JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе представлен метод вылупления без использования яичной скорлупы для токсикологических исследований твердых загрязнителей, таких как микропластик.

Аннотация

Микропластик является новым глобальным типом загрязнителей, который представляет большую угрозу для здоровья животных из-за их поглощения и перемещения в тканях и органах животных. Экотоксикологические эффекты микропластика на развитие эмбрионов птиц не известны. Птичье яйцо представляет собой полноценную систему развития и питания, а все развитие эмбриона происходит в яичной скорлупе. Таким образом, прямая запись развития эмбрионов птиц под давлением загрязняющих веществ, таких как микропластик, сильно ограничена непрозрачной яичной скорлупой в традиционном инкубатории. В этом исследовании влияние микропластика на развитие эмбриона перепела визуально контролировалось путем вылупления без яичной скорлупы. Основные этапы включают очистку и дезинфекцию оплодотворенных яйцеклеток, инкубацию перед воздействием, кратковременную инкубацию после воздействия и извлечение образца. Результаты показывают, что по сравнению с контрольной группой, влажный вес и длина тела группы, подвергаемой воздействию микропластика, показали статистическую разницу, а доля печени всей подвергойся воздействию группы значительно увеличилась. Дополнительно мы оценили внешние факторы, влияющие на инкубацию: температуру, влажность, угол вращения яйца и другие условия. Этот экспериментальный метод предоставляет ценную информацию об экотоксикологии микропластика и новый способ изучения неблагоприятного воздействия загрязняющих веществ на развитие эмбрионов.

Введение

Производство пластиковых отходов в 2015 году составило около 6300 млн тонн, одна часть из которых была переработана, а остальная часть была сожжена или похоронена под землей. По оценкам, около 12 000 млн тонн пластиковых отходов будут захоронены под землей к 2050году1. С вниманием международного сообщества к пластиковым отходам, Томпсон впервые предложил концепцию микропластика в 2004году 2. Микропластики (МП) относятся к мелким твердым пластмассам с диаметром частиц менее 5 мм. В настоящее время исследователи обнаружили повсеместное присутствие депутатов на береговой линии различных континентов, атлантических островов, внутренних озер, Арктики и глубоководных местообитаний3,4,5,6,7. Поэтому все больше исследователей начали изучать экологические опасности депутатов.

Организмы могут поглощать депутатов в окружающей среде. В пищеварительном тракте были обнаружены 233 морских организма по всему миру (в том числе 100% видов черепах, 36% видов тюленей, 59% видов китов, 59% видов морских птиц, 92 видов морских рыб и 6 видов беспозвоночных)8. Более того, депутаты могут блокировать пищеварительную систему организмов, накапливаться и мигрировать в своих бобах9. Установлено, что депутаты могут передаваться по пищевой цепочке, и их потребление отличается изменениями среды обитания, стадией роста, пищевыми привычками и источниками пищи10. Некоторые исследователи сообщили о существовании депутатов в помете морских птиц11,а это значит, что морские птицы выступают в качестве переносчика депутатов. Кроме того, прием внутрь депутатов может повлиять на здоровье некоторых организмов. Например, депутаты могут запутаться в желудочно-кишечном тракте, тем самым увеличив смертность китообразных12.

Только депутаты оказывают токсическое воздействие на организмы, а также совместное токсическое воздействие на организмы с другими загрязнителями. Проглатывание связанных с окружающей средой концентраций пластикового мусора может нарушить функцию эндокринной системы взрослых рыб13. Размер микропластиков является одним из важных факторов, влияющих на их усвоено и накопление организмами14,15. Малогабаритные пластмассы, особенно наноразмерные, склонны к взаимодействию с клетками и организмами с высокой токсичностью16,17,18,19. Хотя вредное воздействие микропластиков размером наночастицы на организмы превышает текущий уровень исследований, обнаружение и количественная оценка микропластиков с размерами менее нескольких микрометров, особенно субмикронов / нанопластиков в окружающей среде, по-прежнему является большой проблемой. Кроме того, нанопластики также оказывают некоторое влияние на эмбрионы. Полистирол может повредить развитие эмбрионов морских ежей, регулируя профили белка и генов20.

