Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы

Резюме

Здесь мы описываем протокол обнаружения и локализации белка и РНК эмбриона дрозофилы от сбора до предварительного встраивания и встраивания, иммуноокрашивания и гибридизации мРНК in situ .

Аннотация

Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах. Каждая клеточная активность от пролиферации и апоптоза клеток, развития и старения до нейрональной синаптической пластичности и регенерации была связана с рецепторами рианодина (RyRs). Несмотря на важность передачи сигналов кальция, точный механизм его функции в раннем развитии неясен. Как организм с коротким гестационным периодом, эмбрионы Drosophila melanogaster являются основными объектами исследования для изучения распределения и локализации CICR-ассоциированных белков и их регуляторов в процессе развития. Однако из-за их богатых липидами эмбрионов и богатых хитином хорионов их полезность ограничена сложностью установки эмбрионов на стеклянные поверхности. В этой работе мы представляем практический протокол, который значительно улучшает прикрепление эмбриона дрозофилы к слайдам и детализирует методы для успешной гистохимии, иммуногистохимии и гибридизации in-situ . Метод скользящего покрытия хром-квасцового желатина и метод предварительного встраивания эмбрионов резко увеличивают выход при изучении белка эмбриона дрозофилы и экспрессии РНК. Чтобы продемонстрировать этот подход, мы изучили DmFKBP12/Calstabin, известный регулятор RyR во время раннего эмбрионального развития Drosophila melanogaster. Мы идентифицировали DmFKBP12 еще на стадии синцитиальной бластодермы и сообщили о динамическом паттерне экспрессии DmFKBP12 во время разработки: первоначально как равномерно распределенный белок в синцитиальной бластодерме, затем предварительно локализующийся в цокольном слое коры во время клеточной бластодермы, прежде чем распространяться в примитивной нейрональной архитектуре и архитектуре пищеварения во время фазы трехместного слоя в ранней гаструляции. Это распределение может объяснить решающую роль, которую RyR играет в жизненно важных системах органов, которые происходят из этих слоев: субэзофагеальный и надпищеводный ганглий, вентральная нервная система и опорно-двигательный аппарат.

Введение

Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах, таких как скелетная/гладкая мускулатура и сердечная сосудистая функция, пролиферация и апоптоз клеток, развитие, старение, нейрональная синаптическая пластичность и регенерация1,2,3,4,5,6 . Рянодиновые рецепторы (RyRs) и инозитол-1,4,5-трисфосфатные рецепторы (IP3Rs) являются основными игроками в сигнальном пути кальция, контролируемом их регулято....

протокол

1. Приготовление тарелок с агаром виноградного сока

1. Добавьте 5 г агара и 5 г сахарозы в 150 мл дистиллированной воды. Кипятите его с помощью микроволновой печи до полного растворения агара и сахарозы. Смешайте 50 мл 100% виноградного сока и раствора вместе.
2. Добавьте 1 мл 100% пропионовой кислоты, чтобы получить конечную концентрацию до 0,5% пропионовой кислоты. В каждую тарелку налейте по 25 мл приготовленного раствора. После того, как агар затвердеет, храните носитель при температуре 4 °C.

2. Покрытие слайдов

1. Предварительно обработать горки моющим средством. Промойте гор....

Результаты

Рисунки описывают протоколы, используемые для преодоления проблемы прикрепления эмбрионов дрозофилы с высоким содержанием липидов и хитинсодержащих хорионов (таблица 1) к поверхности стеклянной горки для исследования и экспериментов. Используя метод покрытия слайдов и.......

Обсуждение

Опосредованная кальциевыми сигналами RyRs и IP3R является фундаментальным путем во многих физиологических и патологических процессах как позвоночных^, так и беспозвоночных животных1,2,3,4. У людей точечные мутации, такие ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
-20°C Refrigerator	Meiling Biology &Medical	DW-YL270	Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator	Thermo	Forma 90 Series	Used for regent storage
Agar	Sigma-Aldrich	WXBB6360V	Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Roche	11093274910	For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator	Shanghai Bluepard Instruments	LRH-250	In-situ Hybridization
Bouin's solution	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69945460	Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge	Eppendorf	540BH07808	In-situ Hybridization
Centrifuge tube	Denville	C-2170	Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10001018	Coating Slides
Constant temperature water bath	Jintan Henfeng Instruments	KW-1000DC	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System	Dako	K5007	In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit	Roche	11093274910	RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster	Bloomington Stock Center	BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664	The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven	Tianjin Taiste Instruments	101-0AB	For coating slides and paraffin embedding
Eosin	Sigma-Aldrich	230251	Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	100092680	Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10010328	Coating Slides
Gold chloride	Sigma-Aldrich	379948	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136	Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit	Roche	11732668001	For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box	Ningbo Jiangnan Instruments	HWS	For fly maintenance
LE Agarose	HyAgarose	14190108029	Pre-embedding
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10014108	Drosophila Embryo Collection
Microscope	ZEISS	Observer.A1	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides	MeVid Labware Manufacturing	P105-2001	Coating Slides
Neutral Gum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10004160	Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	40026768	Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer	Huahai science instrument	HH-2508III	In-situ Hybridization
Paraffin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69019461	Paraffin Embedding
pH/mV Meter	Sartorius	PB-10	For determing the pH value of a solution
Silver nitrate	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10018461	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter	Thermo	AFXI-0501-P	In-situ Hybridization
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10023418	Paraffin Embedding