase Inhibitor CocktailMillipore SigmaP8340
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA gradeThermoFisher25530049
PureLink RNase A (20 mg/mL)ThermoFisher12091021
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentThermoFisherP7581Used in the flourescence quantification
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemThermoFisher4485699qPCR
ROX Reference DyeThermoFisher12223012
Sodium butyrateMillipore Sigma303410-100G
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)ThermoFisherS11494nucleic acid dye
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSOThermoFisherS7563
TE BufferThermoFisher12090015
Tips (bulk)DiagenodeC30040020Tips for the IP Star
True MicroChIP KitDiagenodeC01010130Contains all the buffers for the IP; ChIP kit
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0ThermoFisher15568025
UltraPure SDS Solution, 10%ThermoFisher24730020

Ссылки

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions. Science. 316, 1497-1502 (2007).
  3. Mikkelsen, T. S., et al. Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).
  4. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).
  5. Seumois, G., et al. Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility. Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).
  6. Schmiedel, B. J., et al. 17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells. Nature Communication. 7, 13426 (2016).
  7. Ai, S., et al. Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq. Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).
  8. Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communication. 6, 6033 (2015).
  9. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).
  10. Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies. Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).
  11. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  12. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 6, 21856 (2017).
  13. Schmiedel, B. J., et al. Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression. Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).
  14. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  15. Chen, L., et al. Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells. Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).
  16. Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments. Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).
  17. Engel, I., et al. Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs. Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).
  18. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  19. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  20. Wang, Q., et al. CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  21. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  23. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  24. Diagenode. The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus. Diagenode. , (2012).

Erratum


Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 9/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. An author's name was updated.

The name was corrected from:

Pandurangan Vijayanad

to:

Pandurangan Vijayanand

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

162ChIP SeqChIPH3K27ac

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены