JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлена хирургическая техника трансплантации ткани сетчатки, полученной из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), в субретинальное пространство модели крупного животного.

Аннотация

Дегенеративные состояния сетчатки (RD), связанные с потерей фоторецепторов, такие как возрастная макулярная дегенерация (AMD), пигментный ретинит (RP) и врожденный амавроз Лебера (LCA), вызывают прогрессирующую и изнурительную потерю зрения. Существует неудовлетворенная потребность в терапии, которая может восстановить зрение после потери фоторецепторов. Трансплантация ткани сетчатки (органоидов), полученной из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), в субретинальное пространство глаза с прогрессирующей РД приносит листы ткани сетчатки с тысячами здоровых фоторецепторов без мутаций и имеет потенциал для лечения большинства / всех слепых заболеваний, связанных с дегенерацией фоторецепторов, с помощью одного утвержденного протокола. Трансплантация ткани сетчатки плода в субретинальное пространство животных моделей и людей с прогрессирующей РД была успешно разработана, но не может использоваться в качестве рутинной терапии из-за этических проблем и ограниченного снабжения тканями. Животные модели наследственной дегенерации сетчатки большого глаза (IRD) ценны для разработки методов восстановления зрения с использованием передовых хирургических подходов к трансплантации клеток / тканей сетчатки в субретинальное пространство. Сходство в размере земного шара и распределении фоторецепторов (например, наличие центральной области макулы), а также наличие моделей IRD, близко повторяющих IRD человека, будет способствовать быстрому переводу многообещающей терапии в клинику. Здесь представлена хирургическая техника трансплантации ткани сетчатки, полученной из hPSC, в субретинальное пространство модели крупного животного, позволяющая оценить этот перспективный подход на животных моделях.

Введение

Миллионы людей во всем мире страдают от дегенерации сетчатки (РД), что приводит к ухудшению зрения или слепоте, связанной с потерей светочувствительных фоторецепторов (ПР). Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является основной причиной слепоты, возникающей в результате сочетания генетических факторов риска и факторов окружающей среды / образа жизни. Кроме того, было обнаружено, что более 200 генов и локусов вызывают наследственный RD (IRD)1. Пигментный ретинит (RP), самый распространенный IRD, генетически неоднороден: сообщается о более чем 3000 генетических мутациях примерно в 70 генах 2,3,4. Врожденный амавроз Лебера (LCA), вызывающий слепоту в детском возрасте, также генетически гетероген 5,6. Генная аугментационная терапия была разработана и находится в клинических испытаниях для лечения небольшого числа IRD 3,7. Тем не менее, отдельная терапия должна быть разработана для лечения каждой отдельной генетической формы IRD и, таким образом, лечения только небольшой подгруппы пациентов. Кроме того, аугментация генов основана на наличии популяции восстанавливаемых фоторецепторов и, следовательно, неприменима для прогрессирующей дегенерации.

Таким образом, существует настоятельная и еще неудовлетворенная клиническая потребность в разработке методов лечения, направленных на лечение и лечение прогрессирующих РД и глубокой до неизлечимой слепоты. За последние 2 десятилетия нейропротезные имплантаты были разработаны и испытаны на моделях крупных животных, таких как кошка, до использования человеком 8,9,10,11,12,13,14. Аналогичным образом, за последние 20 лет была разработана заместительная терапия сетчатки с использованием листов эмбриональной или даже зрелой сетчатки млекопитающих, пересаженных субретинально 15,16,17,18,19,20,21,22 и даже успешно протестирована у пациентов с РД 23,24,25. Оба подхода используют идею введения новых датчиков (фотоэлектрических кремниевых фотодиодов в случае нейропротезов26,27 и здоровых безмутационных фоторецепторов, организованных в листы, в случае имплантации листа сетчатки) в сетчатку с дегенерированными PR. В недавних исследованиях изучалось использование подходов, основанных на стволовых клетках, таких как трансплантация предшественников сетчатки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC)28,29, фоторецепторов hPSC 30 и органоидов сетчаткиhPSC 31,32,33. Органоиды сетчатки позволяют формировать ткань сетчатки в чашке и получать фоторецепторные листы с тысячами безмутационных PR, которые напоминают слой фоторецепторов в развивающейся сетчатке плода человека 34,35,36,37,38,39,40. Трансплантация ткани сетчатки (органоидов), полученной из hPSC, в субретинальное пространство пациентов с заболеваниями РД является одним из новых и перспективных исследовательских подходов к клеточной терапии, применяемых рядом команд 31,32,41,42. По сравнению с трансплантацией клеточной суспензии (молодых фоторецепторов или предшественников сетчатки) было продемонстрировано, что трансплантированные листы фоторецепторов плода приводят к улучшению зрения в клинических испытаниях23,24.

Представленный здесь протокол подробно описывает процедуру трансплантации для субретинальной доставки целых органоидов сетчатки (а не ободковорганоидов 33,41) как потенциально лучший способ введения интактных листов сетчатки с PR для увеличения выживаемости трансплантата и улучшения сохранности листа. Несмотря на то, что были разработаны процедуры введения плоского кусочка сетчатки человека, а также пластырей RPE43,44,45, трансплантация более крупных 3D-трансплантатов не исследовалась. Органоиды сетчатки, полученные из стволовых клеток, являются неисчерпаемым источником фоторецепторных листов для разработки технологий восстановления зрения, свободны от этических ограничений и считаются отличным источником ткани сетчатки человека для терапии, направленной на лечение прогрессирующей РД и терминальной слепоты46. Разработка хирургических методов точной субретинальной имплантации органоидов сетчатки с минимальным повреждением ниши сетчатки хозяина (нервная сетчатка, пигментный эпителий сетчатки и сосудистая сеть сетчатки и хориоидеи) является одним из важнейших шагов для продвижения такой терапии к клиническому применению31,32. Модели крупных животных, таких как кошки, собаки, свиньи и обезьяны, оказались хорошими моделями для исследования хирургических методов доставки, а также для демонстрации безопасности имплантированных листов ткани (клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE)) и исследования использования органоидов 41,44,45,47,48,49,50 . Большой глаз животного имеет размер шара, аналогичный человеческому, а также аналогичную анатомию, включая наличие области высокой плотности фоторецепторов, включая колбочки (область centralis), напоминающую человеческую макулу 6,51,52.

В данной рукописи описана методика имплантации ткани сетчатки (органоидов), полученной из hPSC, в субретинальное пространство кошачьих моделей крупных животных (как дикого типа, так и кошек CrxRdy/+), что вместе с многообещающими результатамиэффективности 32,53 создает основу для дальнейшего развития такой исследуемой терапии для клинического применения для лечения состояний РД.

протокол

Процедуры проводились в соответствии с заявлением Ассоциации по исследованиям в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Они также были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Мичиганского государственного университета. В этом исследовании использовались кошки дикого типа и CrxRdy/+ из колонии кошек, содержащейся в Университете штата Мичиган. Животные содержались в течение 12 часов: 12-часовые циклы свет-темнота и кормились коммерческим полноценным рационом для кошек.

1. Предимплантационные процедуры и хирургическая установка

  1. Выберите кошек дикого типа или CrxRdy/+ в зависимости от дизайна исследования. Проведите предоперационное офтальмологическое обследование, включая биомикроскопию с щелевой лампой и непрямую офтальмоскопию. Исключите любых животных с аномалиями глазного дна, не связанными с их генотипами.
  2. За неделю до имплантации начните прием животных по иммуносупрессивному протоколу: пероральный циклоспорин 2 мг/кг и преднизолон 1 мг/кг два раза в день, чтобы предотвратить отторжение трансплантата.
  3. Постите животных старше 4-месячного возраста в течение ночи (не менее 8 часов). Обеспечьте ограниченное количество влажного корма на ночь животным в возрасте до 4 месяцев, а затем голодайте в течение 2 часов до операции.
  4. Проведите общее физическое обследование, включая аускультацию грудной клетки (с использованием стетоскопа). Запишите частоту сердечных сокращений и дыхания, температуру, цвет слизистой оболочки и время наполнения капилляров.
  5. Подкожно или внутримышечно за 30–45 мин до введения общей анестезии подкожно или внутримышечно подлечить животных в возрасте до 4 месяцев в возрасте до 4 месяцев бупренорфином (0,02 мг/кг) в сочетании с ацепромазином (0,02 мг/кг).
  6. Нанесите местный 1% офтальмологический раствор тропикамида и 10% офтальмологический раствор фенилэфрина на поверхность глаза не менее двух раз, чтобы расширить зрачки. Повторите, если зрачки недостаточно расширены.
  7. Поместите внутривенный катетер 22 G в головную вену у всех животных: сначала отрежьте волосы из области 2 х 3 см над головной веной; подготовьте кожу, предварительно почистив ее 70% этанолом, а затем хлоргексидиновым скрабом; Установите катетер, закрепите его медицинской лентой и промойте гепаринизированным физиологическим раствором. У животных в возрасте до 4 месяцев это можно сделать после индукции анестезии.
  8. Индуцируют общую анестезию через 30–45 мин после премедикации: животным в возрасте до 4 месяцев индуцируют изофлураном, доставляемым маской, а животным старше 4 месяцев — внутривенным пропофолом (4–6 мг/кг).
  9. Интубировать эндотрахеальной трубкой соответствующего размера. Визуализируйте гортань с помощью смотрового светильника или ларингоскопа. Распылите 0,1 мл лидокаина 2% на гортань, подождите несколько секунд, а затем интубируйте.
  10. Поддерживайте анестезию изофлураном (от 2% до 3,5%) в кислороде (300–600 мл / кг / мин) через систему Bain.
  11. Положите животное в положении лежа на спине на подушку, на которой расположено водяное одеяло с подогревом, накрытое полотенцами. Прикрепите монитор пациента и контролируйте частоту сердечных сокращений и электрокардиограмму (ЭКГ), частоту дыхания, артериальное давление, насыщение кислородом и углекислый газ в конце выдоха. Регулярно контролируйте температуру тела во время процедуры. Человек, прошедший соответствующую подготовку, несет ответственность за поддержание и мониторинг анестезии.
  12. Расположите животное с помощью установочной подушки так, чтобы поверхность роговицы была горизонтальной, когда глаз поворачивается в основное положение взгляда. Закрепите голову на месте с помощью медицинской ленты.
  13. Накройте животное одеялами, чтобы поддерживать температуру тела.
  14. Промойте внутривенный катетер гепаринизированным физиологическим раствором и начните внутривенную инфузию лактата Рингера в дозе 2–5 мл/кг/ч на время процедуры.
  15. Подготовьте глазную поверхность, конъюнктивальный мешок и веки к асептической хирургии с помощью 0,2% повидон-йода, стерильных аппликаторов ватных тампонов и ватных тампонов.
  16. Расположите операционный микроскоп так, чтобы окуляры также были соответствующим образом отрегулированы. Разместите ножной регулятор для микроскопа (фокусировка, масштабирование и управление по оси XY) и аппарата для витрэктомии так, чтобы хирург мог ими управлять.
  17. Подготовьтесь к асептической операции: весь персонал должен носить хирургические скрабы, хирургическую шапочку и маску. Убедитесь, что хирург и ассистент (ы) чистят, халат и перчатки, как при обычной асептической хирургии. Весь персонал должен быть знаком с асептическими методами.
  18. После того, как персонал вымыт, одеты в халаты и надеты перчатки, откройте хирургические пакеты и разложите инструменты. Поместите стерильные манипуляционные ручки на ручки регулировки микроскопа, чтобы хирург или ассистент могли отрегулировать, не нарушая асептики. Драпируйте животное обычным образом для глазной хирургии.
  19. Подготовьте аппарат для витрэктомии, следуя инструкциям производителя для двухпортовой витрэктомии.
    1. Поместите контактные линзы для витрэктомии и два порта для витрэктомии 23 G на стол ассистента. Прикрепите мокрое поле прижиганием. Прикрепите и заправьте инфузионную трубку и наконечник для витрэктомии 23 G.
    2. Поместите инструменты для витрэктомии и жидкостные линии поверх стерильной драпировки и удерживайте их в нужном положении с помощью зажимов для полотенец. Установите аппарат для витрэктомии в режим пропорционального вакуума от 1,500 до 2,500 разрезов в минуту (cpm) и максимальный вакуум 500 мм рт.ст. Это выполняется нажатием кнопок со стрелками (вверх или вниз), расположенных на передней панели аппарата для витрэктомии.

2. Подготовка органоидов к субретинальной имплантации (рис. 1)

  1. Получить органоиды сетчатки, как описано ранее 31, и, при необходимости, отправить на ночь при37 ° C, как сообщалось ранее54.
  2. Протрите поверхности в комнате культуры тканей в приемной лаборатории дезинфицирующим средством и поддерживайте тот же высокий уровень асептической техники, что и в хирургическом кабинете для глазных операций, чтобы избежать бактериального или грибкового загрязнения, и перенесите в операционную, чтобы избежать инфекции в области хирургического вмешательства.
  3. Носите хирургические бахилы, одноразовые лабораторные халаты, чепчики, хирургические маски, рукава и хирургические скрабы в комнате для культивирования тканей, предназначенной для подготовки органоидов к глазным операциям.
  4. Предварительно уравновешивайте нейронные среды 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 20 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) в течение 1 ч в инкубаторе для тканевых культур (37 °C, 5%CO2). Органоиды в средах помещают в пластины со сверхнизкой адгезией, используя примерно одну четвертую часть объема кондиционированной среды (из ночной отгрузки) и три четверти объема свежей среды31,54. Выдерживать в течение 24–48 ч.
  5. Подготовьте и уравновесьте несколько свежих 60-миллиметровых планшетов с нервной средой (как приготовлено на этапе 2.4) в течение не менее 1 ч в инкубаторе для культивирования тканей (37 °C, 5% CO2) перед анестезией первого животного. Обратите внимание, что эти пластины используются для переноса органоидов для каждой отдельной операции с предположением, что условия pH и насыщение CO2 будут поддерживаться в среде в течение не менее 20 мин, что достаточно для перемещения планшета в операционную и загрузки органоидов в канюлю.
  6. Для каждого случая трансплантации используйте свежую 60-миллиметровую пластину с предварительно насыщенной нейронной средой, а остальные пластины храните в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C.
  7. Перенесите 6–9 органоидов в одну чашку диаметром 60 мм (с перенасыщенной средой) путем их пипетки ручной одноканальной пипеткой (20–200 мкл) со стерильным фильтрующим наконечником 200 мкл с широким (~0,7 мм) отверстием. Эти наконечники можно подготовить заранее или во время процедуры, отрезав ~ 3-4 мм наконечника стерильными ножницами (делается в капюшоне для культивирования тканей, чтобы избежать загрязнения). Поместите 60-миллиметровую чашку в 100-миллиметровую чашку для культивирования тканей (чтобы избежать загрязнения во время транспортировки из комнаты в комнату) и быстро транспортируйте в операционный кабинет.
  8. Поместите тарелку с органоидами на электрическую грелку с температурой 37 °C, накрытую стерильной драпировкой.
  9. Переоденьтесь в свежую пару стерильных перчаток перед подготовкой органоидов.
  10. Органоиды промывают в стерильном сбалансированном солевом растворе (BSS) (опционально), а затем загружают в инжектор, который состоит из тонкостенной канюли из боросиликатного стекла (наружный диаметр, OD 1,52 мм; внутренний диаметр, ID 1,12 мм) с полированным тупым концом, прикрепленным стерильной пластиковой трубкой к стерильному шприцу Hamilton объемом 500 мкл, предварительно заполненному стерильным BSS.
  11. Передайте канюлю хирургической бригаде стерильным способом, когда они будут готовы ввести органоиды.
  12. Продолжительность всей процедуры (от удаления органоидов из питательных сред до загрузки канюли) должна составлять не более 20 минут.
  13. Если есть задержка с имплантацией органоидов, поместите их обратно в инкубатор для тканевых культур, чтобы избежать изменений в насыщении рН / CO2 внутри чашки.
  14. Храните неиспользованные органоиды в течение 1 недели в том же инкубаторе для тканевых культур и следите за любыми признаками загрязнения.

3. Имплантация субретинальных органоидов

  1. Выполните боковую кантотомию 0,5–1 см с помощью ножниц для тенотомии Стивенса. Поместите зеркало для век Барракера подходящего размера, чтобы веки оставались открытыми. Убедитесь, что ассистент хирурга регулярно орошает роговицу BSS на протяжении всей процедуры.
  2. Наложите 2 шва из шелкового шва 6–0 на конъюнктиву, непосредственно прилегающую к лимбу в положениях «4 и 8 часов», чтобы удерживать глаз в первичном взгляде и втягивать третье веко. Используйте щипцы для связывания роговицы 0,5 Castroviejo и небольшой противомоскитный гемостат, чтобы осторожно захватить бульбарную конъюнктиву рядом с лимбом. Оставьте швы длинными и зажмите концы мелкими противомоскитными гемостатами, чтобы помочь в их манипуляциях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наложение шва под третье веко сложнее; Обязательно размещайте его непосредственно рядом с лимбом.
  3. Наложите еще один шов в положении «12 часов» на лимб, частично через толщу лимба, стараясь не проникнуть в глаз. Завяжите этот шов свободно, а концы коротко обрежьте. Это обеспечивает прочный анкерный шов, который используется во время операции в качестве «ручки» для вращения глаза, чтобы хирург мог получить доступ к различным частям земного шара на разных этапах процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.2 и 3.3 можно инвертировать. Последовательность наложения швов остается предпочтительной для хирурга.
  4. Отразите бульбарную конъюнктиву между 10–2 часами (периметрия). С помощью ножниц для тенотомии надрежьте конъюнктиву на расстоянии 2–3 мм от лимба. Подорвите его и очистите капсулу шипа, чтобы обнажить склеру в местах для 2-часовых и 10-часовых портов витрэктомии, которые будут размещены примерно в 3–5 мм от лимба в зависимости от возраста животного. Используйте хирургические целлюлозные копья для гемостаза и для очистки крови.
  5. Определите места для склеротомии после отражения конъюнктивы и капсулы шипа с помощью штангенциркуля. Выбирайте места склеротомии (в 2 и 10 часов, стремясь пройти через pars plana), чтобы избежать крупных склеральных сосудов, которые могут быть заметны у кошки. Используйте прижигание во влажном поле на склере в запланированных местах склеротомии, чтобы уменьшить склеральное кровотечение, планируя область ~ 3 мм в порту инструмента (порт 10 часов для хирурга-правши), так как он будет увеличен после витрэктомии, чтобы можно было ввести имплантационную канюлю.
  6. Предварительно наложите крестообразные швы (полиглактиновый шов 6-0 или 7-0), не завязывая узел в месте предполагаемой склеротомии, перед установкой портов для витрэктомии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это способствует быстрому закрытию склеротомии в конце процедуры. Шов для планируемого инструментального порта должен иметь более длинный прикус склеры, так как это будет длинный разрез.
  7. После наложения швов попросите помощника помочь расположить глобус, удерживая 12-часовые швы, связав или используя щипцы Бишопа-Хармона. Пусть хирург также стабилизирует глобус, используя щипцы Кастровьехо диаметром 0,12 мм, чтобы удерживать ткань рядом с местом склеротомии.
    1. Вводите порт для витрэктомии 23 G с помощью троакара через склеру в положениях «2 часа» и «10 часов», направленных под углом к зрительному нерву, чтобы избежать контакта с хрусталиком.
    2. Убедитесь, что отверстие для орошения находится в стекловидном теле, осторожно надавливая на порт с помощью вязных щипцов, чтобы кончик можно было визуализировать в стекловидном теле. Как только правильное позиционирование будет подтверждено, прикрепите линию полива к порту и расположите линию с помощью тонких клейких бинтов, чтобы закрепить ее на месте. Установите инфузию буфера BSS для витрэктомии первоначально на 30–35 мм рт.ст., нажимая кнопки со стрелками (вверх или вниз), расположенные на передней панели аппарата для витрэктомии.
  8. Пусть ассистент поднесет увеличительную ирригационную витрэктомию Machemer на роговицу, чтобы обеспечить визуализацию заднего сегмента глаза на следующих этапах. Прикрепите ирригационную линзу для витрэктомии к капельнице, обеспечивающей постоянную подачу жидкости для соединения линзы с роговицей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут быть использованы другие формы линз для контактной витрэктомии. Приглушите или выключите свет в комнате, чтобы облегчить визуализацию с помощью операционного микроскопа.
  9. Вставьте зонд/резак для витрэктомии 23 G (2,500 копий в минуту) через порт инструмента (рядом с доминирующей рукой хирурга, т. е. порт 10 часов для хирурга-правши) и выполните частичную витрэктомию ядра.
    1. Затем полностью удалите стекловидное тело с поверхности сетчатки в области, которая будет получать трансплантат (это важно для успеха процедуры), отделив витреальное лицо от сетчатки.
    2. Поместите зонд для витрэктомии на головку зрительного нерва так, чтобы порт был направлен в сторону от поверхности сетчатки, и примените более высокий вакуум, чтобы начать отслоение витреального лица.
  10. Подготовьте кристаллы триамцинолона для внутриглазного применения. Если суспензия триамцинолона не предназначена специально для интравитреального применения, промойте кристаллы, а затем повторно суспендируйте в BSS.
    1. Первоначально отфильтруйте суспензию с помощью стерильного шприцевого фильтра с порами 0,22 мкм с мембраной PES (прикрепленной к шприцу объемом 1 мл) для улавливания кристаллов.
    2. Затем промойте захваченные кристаллы триамцинолона путем аспирации BSS в шприце объемом 1 мл и промывки через фильтр (кристаллы остаются в фильтре). Это удаляет консерванты в растворе. Повторите промывку 3 раза, после чего кристаллы повторно суспендируют в 1 мл BSS.
  11. Введите иглу шприца, удерживающего триамцинолон, через порт инструмента. Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к линзе, наблюдая за кончиком иглы через зрачок при введении иглы через порт инструмента. Вводят от 0,25 до 0,5 мл кристаллической суспензии. Затем вставьте датчик для витрэктомии через порт инструмента и поднесите его близко к головке зрительного нерва так, чтобы порт был удален от поверхности сетчатки, и используйте высокий вакуум, чтобы помочь отделить витреальное лицо от сетчатки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы триамцинолона прилипают к оставшемуся стекловидному телу и, таким образом, выделяют его. Осторожно удалите стекловидное тело выше и рядом с местом планируемой имплантации органоидов (например, центральное тапетальное дно рядом с областью centralis ).
  12. Создайте небольшой очаговый пузырь отслойки сетчатки в желаемом месте имплантации с помощью субретинального инжектора, например, субретинального инъектора 23 G с выдвижной канюлей 41 G, прикрепленной к стерильному газонепроницаемому шприцу Luer Lock 250 мкл, заполненному стерильным BSS.
    1. Перед созданием субретинального пузыря уменьшите инфузионное давление до 10 мм рт.ст., чтобы облегчить образование пузырьков.
    2. Вставьте инжектор через порт прибора и поднимите его к поверхности сетчатки. Выдавите наконечник канюли и аккуратно прижмите его к поверхности сетчатки. Попросите помощника слегка быстро нажать на поршень шприца, чтобы начать отслоение сетчатки, которое снижает давление инъекции, чтобы обеспечить медленное увеличение отслоения сетчатки до тех пор, пока не будет достигнут желаемый размер (используется примерно от 100 до 200 мкл BSS).
  13. Если созданная ретинотомия находится в подходящем положении, что позволяет избежать разрезания сетчатки между местом имплантации и головкой зрительного нерва, чтобы предотвратить рассечение слоя нервного волокна, полученного из места имплантации, и избежать крупных кровеносных сосудов сетчатки (это также определяется дизайном исследования, в нашем случае была выбрана центральная сетчатка), затем немного увеличьте его с помощью канюли 41 G инжектора, чтобы облегчить введение ножниц сетчатки.
  14. Извлеките инжектор из глаза и извлеките 10-часовой склеральный порт. Увеличьте склеротомию в этом месте с помощью прямого щелевого ножа / кератома диаметром 2,85 мм, ориентированного на зрительный нерв, чтобы избежать прикосновения к хрусталику. Поддерживайте давление инфузии на уровне 10–15 мм рт.ст.
  15. Расширьте ретинотомию с помощью витреоретинальных вертикальных ножниц под углом 80 ° с ручкой сжатия, избегая разрезания сосудов сетчатки, чтобы предотвратить кровоизлияние в сетчатку, и обязательно разрезайте сетчатку на краю пузыря от головки зрительного нерва, чтобы избежать перерезания нервных волокон, ведущих от сетчатки в области трансплантации к зрительному нерву. Ретинотомия должна иметь достаточную ширину для приема органоидов.
  16. Вставьте предварительно загруженный стеклянный капилляр, содержащий органоиды (см. шаг 2.10), через увеличенную склеротомию и продвигайте его к месту ретинотомии при прямой визуализации.
    1. Используйте кончик стеклянного капилляра, чтобы слегка приоткрыть ретинотомию, чтобы получить доступ к отверстию в субретинальный пузырь.
    2. Попросите помощника медленно нажать на поршень инжектора, наблюдая при этом в микроскоп, вводя органоиды в субретинальный пузырь. BSS должен предшествовать органоидам и промывать ретинотомию.
    3. Осторожно протолкните органоиды внутри пузырька кончиком стеклянного капилляра, если они находятся на краю ретинотомии.
  17. Удерживайте стеклянный капилляр в ретинотомии в течение нескольких секунд, чтобы попытаться закрыть ретинотомию и предотвратить выход органоидов в стекловидное тело.
  18. Очень медленно удаляйте стеклянный капилляр из глаза, избегая внезапного выброса жидкости из глаза, чтобы избежать движения жидкости внутри глаза, которое может вытеснить органоиды из субретинального пузыря.
  19. Медленно увеличивайте давление инфузии до 20–30 мм рт.ст., чтобы предотвратить внутриглазное кровотечение, следя за тем, чтобы инфузионная жидкость не вымывалась непосредственно на пузырь. Это выполняется нажатием кнопок со стрелками вверх на передней панели аппарата для витрэктомии.
  20. Закройте склеротомию с помощью предварительно наложенного шва крестообразным способом (полиглактин 6–0 или 7–0). Добавьте дополнительные простые прерывистые швы по мере необходимости, чтобы герметизировать склеротомию.
  21. Попросите ассистента удалить инфузионный порт и позвольте хирургу быстро завязать предварительно наложенный шов, чтобы герметизировать склеротомию и предотвратить потерю внутриглазного давления.
  22. Закройте разрез конъюнктивы (перитомия), используя полиглактин 6–0 или 7–0 по простой непрерывной схеме.
  23. Снимите глазное дно (например, с помощью видеокамеры глазного дна RetCam II, Clarity или аналогичной) и запишите непосредственное положение органоидов в субретинальном пространстве.
  24. Повторно подготовьте поверхность глаза после визуализации с помощью 0,2% раствора повидон-йода с помощью аппликаторов с ватными наконечниками и ватных тампонов. Снимите три остаточных шва и зеркало крышки.
  25. Закройте латеральную кантотомию полиглактиновым швом 6-0. Наложите один заглубленный шов, а затем наложите 8 кожных швов, чтобы реформировать боковой кантус, а затем используйте простые прерывистые кожные швы, чтобы закрыть остальную часть раны.
  26. После завершения хирургического вмешательства сделайте субконъюнктивальную инъекцию комбинации стероидов и антибиотиков (2 мг метилпреднизолона ацетата, 0,1 мг дексаметазона и 1 мг гентамицина). Нанесите офтальмологическую смазку (искусственные слезы) на роговицу.
  27. Восстановите животное после анестезии и внимательно следите во время выздоровления на наличие любых признаков боли, которые потребуют дополнительного лечения, таких как выраженный блефароспазм, сильное нежелание манипулировать, вялость или снижение аппетита, а также учащенное дыхание и частота сердечных сокращений. Обеспечьте послеоперационную анальгезию по мере необходимости и внимательно следите за любым дискомфортом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только должным образом обученный персонал должен отвечать за анестезию и наблюдение за кошачьими пациентами до, во время и после операции. Следуйте рекомендациям местного комитета по этике животных по послеоперационному уходу.

4. Постимплантационные процедуры, послеоперационное лечение и оценка

  1. Продолжайте лечение пероральными иммунодепрессантами (1 мг / кг преднизолона и 2 мг / кг циклоспорина перорально два раза в день), чтобы помочь контролировать воспаление и отторжение органоидов. Обеспечьте системный охват антибиотиками (например, пероральный доксициклин 5 мг / кг два раза в день - этот антибиотик был выбран из-за риска оппортунистической микоплазменной инфекции у животных с ослабленным иммунитетом).
  2. Выполняйте регулярные офтальмологические осмотры для мониторинга воспаления или развития нежелательных явлений. Следите за уплощением сетчатки, которое происходит в течение первых нескольких дней после операции, несмотря на большую ретинотомию, необходимую для введения органоидов в субретинальное пространство. Записывайте изображения глазного дна при каждом осмотре, чтобы зафиксировать положение и внешний вид пересаженных органоидов.
  3. Визуализируйте животных под общим наркозом с помощью конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии (cSLO) и спектральной области – оптической когерентной томографии (SD-OCT)5,31 в период наблюдения и до окончания эксперимента.
  4. Гуманно усыпить животных по окончании эксперимента, используя метод, одобренный AVMA, например, внутривенное введение 85 мг / кг пентобарбитала. После седации установите внутривенный катетер для введения пентобарбитала, чтобы свести к минимуму стресс. Подтвердите смерть прекращением сердцебиения и сделайте разрез в грудной клетке, чтобы создать пневмоторакс.
  5. Удалите глаза с помощью стандартного трансконъюнктивального доступа и зафиксируйте по мере необходимости. Для иммуногистохимии (ИГХ) немедленно погружают глаза в 4% раствор параформальдегида после того, как 0,3 мл фиксирующего раствора вводят в задний сегмент через 3 прорези, сделанные через pars plana с 11 лезвием Паркера (~3-4 мм от лимба).
  6. Рассекают наглазники через 3,5 ч фиксации при 4 °C. Удалите остатки стекловидного тела, убедившись, что сетчатка и органоиды остаются нетронутыми. Поместите обратно в фиксатор еще на 30 минут при 4 ° C, затем промойте наглазники 3 раза каждый в течение 10 минут в PBS. Переведите наглазник на 15% сахарозу в течение 2 ч, затем в 30% сахарозу еще на 2 часа.
  7. Дважды промойте наглазник PBS и поместите в среду OCT (смесь с оптимальной температурой резки) и заморозьте, затем храните при температуре -80 ° C до срезов для гистологии и иммунохимии.
  8. Подбирайте антитела для ИГХ на основе протокола исследования и целей.

Результаты

Эта процедура обеспечивает успешную и воспроизводимую имплантацию органоидов сетчатки, полученных из hPSC, в субретинальное пространство модели крупного глаза животного (продемонстрировано здесь на 2 примерах: кошки дикого типа со здоровыми фоторецепторами (PR) и кошки CrxRdy/+<...

Обсуждение

Имплантация ткани сетчатки, полученной из hPSC (органоидов сетчатки), в субретинальное пространство является перспективным экспериментальным подходом к восстановлению зрения при дегенеративных заболеваниях сетчатки на поздних стадиях, вызванных гибелью клеток PR (глубокая или термина?...

Раскрытие информации

Ратнеш К. Сингх, доктор философии, Франсуа Бинетт, доктор философии, и Игорь О. Насонкин, доктор философии, являются сотрудниками Lineage Cell Therapeutics, Inc. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась грантом NEI Fast-track SBIR R44-EY027654-01A1 и грантом SBIR 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; доктор Петерсен-Джонс является со-PI). Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Дженис Керубин (MSU RATTS) за ее помощь в анестезии и общем уходе за животными, включенными в это исследование, а также за помощь в хирургических условиях и подготовке/стерилизации инструментов. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Пейдж Винклер за помощь в получении органоидов и размещении их в среде за день до имплантации и за помощь в день имплантации. Авторы также благодарны г-ну Рэнди Гарчару (LCTX) за тщательную доставку органоидов сетчатки, сборку грузоотправителя и загрузку температурных и G-стрессовых записей после каждой отправки. Эта работа была выполнена в то время, когда автор Игорь Насонкин работал в Biotime (ныне Lineage).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm pore syringe filter with PES membraneCameoNAcan be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannulaDORC1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringeHamiltonNAcan be found through various suppliers
6-0 Silk sutureEthicon707G
6-0/7-0 polyglactin sutureEthiconJ570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject)Henry Schein Animal HealthNAcan be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mLPar PharmaceuticalNAcan be found through various suppliers
cSLO + SD-OCTHeidelberg EngineeringSpectralis HRA+ OCT
CyclosporineNovartisNAcan be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium)VetoneNAcan be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mLCiplaNAcan be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution)VortechNAcan be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mLHospiraNAcan be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass TubingWorld Precision InstrumentsTW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mLPfizerNAcan be found through various suppliers
MicroscopeZeissNA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)Sakura4583
Olympic Vac-Pac Size 23NatusNAcan be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solutionEMS15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic SolutionAkornNAcan be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mLAkornNAcan be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)ZoetisNAcan be found through various suppliers
RetCam II video fundus cameraClarity Medical SystemsNAcan be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40)Bristol -Myers Squibb CompanyNAcan be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solutionAkornNAcan be found through various suppliers
Vitrectomy 23G portAlconAccurus systems
Vitrectomy machineAlconAccurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handleFrimenFT170206T

Ссылки

  1. Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
  2. Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
  3. Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
  4. Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
  5. Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
  6. Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
  7. Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
  8. Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
  9. Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
  10. Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
  11. Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
  12. Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
  13. Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
  14. Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
  15. Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
  16. Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
  17. Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
  18. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
  19. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  20. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
  21. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  22. Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
  23. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  24. Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
  25. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  26. Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
  27. Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
  28. Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
  29. Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
  30. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  31. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  32. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  33. Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
  34. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  35. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  36. Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
  37. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  38. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  39. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  40. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  41. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
  42. Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
  43. Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
  44. Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
  45. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
  46. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
  47. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  48. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  49. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  50. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  51. Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
  52. Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
  53. Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
  54. Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
  55. Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
  56. Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
  57. Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
  58. Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
  59. O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
  60. Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
  61. Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
  62. Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
  63. Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
  64. Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены