JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает метод выделения фибро-адипогенных предшественников (FAP) и миогенных предшественников (MP) из скелетных мышц крыс. Использование крысы в моделях мышечных травм обеспечивает повышенную доступность тканей из атрофических мышц для анализа и более широкий репертуар проверенных методов для оценки мышечной силы и походки у свободно движущихся животных.

Аннотация

Фибро-адипогенные предшественники (FAP) являются резидентными интерстициальными клетками в скелетных мышцах, которые вместе с миогенными предшественниками (MP) играют ключевую роль в гомеостазе мышц, травмах и восстановлении. Современные протоколы идентификации и изоляции FAP используют проточную цитометрию / флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS), а исследования, оценивающие их функцию in vivo, на сегодняшний день были проведены исключительно на мышах. Больший размер, присущий крысе, позволяет проводить более полный анализ FAP в моделях травм скелетных мышц, особенно в сильно атрофированных мышцах или когда исследователям требуется значительная масса тканей для проведения нескольких анализов вниз по течению. Крыса дополнительно предоставляет больший выбор мышечных функциональных анализов, которые не требуют седации или жертвоприношения животных, тем самым сводя к минимуму заболеваемость и использование животными, позволяя проводить серийные оценки. Протоколы проточной цитометрии / FACS, оптимизированные для мышей, являются видоспецифичными, в частности, ограниченными характеристиками коммерчески доступных антител. Они не были оптимизированы для отделения ФАПов от крыс или сильно фиброзных мышц. Был разработан протокол проточной цитометрии /FACS для идентификации и изоляции FAP и MPs как из здоровых, так и из денервированных скелетных мышц крыс, основанный на дифференциальной экспрессии поверхностных маркеров CD31, CD45, Sca-1 и VCAM-1. Поскольку специфические для крыс первичные антитела, подтвержденные проточной цитометрией, сильно ограничены, была выполнена внутренняя конъюгация антитела, нацеленного на Sca-1. С помощью этого протокола была подтверждена успешная конъюгация Sca-1, а проточная цитометрическая идентификация FAP и MP была подтверждена клеточной культурой и иммуноокрашиванием FACS-изолированных FAP и MP. Наконец, мы сообщаем о новом временном курсе FAPs в пролонгированной (14 недель) модели денервации крыс. Этот метод предоставляет исследователям возможность изучать FAP в новой модели животных.

Введение

Фибро-адипогенные клетки-предшественники (FAP) представляют собой популяцию резидентных мультипотентных клеток-предшественников в скелетных мышцах, которые играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации и, наоборот, также опосредуют патологические реакции на повреждение мышц. Как следует из названия, FAP были первоначально идентифицированы как популяция-прародитель с потенциалом дифференцироваться в фибробласты и адипоциты1 и претендовали на то, чтобы быть ключевыми медиаторами фиброзно-жировой инфильтрации скелетных мышц при хронических травмах и заболеваниях. Дальнейшие исследования показали, что ФАП дополнительно способны к остеогенезу и хондрогенезу2,3,4. Таким образом, они более широко обозначены в литературе как мезенхимальные или стромальные прародители3,5,6,7,8. При остром повреждении скелетных мышц ФАП косвенно помогают в регенеративном миогенезе, временно размножаясь, чтобы обеспечить благоприятную среду для активированных мышечных клеток-сателлитов и их последующих миогенных предшественников(МП) 1,9,10. Параллельно с успешной регенерацией ФАП подвергаются апоптозу, возвращая их количество к исходным уровням1,9,10,11. Напротив, при хронической мышечной травме ФАП перекрывают проапоптотические сигналы, что приводит к их стойкости9,10,11 и аномальному восстановлению мышц.

В исследованиях in vivo, оценивающих клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых FAP опосредуют мышечные реакции, использовались мышиные животные модели на сегодняшний день1,7,9,10,11, 12,13,14. В то время как генетически модифицированные мыши являются мощными инструментами для использования в этих анализах, небольшой размер животного ограничивает доступность тканей для изучения в долгосрочных локализованных моделях травм, где атрофия мышц может быть глубокой, такой как травматическая денервация. Кроме того, измерение мышечной силы и физической функции требует измерений ex vivo или in situ, которые требуют прекращения работы мыши, или методов in vivo, которые требуют хирургического вмешательства и/ или общей анестезии для оценки сократительной производительности мышц15,16,17,18,19,20 . У крыс существуют хорошо проверенные и глобально используемые мышечные функциональные анализы, в дополнение к анализу более сложного двигательного поведения, такого как анализ походки (например, индекс седалищной функции, анализ подиума), которые выполняются у бодрствующих и спонтанно движущихся животных21,22,23,24 . Это дополнительно оптимизирует принципы минимальной заболеваемости в экспериментах на животных и количество используемых исследовательских животных. Таким образом, крыса предоставляет исследователю FAPs дополнительную гибкость большего поврежденного мышечного объема для белкового и клеточного анализа и возможность проводить серийные оценки статической и динамической функциональной активности и поведения мышечного комплекса у бдительного животного.

FAP в основном были идентифицированы и выделены из целых мышечных образцов с использованием проточной цитометрии и флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) соответственно. Это лазерные анализы, которые способны идентифицировать несколько специфических клеточных популяций на основе характерных признаков, таких как размер, гранулярность и конкретная комбинация клеточной поверхности или внутриклеточных маркеров25. Это очень выгодно при изучении системы органов, такой как скелетные мышцы, поскольку гомеостаз и регенерация являются сложными, многофакторными процессами, координируемыми множеством типов клеток. Основополагающее исследование идентифицировало FAP, а также MP, используя методы проточной цитометрии в скелетных мышцах мышей1. Они продемонстрировали, что FAP являются мезенхимальными по своей природе, поскольку в них отсутствовали поверхностные антигены, специфичные для клеток эндотелиального (CD31), кроветворного (CD45) или миогенного (Integrin-α7 [ITGA7]) происхождения, но экспрессировали маркер мезенхимальных стволовых клеток Sca-1 (Stem cell antigen 1)1 и дифференцировали в фиброгенные и адипогенные клетки в культуре. Другие исследования продемонстрировали успешную изоляцию мезенхимальных предшественников в мышцах на основе экспрессии альтернативного маркера стволовых клеток, рецептора фактора роста тромбоцитов альфа (PDGFRα)2,7,8, и дальнейший анализпоказал,что они, вероятно, являются той же клеточной популяцией, что и FAPs3. ФАП в настоящее время обычно идентифицируются в проточной цитометрии с использованием Sca-1 или PDGFRα в качестве положительного маркера отбора1,9,10,11, 12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Однако использование PDGFRα является предпочтительным для тканей человека, поскольку прямой человеческий гомолог мышиного Sca-1 еще не идентифицирован32. Кроме того, сообщалось о других белках клеточной поверхности в качестве маркеров МП (например, VCAM-1), обеспечивая потенциальную альтернативу ITGA7 в качестве индикатора клеток миогенной линии во время выделения FAPs33.

Хотя проточная цитометрия/FACS является мощной методологией изучения роли и патогенного потенциала ФАП в скелетных мышцах1,9,10,11, 13,29,она технически ограничена специфичностью и оптимизацией необходимых ей реагентов. Поскольку проточная цитометрическая идентификация и выделение FAP были разработаны и проведены на мышиных животных моделях1,9,10,11,29,это создает проблемы для исследователей, которые хотят изучать FAP в других модельных организмах. Многие факторы, такие как оптимальный размер обрабатываемой ткани, а также специфичность и доступность реагентов и/или антител, различаются в зависимости от используемого вида.

В дополнение к техническим барьерам для изучения ФАП на новой модели животных, они в значительной степени изучались в острых, токсичных условиях - обычно с помощью внутримышечной химической инъекции или кардиотоксина. Оценка долгосрочной динамики ФАП ограничивается главным образом оценкой мышечной дистрофии Дюшенна с использованием mdx мышиноймодели9,10, 11и моделей комбинированной мышечной травмы, такой как массивный разрыв вращательной манжеты, где одновременная трансекция сухожилия и денервация выполняются на мускулатуре плеча26,27,28 . Реакция ФАПов на единственное оскорбление хронической травматической денервацией, распространенной при несчастных случаях на производстве в тяжелой промышленности, сельском хозяйстве и при родовых травмах (травма плечевого сплетения)34,35,36,37 со значительной заболеваемостью, не была так хорошо охарактеризована, часто ограничена краткосрочными временными рамками11,38.

Мы описываем метод выявления и изоляции ФАПов и депутатов от здоровых, а также сильно атрофических и фиброзных скелетных мышц у крыс. Во-первых, продемонстрирована идентификация CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs и CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs с использованием протокола окрашивания тканевой сбраживания и проточной цитометрии, а последующая валидация наших результатов осуществляется с помощью культуры и иммуноцитохимического окрашивания клеток, выделенных FACS. Используя этот метод, мы также сообщаем о новом временном курсе FAPs в долгосрочной изолированной модели травмы денервации у крыс.

протокол

Следователи, проводящие этот протокол, должны получить разрешение от своего местного совета по этике животных / комитета по уходу за ними. Все работы с животными были одобрены Комитетом по уходу за животными больницы Святого Михаила Unity Health Toronto (ACC #918) и проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Канадским советом по уходу за животными (CCAC). Схема протокола проточной цитометрии показана на рисунке 1. Если последующим применением является FACS и последующая клеточная культура, все шаги должны быть выполнены с помощью надлежащей асептической техники.

1. Сбор мышечной массы

  1. Обезболивайте крыс, используя соответствующий анестетик и жертвоприношение в соответствии с местными руководящими принципами совета по этике животных. Этот протокол собирает икроножную мышцу у взрослых самок крыс Льюиса (200-250 г), в качестве примера. Крыс анестезировали с использованием 2-3% изофлурана и приносили в жертву внутрисердечной инъекцией Т61.
  2. После того, как животное было принесено в жертву, побрейте всю заднюю конечность, чтобы облегчить расположение мышцы и свести к минимуму загрязнение меха собранной ткани.
  3. Используя стерильный скальпель, сделайте два разреза на коже: первый по окружности голеностопного сустава и второй вверх по средней линии медиального аспекта задней конечности от лодыжки до бедра.
  4. Очистите кожу и поверхностные мышечные слои, чтобы выявить подлежащую икроножную мышцу, которая берет свое начало в медиальных и боковых мыщелках бедренной кости и вставляется в ахиллово сухожилие.
  5. Используйте тупое рассечение, чтобы отделить икроножную мышцу от окружающих тканей, обрабатывая мышцу только сухожилием, чтобы избежать травмы.
  6. Отделите икроножную мышцу от ее введения, перемежая ахиллово сухожилие как можно более дистально острыми ножницами. После разрезания обхватите ахиллово сухожилие щипцами и аккуратно снимите икроножную мышцу с подстилающей кости. Все еще удерживая мышцу с щипцами в одной руке, найдите два происхождения икроножной мышцы и разрезайте медиальный и боковой мыщелки бедренной кости.
  7. Осторожно промокните иссеченную икроножную мышцу о стерильный кусок марли, чтобы удалить как можно больше крови. Обрежьте мышцу на стерильной поверхности и удалите излишки соединительной ткани, а также ахиллова сухожилия.
  8. Поместите мышцу в весовую лодку и взвешивайте с помощью прецизионных весов. Этот протокол оптимизирован для переваривания мышц с влажным весом в пределах 200-600 мг. При желании операторы могут подразделять избыток собранной ткани на другие последующие анализы.
  9. Осторожно далее разделите собранные мышцы, которые будут использоваться для проточной цитометрии, на 3-4 более мелких кусочка (примерно1-2 см3)и погрузитесь в ледяной 1x PBS. Держите холодным на льду до тех пор, пока все образцы не будут собраны.

2. Мышечное пищеварение

  1. Извлеките мышцу из PBS и поместите в стерильную чашку для культивирования клеток размером 10 см. Аккуратно порвать и измельчить ткань щипцами до тех пор, пока кусочки не составят примерно 3-4мм3,удалив как можно больше соединительной ткани. После тщательного измельчения переводят в стерильную коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 6 мл DMEM + 1% пенициллина/стрептомицина (P/S).
  2. Добавьте 10 мкл 300 мМ раствора CaCl2 к 365 мкл раствора коллагеназы II (концентрация запаса 4800 Ед/мл) для активации фермента коллагеназы. Добавьте активированный раствор коллагеназы II в коническую трубку объемом 50 мл, содержащую тканевую суспензию. Конечная концентрация коллагеназы II составляет 250 Ед/мл.
  3. Инкубируйте трубки в шейкере в течение 1 ч при 37 °C, 240 х г,обязательно вручную закручивая каждые 15 минут, чтобы выбить любую ткань, которая прилипла к боковой части трубки.
  4. Через 1 ч извлекают пробирки из шейкера и добавляют следующее на образец: 100 мкл коллагеназы II (4 800 Ед/мл) и 50 мкл диспазы (4,8 Ед/мл).
  5. Пипетки пробуют с помощью серологической пипетки 15-20 раз, пока раствор не станет однородным. При обработке нескольких образцов используйте отдельную стерильную пипетку для каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения образца.
  6. Снова инкубировать в шейкере в течение 30 мин при 37 °C и 240 х г. Через 15 мин встряхните образцы вручную, чтобы выбить адгезивную ткань со стороны трубки.

3. Генерация одноклеточной суспензии

  1. Медленно срезайте образцы через шприц объемом 10 мл с иглой 20 Г в течение 10 циклов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один цикл включает в себя взятие мышечного раствора в шприц и введение его обратно в трубку. Обеспечьте минимизацию любых пузырьков, медленно завершая стрижку, так как чрезмерное вспенивание может привести к дополнительной гибели клеток39.
  2. Поместите клеточный сетчатый фильтр 40 мкм на стерильную коническую трубку объемом 50 мл и смочите ее, пипеткой 5 мл DMEM + 10% FBS и 1% P / S.
  3. Пипетка 1 мл образца за один раз через клеточный ситечко.
  4. Промывайте клеточный сетчатый фильтр путем пипетки DMEM с 10% FBS и 1% P/S через сетчатый фильтр, чтобы довести общий объем в трубке до 25 мл.
  5. Разделите 25 мл образца поровну на две конические трубки по 15 мл и центрифугу при 15 °C, 400 х г в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расщепление мышечного раствора на две конические трубки объемом 15 мл обеспечивает лучшее восстановление клеток после центрифугирования по сравнению с одной трубкой.
  6. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в буфере лизиса 1 мл 1x RBC (см. Дополнительный файл)при комнатной температуре в течение 7 мин для устранения эритроцитов.
  7. Доведите объем до 10 мл с помощью 9 мл промывочного буфера (см. Дополнительный файл)и отжимных трубок при 400 х г,15 °C в течение 15 мин.
  8. Аспирировать супернатант и рекомбинированные гранулы путем повторной суспендации в буфере промывки 1 мл.
  9. Переложите соответствующий объем клеток в отдельную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и смешайте с красителем трипанового синего цвета. Подсчитывайте живые клетки на световом микроскопе с помощью гемоцитометра.

4. Окрашивание антител для проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Антитело Sca-1 должно быть конъюгировано с APC перед экспериментами по проточной цитометрии/FACS в соответствии с инструкциями производителя. Производительность должна быть проверена для каждой партии сопряжений(рисунок 2). Конечные спряжения могут храниться в аликвотах 20 мкл при -20 °C и стабильны в течение трех недель. Обратитесь к дополнительному файлу для получения полного протокола сопряжения.

  1. Для проточной цитометрии перенесите 1-2 х 106 клеток на экспериментальный образец в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Доведите объем до 1 мл с помощью промывочного буфера и поместите на лед.
  2. Для каждого эксперимента настройте следующие необходимые элементы управления: i) незапятнанные и ii) средства контроля жизнеспособности для точного отбора популяции живых клеток; iii) флуоресцентные минус один (FMO) контроль на одноэлементных суспензиях для установки точных затворов для CD31-/CD45-фракций, FAP и MP; и iv) компенсационные шарики с одним окрашиванием для коррекции флуоресцентного перелива между каналами.
    1. Для всех элементов управления ячейками аликвота 5 х 105 - 1 х 106 ячеек в 1 мл промывочного буфера в трубке микроцентрифуги 1,5 мл и поместите на лед.
    2. Для контроля бусин добавьте 1 каплю шариков с положительной компенсацией (~1,5 x 105 бусин на каплю) в каждую маркированную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Полный набор элементов управления приведен в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперимент проводится впервые, запустите контроль с одним окрашиванием для каждого конъюгированного антитела на одноклеточных суспензиях (в дополнение к неокрашенным, жизнеспособным, одноокрашенным компенсационным шарикам и контролем FMO), чтобы оценить положительную окрашенную популяцию в клетках и подтвердить окрашивание, наблюдаемое на компенсационных шариках. Проверяйте каждую свежесопряженную подготовку Sca-1::APC, выполняя однократное окрашивание компенсационных шариков и одноклеточных суспензий. Полный список элементов управления окрашиванием приведен в таблице 1.
  3. Чтобы подготовить контроль жизнеспособности, перенесите половину объема клеток из «жизнеспособной» трубки в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Назовите эту трубку «Мертвой».
  4. Инкубировать «мертвую» трубку при 65 °C в течение 2-3 мин, чтобы убить клетки, затем поместить на лед. Через 2-3 мин повторно объединяют мертвые клетки с живыми клетками, оставшимися в контрольной трубке жизнеспособности. Эта популяция клеток будет использоваться для установки значений компенсации (при необходимости) и правильной установки ворот для красителя жизнеспособности.
  5. Центрифугировать одноклеточные суспензии (экспериментальные образцы и контрольные) при 500 х г,4 °C в течение 5 мин.
  6. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточные гранулы в буфере промывки 100 мкл.
  7. Добавляют антитела, в зависимости от экспериментального образца или контроля. Обратитесь к матрице окрашивания(таблица 2)для получения информации о комбинациях и количествах антител.
  8. Осторожно проведите пальцем по каждому образцу, чтобы обеспечить полное перемешивание, и инкубируйте на льду в темноте в течение 15 минут. Для компенсации бусины инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин.
  9. Для экспериментальных и контрольных образцов одноклеточной суспензии доведите объем до 1 мл, добавив буфер промывки 900 мкл. Для управления компенсационным шариком доведите объем до 1 мл с 900 мкл 1x PBS.
  10. Центрифуга одноклеточных образцов суспензии при 500 х г,4 °C в течение 5 мин. Центрифужные компенсационные шарики контролируют при 300 х г,4 °C в течение 5 мин.
  11. Для всех образцов одноклеточной суспензии аспирировать и выбрасывать супернатант и повторно суспендировать гранулы клеток в буфере промывки 300 мкл. Для компенсационного контроля шарика аспирируйте и выбросьте супернатант, повторно приостановите гранулу в 300 мкл 1x PBS, затем добавьте 1 каплю (~1,5 x 105)шариков отрицательной компенсации.
  12. Храните все образцы одноэлементной суспензии на льду под алюминиевой фольгой и приступайте к проточному цитометрическому сбору. Компенсационные шариковые элементы управления также должны быть защищены от света, но могут храниться при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспериментальной конечной точкой является идентификация ФАП с помощью проточной цитометрии, выполните действия 5.1.1-5.1.11. Если конечной точкой является изоляция клеток с помощью FACS для культивирования и окрашивания, выполните шаги 5.2.1-5.2.9 и разделы 6-7.

5. Проточная цитометрия и флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS)

  1. Проточная цитометрия
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется настольный проточный цитометр, оснащенный лазерами 405 нм, 488 нм и 640 нм, которые способны одновременно различать 10 различных цветов. Полосовые фильтры и связанные с ними фторхромы, используемые в этом протоколе, следующие: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) и 670/30 (APC). Напряжения для каждого детектора следующие: FSC 700; SSC 475; ФИТК 360; ПЭ 460; ПЭ-Ци7 600; SYTOX Синий 360; БТР 570. Убедитесь, что вы обучены правильной работе проточного цитометра или сортировщика клеток перед использованием.
    1. Убедитесь, что цитометр был включен в течение 10-20 минут перед использованием и был загрунтован последовательной очисткой с чистыми, промывными и оболочкой жидкими растворами в течение 30-45 с каждый. Закончите промывкой с dH2O. Убедитесь, что в контейнер для хранения был добавлен достаточный объем жидкости для хранения для поддержания надлежащего потока проб на протяжении всего сбора.
    2. Настройте стратегию захвата для идентификации ФАПов и депутатов, как показано на рисунке 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FAP и MP идентифицируются следующей иерархической стратегией гатинга: i) SSC-A против FSC-A (область рассеяния боковых ячеек против области рассеяния прямых ячеек для разделения ячеек против мусора), ii) FSC-W против FSC-H (ширина рассеяния прямой ячейки против высоты рассеяния прямой ячейки для различения синглетов от дублетов в параметре FSC), iii) SSC-W против SSC-H (ширина рассеяния боковых ячеек против высоты рассеяния боковых ячеек для различения синглетов от дублетов в параметре SSC), iii) SSC-W против SSC-H (ширина рассеяния боковых ячеек против высоты рассеяния боковых ячеек для различения синглетов от дублетов в параметре SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (для различения живых и мертвых синглетов), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (для исключения клеток CD31+ и CD45+ из дальнейшего анализа) и vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E из CD31-/CD45- (Lineage; Линь-) население (идентификация ФАПов и депутатов). FAP идентифицируются как события CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-, а депутаты - как cd31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Сначала запустите каждый одноокрашенный компенсационный шарик управления через цитометр на низкой скорости, чтобы получить значения компенсации, используемые для коррекции любого флуоресцентного перелива между каналами. Оцените компенсацию, сравнив флуоресцентный сигнал каждого элемента управления в своем собственном детекторе (например, SSC-A против APC для одноокрашенных шариков Sca-1::APC), а также всех других детекторов. В соответствующем детекторе должно быть две различные популяции (одна с отрицательным и одна с положительным сигналом) и только отрицательная популяция во всех других детекторах. Установите для остановочного затвора значение 10 000 событий компенсационных шариков и запишите данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Между получением каждого образца обязательно пропустите dH2O через цитометр в течение 10-20 секунд, чтобы избежать загрязнения образца в образец.
    4. Затем обработайте незапятнанные и жизнеспособные контрольные образцы, чтобы правильно защитить живые одиночные клетки. Установите для остановочного затвора значение 10 000 синглетных событий и запишите данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно за 5 мин до получения каждого образца клеточной суспензии, за исключением неокрашенного образца, добавляют 1 мкл красителя жизнеспособности SYTOX Blue (рабочая концентрация 300 мкМ, разбавленная из 1 мМ запасного раствора) к каждому образцу и осторожно перемешивают (конечная концентрация 1 мкМ).
    5. Затем приобретите оставшиеся контрольные образцы одноклеточной суспензии. Оцените каждый элемент управления FMO с его соответствующим графиком в стратегии гатинга(рисунок 3). Например, оцените сигнал FITC CD31+CD45 FMO для обеспечения точного CD31-/CD45-затвора. Оптимальный пример показан на рисунке 3G. Если протокол выполняется впервые, до приобретения элементов управления FMO следует запустить элементы управления с одним окрашиванием на ячейках.
    6. Оцените флуоресцентный сигнал каждого образца клеток с одним окрашиванием в соответствующем детекторе, а также во всех других детекторах для проверки надлежащей компенсации. Установите стоп-шлюз на 10 000 живых синглетных событий и записывайте в программное обеспечение.
    7. После того, как все элементы управления (одноклеточные суспензии и шарики) были обработаны, подготовьте все экспериментальные образцы, предварительно измерив и записав объем каждого образца. Эти измерения будут использоваться для точной количественной оценки ФАП и депутатов, как описано в шаге 5.1.11. Затем добавьте 50 мкл прецизионных счетных шариков и аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз 2-3 раза.
    8. Кратко запустите первый экспериментальный образец, чтобы подтвердить идентификацию популяции счетных шариков. Эта популяция выглядит как небольшой отдельный кластер, отдельный от общей клеточной популяции на графике FSC-A против SSC-A(рисунок 3A,красная рамка). Создайте ворота вокруг подсчета популяции бусин. Затем получают данные для каждого экспериментального образца путем обработки через цитометр на низкой скорости. Установите для остановочного затвора значение 10 000 событий подсчета бусин и записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут в качестве альтернативы идентифицировать счетные шарики, установив дополнительный график оценки SSC-A по сравнению с любым из детекторов, поскольку счетные шарики флуоресцентны во всех детекторах.
    9. После того, как все образцы были обработаны, очистите цитометр, используя соответствующие протоколы. Экспортируйте все данные для анализа.
    10. Откройте все файлы данных в соответствующем программном обеспечении для анализа проточной цитометрии. Установите стратегию сбора данных, используемую для сбора данных, как описано в шаге 5.1.2. Изучите элементы управления в том же порядке, что и при сборе данных (например, незапятнанные, жизнеспособность, одно пятно, а затем элементы управления FMO), чтобы повторно проверить стратегию захвата. После того, как точные затворы были установлены с помощью элементов управления FMO, примените затворы ко всем экспериментальным образцам. Экспортируйте необработанные данные в виде электронной таблицы для количественной оценки.
    11. Рассчитайте количество ФАПов и депутатов в каждом экспериментальном образце, используя счетные шарики:
      figure-protocol-17934
      где Число приобретенных клеток - это количество зарегистрированных событий соответствующей клеточной популяции (например, FAP или MP) на программном обеспечении приобретения; Приобретенный bead Count - это количество записанных событий подсчета бусин на программном обеспечении для приобретения; Объем счетных бусин - объем раствора для подсчета бусин, добавленный на шаге 5.1.7; Объем образца - объем каждого окрашенного экспериментального образца до добавления счетных шариков; Концентрация бусин - количество шариков на мкл раствора; это значение указано в техническом описании продукта.
  2. FACS - сортировка по клеточной культуре
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол выполняет FACS на сортировщике ячеек, оснащенном 4 лазерами (УФ, Фиолетовый, Синий, Красный), который способен одновременно различать 11-14 цветов. Следуйте протоколу экспериментального окрашивания образцов (раздел 4) и проточной цитометрии, за исключением шагов 1-3, описанных ниже, для оптимизации рабочего процесса FACS:
    1. Увеличьте концентрацию клеток в экспериментальных образцах, которые должны быть отсортированы, до 7х 10 6 клеток / мл для получения надежных выходов FAP и MP.
    2. Чтобы объяснить это значительное увеличение концентрации клеток, удвойте все концентрации антител в экспериментальных образцах, подлежащих сортировке.
    3. Обработайте окончательные окрашенные образцы клеток через крышку сетчатого фильтра 40 мкМ, прикрепленную к полистирольной трубке объемом 5 мл непосредственно перед сортировкой, чтобы уменьшить слипание клеток и увеличить выход сортировки.
    4. Собирайте одиночные, живые крысиные ФАПы и МП непосредственно из клеточного сортировщика в 5 мл полипропиленовой сборной трубки, содержащей 1 мл стерильной, 100% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Держите ячейки на льду до завершения сортировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении СУИМ за пределами площадки переложить все отсортированные ячейки на лед и в защищенный, крытый контейнер.
    5. Работая в стерильном шкафу биобезопасности (BSC), доведите объем отсортированных клеток до 7 мл с соответствующими питательными средами (например, средой роста FAP (FAP GM) для отсортированных FAP и средой роста MP (MP GM) для отсортированных МП; см. Дополнительный файл для рецептов) и центрифугой при 500 x g, 4 ° C в течение 7 минут, чтобы удалить как можно больше остаточного буфера промывки.
    6. Повторно суспендировать гранулы в 1 мл соответствующей питательной среды и пластины в 12-луночную пластину, содержащую стерильную стеклянную крышку/лунку с коллагеновым покрытием 12 мм для последующего иммуноокрашивания (см. раздел 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При иммуноцитохимическом окрашивании коллагена пластинчатые клетки сортируются в 12-луночную пластину, содержащую стерильную стеклянную крышку/лунку с ламининовой оболочкой 12 мм вместо коллагенового покрытия. Если требуются иммуноцитохимические эксперименты с немедленно выделенными предшественниками, засевают ФАП и МП плотностью 15 000 клеток насм2 и переходят непосредственно к шагу 6.1. Для того, чтобы долгосрочные культуры индуцировали дифференцировку предшественника, семенные FAP при плотности 5000 клеток насм2,а MPs при плотности 7 500 клеток насм2.
    7. Инкубировать клетки при 37 °C и 5% CO2 в инкубаторе клеточной культуры. После 72 ч в культуре меняют половину СМИ. Меняйте носитель полностью каждые 2-4 d после.
    8. Чтобы вызвать развитие миоцитов, переключите культуры депутатов на среду дифференциации МП (МД) на 9-й день культуры. Чтобы индуцировать адипоциты, переключите культуры FAP на среду адипогенной дифференцировки FAP (AD) на 10-й день культуры.
    9. Чтобы индуцировать фиброгенез, ФАП могут быть переведены на фиброгенную дифференцированную (FD) среду в переменное время во время культивирования или, альтернативно, могут быть посеяны непосредственно в среду FD после изоляции (этап 5.2.6) (см. Дополнительный файл для всех рецептов носителей).

6. Иммуноцитохимия культивируемых ФАПов и депутатов

  1. Для проверки сортировки клеток и демонстрации чистоты культур FAP и MPs, иммуноокрашивание специфическими маркерами клеточного типа, включая PDGFRα (маркер FAPs), Pax-7 (маркер клеток мышечного ствола [спутника]), фибробласт-специфический белок (FSP-1, маркер фибробластов), перилипин-1 (Plin-1, маркер адипоцитов), коллаген типа 1 (Col1a1, индикатор фиброза), тяжелая цепь миозина (MHC, зрелый маркер миоцитов).
    1. Для иммуноокрашения свежеотсортированных клеток центрифугируют 12-луночную пластину при 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы облегчить прилипание клеток к крышке/лунке. Этот шаг не является необходимым для долгосрочных культур. Удалите носитель языка и региональных параметров.
    2. Для иммуноокрашения ФСП-1 фиксируют клетки 1 мл 100% метанола (MeOH) в течение 2 мин при 4 °C. При иммуноокрашивании PDGFRα, Plin-1, Pax7 или Col1a1 фиксируют клеточные культуры с 1 мл 4% PFA в 1x PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Иммуноокрашающий MHC хорошо переносит либо фиксаторы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток, фиксированных метанолом, пропустите этап 6.2 и перейдите к этапу 6.3.
  2. Аспирировать 4% PFA и быстро промыть клеточные культуры 3-4 раза с 1x PBS. Добавьте 1 мл 100 мМ глицина в 1x PBS и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре для инактивации остаточной PFA. Аспирировать и промыть 1-2 раза 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно оставить на этом этапе в 2 мл 1x PBS, обернуть в пищевую пленку и хранить при 4 °C в течение 7-10 дней максимум.
  3. После промывки добавляют 1 мл 0,1% Тритона-Х в 1x PBS и инкубируют в течение 20 мин для пронизывания клеточных мембран.
  4. Промывайте лунки 2-3 раза с 1-2 мл 1x PBS, затем блокируют ячейки с 1 мл 1x PBS + 3% BSA на скважину в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Пипетку 80 мкл первичного антитела разводят в 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 аккуратно, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 мкг/мл) на кусок парапленки, приклеенный к подвижному контейнеру. Используя стерильные тонкие щипцы, осторожно вытащите крышку из лунки и переверните каплю раствора антител. Инкубируйте крышку с двумя влажными кусочками бумажного полотенца и накройте контейнер пластиковой пленкой, чтобы избежать испарения раствора антител. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание покровных пластинок из скважины использует меньше антител (~80 мкл), чем окрашивание внутри скважины (минимум 500 мкл).
  6. На 2-й день оставьте покровные листы комнатной температуры на 30 мин, чтобы согреть. Используя щипцы осторожно вправо и перенесите крышки обратно в соответствующие колодцы (клетки, обращенные вверх) и промыть 2-3 раза 1-2 мл 1x PBS в течение 2 минут каждый, чтобы удалить как можно больше первичных антител.
  7. Используя ту же технику окрашивания, что и при первичном окрашивании антителом, окрашивают клетки вторичным антителом против кролика козы Alexa Fluor 488 (1:400) для обнаружения FSP-1, Plin-1, Col1a1 или PDGFRα и вторичным антителом Alexa Fluor 555 против козы (1:300) для обнаружения MHC или Pax-7. Инкубируйте клетки в течение 1 ч при комнатной температуре и держите клетки защищенными от света.
  8. Вернуть клетки в лунку и инкубировать клетки с Hoechst (1:10 000) в течение 2-4 мин при комнатной температуре. Промыть клетки еще 2-3 раза с 1x PBS в течение 2 мин каждая, чтобы удалить лишнее Hoechst.
  9. Установите крышки на стеклянные слайды с помощью флуоресцентной монтажной среды против выцветания и оставьте слайды сушиться на ночь в темноте при комнатной температуре. Храните установленные крышки при температуре 4 °C в темноте.

7. Окрашивание маслом Red O (ORO) культивируемых ФАПов и депутатов

  1. Выполняют окрашивание ORO на непроницаемых клетках, так как пермеабилизация клеточной мембраны может привести к неспецифическому/нежелательному окрашиванию неадипогенных типов клеток. Перед началом окрашивания подготовьте рабочий материал ORO (рецепт см. в дополнительном файле) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.
  2. Через 20 мин отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм, чтобы удалить любые нерастворенные агрегаты.
  3. Аспирировать среду из скважины и добавить 1 мл 10% нейтрального буферизованного формалина (10% NBF). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние клеток может привести к подъему из колодца/крышки. Будьте осторожны при аспирации/добавлении решений.
  4. Аспирировать и добавлять 1 мл свежего 10% НБФ и инкубировать в течение не менее 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен в этот момент, так как ячейки могут быть оставлены в 10% NBF на ночь.
  5. Быстро промыть скважины один раз 1 мл 60% изопропанола, затем аспирировать и дать скважинам полностью высохнуть (примерно 2 мин).
  6. Добавьте 400 мкл рабочего материала Oil Red O на скважину и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре, избегая пипетки любого ORO на стенках пластины.
  7. Удалите все масло Red O и быстро промыть лунку 4 раза с dH2O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашенные колодцы содержат крышки, монтируют с использованием того же метода, который описан на этапе 6.9.
  8. Изображение либо смонтировано на крышках, либо окрашено хорошо с помощью ярко-полевого микроскопа.

8. Окрашивание тканей контралатерального и денервированного икроножных отделов крыс

  1. Пикрозириус Красный (PSR)
    1. Выполните окрашивание PSR на 5 мкм толщиной, формалин-фиксированный парафин (FFPE) икроножных гистологических срезов крыс, как описаноранее 40.
  2. Масло Красное O (ORO)
    1. Зафиксируйте гистологические срезы икроножной железы 5 мкм толщиной 5 мкм в 4% PFA в течение 10 мин, инкубируйте в 60% изопропиловом спирте в течение 1 мин.
    2. Окрашивание с рабочим материалом ORO в течение 12 мин. Инкубировать в 60% изопропиловом спирте в течение 1 мин, промывать в течение 10 мин в dH2O.Монтировать на крышки с помощью водорастворимой монтажной среды.
  3. Sca-1 и флуоресцентная иммуногистохимия ткани ламинина (IHC)
    1. Выполняют флуоресцентный IHC на гистологических срезах икроножной железы икроножных желез толщиной 5 мкм.
    2. Образцы гидратов в 1x PBS в течение 5 мин, фиксируют в 4% PFA в течение 10 мин, а затем инкубируют образцы в тканевом растворе, блокирующем ПЧ (см. Дополнительный файл)в течение 90 мин.
    3. Инкубировать с первичным антителом против Sca-1 (1:500), разведенным в 1x PBS + 0,05% Tween при 4 °C в течение ночи.
    4. На 2-й день промыть три раза в 1x PBS + 0,05% Tween в течение 5 мин каждый, затем инкубировать в козьем анти-кролике Alexa Fluor 555 (1:500) в течение 1 ч.
    5. Снова промыть (как и раньше), инкубировать блокирующим раствором в течение 1 ч, затем добавить антиламининовое первичное антитело (1:500), разведенное в 1x PBS + 0,05% Tween в течение 1 ч.
    6. Снова промыть (как и раньше), затем инкубировать в козьем анти-кролике Alexa Fluor 488 (1:500) в течение 1 ч (для ламинина).
    7. Снова промыть (как и раньше), затем инкубировать в DAPI (1:10 000) в течение 4 мин. Мойте и монтируйте на крышки с помощью анти-выцветающей монтажной среды.

Результаты

Идентификация FAP и MP с помощью проточной цитометрии с использованием новой панели антител, включая Sca-1 и VCAM-1
Стратегия определения ФАПов в мышцах крыс основана на протоколах проточной цитометрии у мыши29,которая распространяется на CD31...

Обсуждение

Оптимизированный, проверенный протокол изоляции FAPs для мышц крыс имеет важное значение для исследователей, которые хотят изучить модели травм, которые неосуществимы у мыши по биологическим или техническим причинам. Например, мыши не являются оптимальной животной моделью для изучения...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов для раскрытия.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Основные объекты проточной цитометрии в Университете Оттавы и Исследовательский центр биомедицинских наук Кинана (KRC), больницу Сент-Майклс Юнити Хелс Торонто за их опыт и руководство по оптимизации протокола проточной цитометрии / FACS, представленного в этой рукописи. Эта работа была профинансирована Фондом «Медицина от дизайна новых идей 2018» (MbDNI-2018-01) для JB.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Also known as 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 grams used
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Also known as VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAlso known as MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 also known as S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Also known as Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510

Ссылки

  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819 (2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684 (2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543 (2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375 (2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены