Идентификация, выделение и характеристика фибро-адипогенных предшественников (ФАП) и миогенных прародителей (МП) в скелетных мышцах крыс

Резюме

Этот протокол описывает метод выделения фибро-адипогенных предшественников (FAP) и миогенных предшественников (MP) из скелетных мышц крыс. Использование крысы в моделях мышечных травм обеспечивает повышенную доступность тканей из атрофических мышц для анализа и более широкий репертуар проверенных методов для оценки мышечной силы и походки у свободно движущихся животных.

Аннотация

Фибро-адипогенные предшественники (FAP) являются резидентными интерстициальными клетками в скелетных мышцах, которые вместе с миогенными предшественниками (MP) играют ключевую роль в гомеостазе мышц, травмах и восстановлении. Современные протоколы идентификации и изоляции FAP используют проточную цитометрию / флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS), а исследования, оценивающие их функцию in vivo, на сегодняшний день были проведены исключительно на мышах. Больший размер, присущий крысе, позволяет проводить более полный анализ FAP в моделях травм скелетных мышц, особенно в сильно атрофированных мышцах или когда исследователям требуется значительная масса тканей для проведения нескольких анализов вниз по течению. Крыса дополнительно предоставляет больший выбор мышечных функциональных анализов, которые не требуют седации или жертвоприношения животных, тем самым сводя к минимуму заболеваемость и использование животными, позволяя проводить серийные оценки. Протоколы проточной цитометрии / FACS, оптимизированные для мышей, являются видоспецифичными, в частности, ограниченными характеристиками коммерчески доступных антител. Они не были оптимизированы для отделения ФАПов от крыс или сильно фиброзных мышц. Был разработан протокол проточной цитометрии /FACS для идентификации и изоляции FAP и MPs как из здоровых, так и из денервированных скелетных мышц крыс, основанный на дифференциальной экспрессии поверхностных маркеров CD31, CD45, Sca-1 и VCAM-1. Поскольку специфические для крыс первичные антитела, подтвержденные проточной цитометрией, сильно ограничены, была выполнена внутренняя конъюгация антитела, нацеленного на Sca-1. С помощью этого протокола была подтверждена успешная конъюгация Sca-1, а проточная цитометрическая идентификация FAP и MP была подтверждена клеточной культурой и иммуноокрашиванием FACS-изолированных FAP и MP. Наконец, мы сообщаем о новом временном курсе FAPs в пролонгированной (14 недель) модели денервации крыс. Этот метод предоставляет исследователям возможность изучать FAP в новой модели животных.

Введение

Фибро-адипогенные клетки-предшественники (FAP) представляют собой популяцию резидентных мультипотентных клеток-предшественников в скелетных мышцах, которые играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации и, наоборот, также опосредуют патологические реакции на повреждение мышц. Как следует из названия, FAP были первоначально идентифицированы как популяция-прародитель с потенциалом дифференцироваться в фибробласты и адипоциты¹ и претендовали на то, чтобы быть ключевыми медиаторами фиброзно-жировой инфильтрации скелетных мышц при хронических травмах и заболеваниях. Дальнейшие исследования показали, что ФАП дополнительно способ....

протокол

Следователи, проводящие этот протокол, должны получить разрешение от своего местного совета по этике животных / комитета по уходу за ними. Все работы с животными были одобрены Комитетом по уходу за животными больницы Святого Михаила Unity Health Toronto (ACC #918) и проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Канадским советом по уходу за животными (CCAC). Схема протокола проточной цитометрии показана на рисунке 1. Если последующим применением является FACS и последующая клеточная культура, все шаги должны быть выполнены с помощью надлежащей асептической техники.

1. Сбор мышечной массы

Результаты

Идентификация FAP и MP с помощью проточной цитометрии с использованием новой панели антител, включая Sca-1 и VCAM-1
Стратегия определения ФАПов в мышцах крыс основана на протоколах проточной цитометрии у мыши^29,которая распространяется на CD31.......

Обсуждение

Оптимизированный, проверенный протокол изоляции FAPs для мышц крыс имеет важное значение для исследователей, которые хотят изучить модели травм, которые неосуществимы у мыши по биологическим или техническим причинам. Например, мыши не являются оптимальной животной моделью для изучения.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	Falcon	352235
10 cm cell culture dishes	Sarstedt	83.3902
12-well cell culture plate	ThermoFisher	130185
12 mm glass coverslips, No.2	VWR	89015-724
10 mL Syringe	Beckton Dickenson	302995
15 mL centrifuge tubes	FroggaBio	91014
20 gauge needle	Beckton Dickenson	305176
25mL Serological pipette	Sarstedt	86.1685.001
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
50mL centrifuge tubes	FroggaBio	TB50
AbC Total Antibody Compensation Beads	ThermoFisher	A10497
Ammonium Chloride, Reagent Grade	Bioshop	AMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µg	Biotium	92307
Aquatex Aqueous Mounting Medium	Merck	108562
Biolaminin 411 LN	Biolamina	LN411
Bovine Serum Albumin (BSA)	Bioshop	ALB001
Calcium Chloride	Bioshop	CCL444.500
Collagenase Type II	Gibco	17101015
CountBright Plus Absolute Counting Beads	ThermoFisher	C36995
Dexamethasone	Millipore Sigma	D4902
Dispase	Gibco	17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	(+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTA	FisherScientific	S311
FACSClean Solution	Beckton Dickenson	340345
FACSDiva Software	Beckton Dickenson	--
FACSRinse Solution	Beckton Dickenson	340346
Fetal Bovine Serum	Sigma	F1051
Flow Cytometry Sheath Fluid	Beckton Dickenson	342003
FlowJo Software	Beckton Dickenson	--
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody	Invitrogen	A21429
Goat Serum	Gibco	16210-064
Ham's F10 Media	ThermoFisher	11550043	(+) Phenol Red (+) L-Glutamine (-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)	Multicell	311-513-CL
Heat Inactivated Horse Serum	Gibco	26050-088
Hemocytometer	Reichert	N/A
HEPES, minimum 99.5% titration	Sigma	H3375
Horse Serum	ThermoFisher	16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)	Cell Signaling	8915LF
Humulin R	Lilly	HI0210
IBMX	Millipore Sigma	I5879	Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
Isopropanol	Sigma	I9516	Also known as 2-propanol
Lewis Rat, Female	Charles River Kingston	004 (Strain Code)	200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer	Beckton Dickenson	--
Microcentrifuge	Eppendorf	EP-5417R
MoFlo XDP Cell Sorter	Beckman Coulter	--
Mouse Anti-CD31::FITC Antibody	Abcam	ab33858	Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC Antibody	Biolegend	202205	Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE Antibody	Biolegend	200403	Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A	Also known as MF20
Mouse Anti-Pax7 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %	Sigma	HT501128
Oil Red O	Millipore Sigma	O0625
PE-Cy7 Conjugation Kit	Abcam	ab102903
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	(-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent Grade	Bioshop	PBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody	Invitrogen	MA5-32347	FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody	Abcam	ab203254
Rabbit Anti-Laminin Antibody	Sigma	L9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody	Abcam	ab3526
Rabbit Anti-Sca-1 Antibody	Millipore Sigma	AB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody	Abcam	ab260043	Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody	Abcam	ab203491
Recombinant Human FGF-basic	Gibco	PHG0266
Sodium Azide	Sigma	S2002
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151
Troglitazone	Millipore Sigma	T2573
Tween-20	Bioshop	TWN510