Чтобы изучить потенциальное влияние депутатов на организмы, мы провели это исследование. Из-за сходства между эмбрионами птиц и человеческими эмбрионами они обычно используются в исследованиях биологии развития21, включая ангиогенез и антиангиогенез, тканевую инженерию, имплантат биоматериала и опухоли головного мозга22,23,24. Эмбрионы птиц обладают преимуществами низкой стоимости, короткого цикла культивации и простоты эксплуатации25,26. Поэтому мы выбрали эмбрионы перепелов с коротким циклом роста в качестве экспериментального животного в этом исследовании. Одновременно мы можем непосредственно наблюдать морфологические изменения эмбрионов перепелов, подвергшихся воздействию МП на стадии эмбрионального развития, используя технологию инкубационного вылупления без яичной скорлупы. Экспериментальными материалами были полипропилен (ПП) и полистирол (ПС). Поскольку pp и PS27 составляют наибольшую долю типов полимеров, полученных в отложениях и водоемах во всем мире, наиболее распространенными типами полимеров, извлеченными из захваченных морских организмов, являются этилен и пропилен28. Этот экспериментальный протокол описывает весь процесс визуальной оценки токсикологического воздействия депутатов на эмбрионы перепелов, подвергшиеся воздействию депутатов. Мы можем легко расширить этот метод для изучения токсичности других загрязняющих веществ для развития эмбрионов других яйцекладущих животных.

протокол

1. Подготовка перед воздействием

  1. Отбирайте оплодотворенные перепелиные яйца, рожденные в тот же день, для теста на воздействие.
  2. Выбирайте перепелиные яйца с одинаковым весом. Каждая оплодотворенная перепелиная яйцеклетка составляет около 10-12 г.
  3. Полностью очистите все оплодотворенные перепелиные яйца от внешнего кала и другого мусора.
  4. Стерилизуйте каждое предварительно вылупившиеся оплодотворенное перепелиное яйцо и яйца, которые будут использоваться (выбирайте яйца с похожей формой скорлупы, особенно кончик яйца) раствором антибиотика (пенициллин и стрептомицин, 1:1000, комнатная температура). Стерилизуйте инкубатор 75% этанолом.
  5. Откройте яйца тупым концом бормашины, оставив яичную скорлупу на кончике для дальнейшего использования. Перед переносом оплодотворенных яйцеклеток содержимое яйцеклеток выливается наружу. Это для удержания влаги яичной скорлупы. Диаметр отверстия яйца составлял около 3 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить повреждение эмбриона перепела, используйте бормашилу, чтобы открыть тупой конец яйца и сделать трещину как можно более гладкой.
  6. После стерилизации поместите оплодотворенные перепелиные яйца в инкубатор при температуре 38 °C с влажностью 60% в течение 24-48 ч. Убедитесь, что тупой конец перепелиного яйца обращен вверх.
  7. Во время инкубации оплодотворенных перепелиных яиц стерилизуйте инструменты, необходимые в последующих экспериментах, в стерилизационном горшке. Эти инструменты включают в себя полиэтиленовую пленку, бикер, стерильную воду, наконечники пипеток, хирургические прямые ножницы, пинцет и ложку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пленку с температурным допуском, достаточно высоким, чтобы избежать проблем с высокотемпературной стерилизацией.

2. Вылупление перепелиного яйца без скорлупы

  1. Переложите предварительно вылупившиеся оплодотворенные перепелиные яйца из инкубатора на чистую скамейку и положите их ровно на контейнер, чтобы стабилизировать их примерно на 1-2 мин.
  2. С помощью ножниц (хирургические прямые ножницы 12,5 см) проткните небольшое отверстие (диаметром 3 мм) в центральной оси предварительно вылупившихся оплодотворенных перепелиных яиц и вырежьте 1-2 см небольшое отверстие. Аккуратно перенесите яичный белок и желток оплодотворенных перепелиных яиц в разрезанную яичную скорлупу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При разрезании ножницами небольшого отверстия избегайте прикосновения к желтку перепелиных яиц.
  3. Добавляем контрольный раствор (без МП) и открытый раствор различных масс (0,1, 0,2 и 0,3 мг) микропластика с тремя размерами частиц (100, 200 и 500 нм) к содержимому яйца пипеткой. При этом добавляют 1 каплю пенициллина и 1 каплю стрептомицина шприцем 1 мл.
  4. Закройте отверстие яичной скорлупы стерилизованной пленкой (шаг 1.6).
  5. Согласно шагу 2.1-2.4 обработайте все оплодотворенные перепелиные яйца.
  6. Поместите перенесенные эмбрионы перепелов в инкубатор с температурой 38 °C с влажностью 60% на необходимый период. В этом эксперименте используйте угол поворота яйца ±30°. Переворачивайте яйца раз в час.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перевод должен быть как можно более быстрым, что требует большей практики на ранней стадии.

3. Сбор образцов

  1. После семи дней культивирование удаляют из желтка хорошо развитые эмбрионы, наблюдаемые невооруженным глазом, и промывают фосфатно-буферным раствором (ПБС).
  2. Высушите излишки раствора вне очищенного эмбриона абсорбирующей бумагой и взвесьте в чистой чашке Петри.
  3. Откройте всю грудную полость, отделите печень и сердце от внутренних органов плоскогубцами и иглонос и поместите в центрифужные трубки объемом 1,5 мл сразу после очистки.
  4. Быстро запишите вес на электронные весы и рассчитайте гепатосоматический индекс (HIS = вес печени / масса тела х 100). Измерьте длину грудины и тела.
  5. Исходя из вышеуказанных показателей, оцените влияние депутатов на эмбриональное развитие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Качество эмбриона здесь относится к качеству удаления желтка.

4. Анализ данных

  1. Сообщайте экспериментальные данные в виде средней ± стандартной погрешности (SEM).
  2. Используйте однофакторный дисперсионный анализ для сравнения средних нескольких групп образцов. Значение существенной разницы составило α = 0,05.

Результаты

Для анализа экспериментальных данных мы сравнили влажную массу, длину тела, длину грудины и изменение гепатосоматического индекса между контрольной группой и 6 экспериментальными группами, измеряя и отражая рост и развитие эмбрионов перепелов с макроперрости. Мы обнаружили шесть нор?...

Обсуждение

В данной работе представлена эффективная экспериментальная схема оценки развития эмбриона перепела путем выявления основных показателей развития. Тем не менее, есть еще некоторые ограничения для этого эксперимента.

Во-первых, смертность эмбрионов перепелов на более п...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать. Все авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу этой статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана ключевыми научно-исследовательскими проектами в Синьцзян-Уйгурском автономном районе (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
 Multi sample tissue grinderShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.Tissuelyser-24Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature
Electronic balanceOHAUS corporationPR Series PrecisionUsed for weighing
Fertilized quail eggsGuangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd.Quail eggs for hatching without shell
Fluorescent polypropylene particlesFoshan Juliang Optical Material Co., Ltd.Types of plastics selected for the experiment
IncubatorShandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd.264 pcProvide a place for embryo growth and development
Nanometer-scale polystyrene microspheresXi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd.100 nm, 200 nm, 500 nmTypes of plastics selected for the experiment
Steel rulerDeli Group20 cmUsed to measure  length
Vertical heating pressure steam sterilizerShanghai Shenan Medical Instrument FactoryLDZM-80KCS-IISterilize the experimental articles

Ссылки

  1. Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
  2. Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
  3. Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
  4. Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
  5. Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
  6. Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
  7. Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R. Microplastic pollution in deep-sea sediments. Environmental Pollution. 182, 495-499 (2013).
  8. Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
  9. Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
  10. Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
  11. Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
  12. Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
  13. Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
  14. Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
  15. Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
  16. Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
  17. Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
  18. Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
  19. Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
  20. Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
  21. El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
  22. Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
  23. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  24. Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
  25. Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
  26. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  27. Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
  28. Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены