Поведенческая оценка зрительной функции с помощью оптомоторного ответа и когнитивной функции через Y-лабиринт у крыс с диабетом

Резюме

Нейронная дегенерация в обоих глазах и головном мозге в результате диабета может наблюдаться с помощью поведенческих тестов, проводимых на грызунах. Y-лабиринт, мера пространственного познания, и оптомоторный ответ, мера зрительной функции, дают представление о потенциальных диагнозах и методах лечения.

Аннотация

Оптомоторная реакция и Y-лабиринт являются поведенческими тестами, полезными для оценки зрительной и когнитивной функции соответственно. Оптомоторный ответ является ценным инструментом для отслеживания изменений порогов пространственной частоты (SF) и контрастной чувствительности (CS) с течением времени в ряде моделей заболеваний сетчатки, включая диабетическую ретинопатию. Аналогичным образом, Y-лабиринт может быть использован для мониторинга пространственного познания (измеряемого спонтанным чередованием) и исследовательского поведения (измеряемого рядом записей) в ряде моделей заболеваний, которые влияют на центральную нервную систему. Преимущества оптомоторного ответа и Y-лабиринта включают чувствительность, скорость тестирования, использование врожденных реакций (обучение не требуется) и возможность выполнять на бодрствующих (не обезболенных) животных. Здесь описаны протоколы как для оптомоторного ответа, так и для Y-лабиринта, а примеры их использования показаны в моделях диабета I и II типа. Методы включают подготовку грызунов и оборудования, производительность оптомоторного ответа и Y-лабиринта, а также анализ данных после тестирования.

Введение

Более 463 миллионов человек живут с диабетом, что делает его одной из крупнейших глобальных эпидемий ^{заболеваний1}. Одним из серьезных осложнений, возникающих при диабете, является диабетическая ретинопатия (ДР), ведущая причина слепоты у взрослых американцев трудоспособного ^{возраста2}. В ближайшие 30 лет процент населения, подверженного риску ДР, по прогнозам, удвоится, поэтому крайне важно найти новые способы диагностики ДР на более ранних стадиях для предотвращения и смягчения развития ^ДР3. Dr традиционно считается сосудистым заболеванием4,5,6. Однако теперь, с признаками нейрональной дисфункции и апоптоза в сетчатке, который предшествует сосудистой патологии, DR определяется как имеющий нейронные и сосудистые компоненты4,5,6,7,8,9. Одним из способов диагностики ДР может быть изучение нервных аномалий в сетчатке, ткани, которая может быть более уязвимой к окислительному стрессу и метаболическому напряжению от диабета, чем другая нервная ^ткань10.

Снижение когнитивной и двигательной функции также происходит при диабете и часто коррелирует с изменениями сетчатки. Пожилые люди с диабетом II типа показывают худшие базовые когнитивные функции и показывают более усугубленное снижение когнитивных функций, чем контрольные ^{участники11}. Кроме того, сетчатка была установлена как расширение центральной нервной системы и патологии могут проявляться в ^{сетчатке12}. Клинически связь между сетчаткой и мозгом была изучена в контексте болезни Альцгеймера и других заболеваний, но обычно не исследуется при диабете12,13,14,15,16. Изменения в мозге и сетчатке во время прогрессирования диабета могут быть изучены с использованием животных моделей, включая крысу STZ (модель диабета типа I, в которой токсин, стрептозотоцин или STZ, используется для повреждения бета-клеток поджелудочной железы) и крысу Гото-Какидзаки (полигенная модель диабета типа II, при которой у животных спонтанно развивается гипергликемия примерно в возрасте около 3 недель). В этом протоколе приводится описание Y-лабиринта и оптомоторного ответа для оценки когнитивных и визуальных изменений у диабетических грызунов соответственно. Оптомоторная реакция (OMR) оценивает пространственную частоту (аналогичную остроте зрения) и контрастную чувствительность путем мониторинга характерных рефлексивных движений головы для измерения зрительных порогов для каждого ^глаза17. Пространственная частота относится к толщине или тонкости полос, а контрастная чувствительность относится к тому, насколько контрастен между полосами и фоном (рисунок 1E). Между тем, Y-лабиринт проверяет кратковременную пространственную память и исследовательскую функцию, наблюдаемую через спонтанные чередования и входы через рукава лабиринта.

Оба теста могут быть выполнены на бодрствующих, не обезболенных животных и имеют преимущество в том, что они извлекают выгоду из врожденных реакций животных, что означает, что они не требуют обучения. Оба являются относительно чувствительными, поскольку их можно использовать для выявления дефицита на ранней стадии прогрессирования диабета у грызунов, и надежными, поскольку они дают результаты, которые коррелируют с другими визуальными, сетчаточными или поведенческими тестами. Кроме того, использование OMR и Y-лабиринта в сочетании с такими тестами, как электроретинограмма и оптическая когерентная томография, может предоставить информацию о том, когда изменения сетчатки, структурные и когнитивные изменения развиваются относительно друг друга в моделях заболеваний. Эти исследования могут быть полезны для выявления нейронных дегенераций, которые возникают из-за диабета. В конечном счете, это может привести к новым диагностическим методам, которые эффективно идентифицируют ДР на ранних стадиях прогрессирования.

Системы OMR и Y-лабиринта, используемые для разработки этого протокола, описаны в Таблице материалов. Предыдущие исследования OMR, Prusky et ^al.18, и Y-лабиринта, Maurice et ^al.19, были использованы в качестве отправной точки для разработки этого протокола.

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по институциональным делам ветеранов Атланты по уходу за животными и их использованию и соответствовали руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Publications, ^8th edition, обновлено в 2011 году).

1. Оптомоторный отклик (OMR)

1. Настройка аппарата OMR (подробная информация об аппарате и программном обеспечении приведена в Таблице материалов)
   1. Выберите подходящую по размеру платформу для грызуна: мыши, крысы или крупной крысы с ограниченными возможностями (рисунок 1А).
   2. Откройте программное обеспечение OMR, которое должно открыть окно с несколькими вкладками опций и живой видеопотоком внутри OMR/виртуального барабана (рисунок 1B). Увеличивайте или уменьшайте масштаб с помощью видеокамеры по мере необходимости, чтобы платформа и ее окружение были видны.
   3. Обратите внимание на значки вдоль левой стороны живого изображения (рисунок 1C). Нажмите на значок звездочки и значок вращающихся полос, чтобы зеленая звездочка и зеленая вращающиеся полосы исчезли из живой ленты.
   4. Нажмите на значок компаса , чтобы появился зеленый круг и две перпендикулярные линии. Растяните зеленый круг так, чтобы он идеально совпадал с черным кругом на платформе, что обеспечит идеальное выравнивание OMR.
   5. Нажмите на значок компаса , потому что нет необходимости видеть круг во время тестирования. Нажмите на зеленый значок звездочки и зеленый значок вращающихся полос , чтобы они снова появились. Обратите внимание, что зеленые полосы вращаются в том же направлении, что и полосы в барабане, что позволяет исследователю знать направление полос.
   6. Перейдите на вкладку Тестирование . В разделе Тестирование перейдите на вкладку Психофизика . В разделе Пороговое значение выберите Частота для измерения пространственной частоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение OMR использует парадигму лестницы для автоматического расчета пространственной частоты (SF). Контрастность будет поддерживаться на уровне 100%.
   7. В разделе Тестирование перейдите на вкладку Пресеты . Выберите настройки по умолчанию для ^Mouse18 или ^Rat20.
   8. В разделе Тестирование перейдите на вкладку Пустота . Установите флажок Blank on Tracking ,который приостанавливает полосы/очищает экраны компьютера в барабане всякий раз, когда мышь щелкает правой кнопкой мыши.
   9. Нажмите на вкладку Результаты , где будут отображаться результаты теста.
2. Оценка пространственной частоты
   1. Поместите грызуна на круглую платформу в центре камеры виртуальной реальности, состоящую из четырех компьютерных мониторов, показывающих вертикальные синусоидальные решетки, вращающиеся вокруг камеры со скоростью 12 ° / с (рисунок 1D).
   2. Обратите внимание, что видеокамера, расположенная в верхней части камеры, проецирует поведение грызуна в прямом эфире на монитор компьютера.
   3. Следите за наличием или отсутствием рефлексивных действий головы грызуна, когда решетки движутся по часовой стрелке или против часовой стрелки. Убедитесь, что в программе видны иллюстрированные полосы — они покажут направление движения решетки.
      1. Следите за тем, чтобы голова грызуна двигалась в том же направлении, что и решетки. Подождите, пока не произойдет плавное преследование, а не беспорядочные всплески движения головы, чтобы считать это отслеживанием.
      2. Нажмите «Да » или « Нет » в зависимости от обстоятельств. Обратите внимание, что SF будет начинаться с 0,042 cyc / deg и настраиваться с каждым «да» и «нет», чтобы стать проще или сложнее (рисунок 1E). Нажмите « Сброс», если тест необходимо сбросить из-за случайного или неправильного нажатия «да» и «нет».
   4. Когда грызун тестируется, убедитесь, что звездочка расположена над головой грызуна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет два эффекта: 1) Он поддерживает правильную пространственную частоту. Например, если звездочка расположена между плечами, пространственная частота будет ниже, и полосы будут легче видеть, что приведет к ложно высокому баллу. 2) Для грызунов с легкими движениями головы звездочка облегчает оценку того, действительно ли голова движется.
   5. Следите за тем, чтобы система сказала «Готово», когда пространственная частота грызуна достигнута. Обратите внимание, что кнопки «Да » и « Нет » больше не будут кликабельными.
   6. Нажмите на вкладку «Результаты », которая отобразит пространственную частоту для левого глаза, правого глаза и комбинированных глаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда программное обеспечение устанавливается таким образом, что результаты переворачиваются, т.е. правый глаз сообщается как левый глаз, а левый глаз сообщается как правый глаз. Это было обнаружено при оценке грызунов, у которых был только один глаз, пораженный в модели глаукомы.
3. Оценка контрастной чувствительности
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование контрастной чувствительности может быть выполнено сразу после этапа пространственного измерения частоты или самостоятельно в тот же день или в другой день, если грызун кажется усталым после тестирования пространственной частоты (следуйте шагам 1–2.2, если только тестирование контрастной чувствительности).
   1. Перейдите на вкладку Тестирование , а затем на вкладку Психофизика . В разделе Пороговое значение выберите Контрастность (одиночная), чтобы измерить контрастную чувствительность.
   2. Также используя парадигму лестницы, начинайте решетки с константой SF на пике кривой контрастной чувствительности (CS). Для этого нажмите на вкладку Стимул , а затем на вкладку Решетки . В поле Пространственная частота введите 0,064 для крыс и 0,103 для мышей.
   3. Начните контраст со 100% и ищите те же рефлекторные движения головы, которые наблюдаются во время пространственного частотного тестирования. Обратите внимание, что контраст будет уменьшаться по мере прохождения тестирования, пока грызун больше не перестанет иметь рефлекторные движения головы в ответ на стимул (рисунок 1E).
   4. Следите за тем, чтобы система говорила «Готово», а кнопки « Да » и « Нет » больше не были кликабельными, как только грызун больше не реагирует на визуальный стимул и порог контрастной чувствительности был достигнут. Перейдите на вкладку Результаты , где будет указана контрастная чувствительность для левого, правого глаза и комбинированных глаз.
4. Выполнение анализа после тестирования
   1. Для исследований диабетической ретинопатии, где оба глаза, как ожидается, будут иметь одинаковый дефицит, используйте комбинированный балл (среднее значение правого и левого глаз) для анализа. Для моделей, которые вызывают дифференциальное повреждение глаз (например, бластную травму или глаукому), храните данные левого и правого глаза отдельно.
   2. Для параметра «Пространственная частота» используйте необработанные оценки (данные из вкладки «Результаты ») для анализа и усредните эти баллы вместе по группам (например, диабетические, контрольные и т. Д.).
   3. Для параметра «Контрастная чувствительность» используйте необработанное значение для расчета контрастной чувствительности по контрасту Майкельсона по сравнению с предыдущим измерением яркости экрана.

2. Y-лабиринт

1. Подготовка грызунов к тестированию
   1. Приспособите грызунов к комнате за 30 минут до тестирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь может оставаться в комнате с включенным светом, но должен молчать в течение этого времени.
   2. Очистите Y-образный лабиринт безопасным для животных дезинфицирующим раствором и протрите весь дезинфицирующий раствор бумажными полотенцами. Убедитесь, что лабиринт сухой.
2. Проведение Y-лабиринта
   1. Обозначьте начальное плечо Y-лабиринта как B, а остальные 2 плеча как A и C (рисунок 2A). Поместите одного грызуна в руку, ближайшую к исследователю (рука B), недалеко от центра Y-лабиринта. После того, как грызун был помещен, запустите таймер (подробности о лабиринте и таймере в таблице материалов).
      1. Позвольте каждому грызуну исследовать Y-лабиринт в течение 8 минут. Делайте записи в течение этого времени и отмечайте любые наблюдения. Сядьте в нескольких футах от лабиринта, держа его в поле зрения, и избегайте шума.
      2. Запишите исходное местоположение как A, и каждый раз, когда грызун делает вход в новую руку, записывайте новое местоположение грызуна (рисунок 2B). Определите запись как все четыре конечности грызуна, находящиеся в одной из рук.
      3. Следите за тем, чтобы грызуны прятались и оставались неподвижными в одном рукаве лабиринта. Если грызун остается в одном и том же месте более 60 с и, по-видимому, не проявляет исследовательского поведения, переместите грызуна к центру Y-лабиринта и продолжайте испытание.
   2. После каждого грызуна удалите все каловые массы и очистите лабиринт дезинфицирующим раствором.
      1. Убедитесь, что весь дезинфицирующий раствор протерт бумажными полотенцами, а лабиринт полностью высохнет, прежде чем помещать следующего грызуна в лабиринт.
3. Рассчитайте спонтанное чередование и исследовательское поведение
   1. Рассчитайте исследовательское поведение как общее количество записей, сделанных в течение 8 минут.
   2. Рассчитайте пространственное познание, измеренное спонтанным чередованием:
      количество успешных чередований/(общее количество записей - 2)
      1. Определите успешное чередование, когда грызун перемещается в три разных места последовательно (пример: ABC, CAB, BCA и т. Д.). Обратите внимание на каждое успешное чередование (рисунок 2B).
      2. Если движения были записаны как ACABCABABCABC, не обращайте внимания на два начальных начальных места при вычислении спонтанного чередования (так, что в знаменателе 11 движений). Подсчитайте количество точных движений (точных движений = 8). Рассчитайте процент точности как: 8/(13 - 2) = 72,7%.

Результаты

OMR считается успешным, если пространственные пороги частоты и контрастной чувствительности могут быть получены от грызуна. Здесь использование OMR для оценки пространственной частоты проиллюстрировано наивными контрольными крысами Brown-Norway и Long-Evans, как молодыми (3-6 месяцев), так и пожилы...

Обсуждение

OMR и Y-лабиринт позволяют проводить неинвазивную оценку зрительной функции и дефицита когнитивных функций у грызунов с течением времени. В этом протоколе было продемонстрировано, что OMR и Y-лабиринт отслеживают визуальный и когнитивный дефицит у моделей диабета грызунов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		OMR apparatus & software
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze apparatus	San Diego Instruments	7001-043	Available specifically for rats