Процедуры трансплантации костного мозга у мышей для изучения клонального кроветворения

Резюме

Описаны три метода трансплантации костного мозга (ТКМ): ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с экранированной облучающей и метод ТКМ без предварительного кондиционирования (адютивная ТКМ) для изучения клонального кроветворения на мышиных моделях.

Аннотация

Клональный кроветворение является распространенным возрастным состоянием, которое является результатом накопления соматических мутаций в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках (HSPC). Мутации в генах-драйверах, которые придают клеточную пригодность, могут привести к развитию расширяющихся клонов HSPC, которые все чаще приводят к появлению лейкоцитов потомства, скрывающих соматическую мутацию. Поскольку клональное кроветворение было связано с сердечными заболеваниями, инсультом и смертностью, разработка экспериментальных систем, моделируемых эти процессы, является ключом к пониманию механизмов, лежащих в основе этого нового фактора риска. Процедуры трансплантации костного мозга, включающие миелоаблативное кондиционирование у мышей, такие как облучение всего тела (ЧМТ), обычно используются для изучения роли иммунных клеток в сердечно-сосудистых заболеваниях. Тем не менее, одновременное повреждение ниши костного мозга и других интересных мест, таких как сердце и мозг, неизбежно при этих процедурах. Таким образом, наша лаборатория разработала два альтернативных метода, чтобы свести к минимуму или избежать возможных побочных эффектов, вызванных ЧМТ: 1) трансплантация костного мозга с экранированием облучения и 2) приемная ТКМ неусловным мышам. В экранированных органах сохраняется местная среда, позволяющая проводить анализ клонального кроветворения, в то время как функция резидентных иммунных клеток невозмутима. Напротив, приемная ТКМ для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, за которое сохраняются как местные среды органов, так и кроветворная ниша. Здесь мы сравним три различных подхода к восстановлению кроветворных клеток и обсудим их сильные и слабые стороны для исследований клонального кроветворения при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Введение

Клональное кроветворение (CH) - это состояние, которое часто наблюдается у пожилых людей и возникает в результате расширенного клона гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC), несущего генетическую мутацию^1. Было высказано предположение, что к 50 годам большинство людей приобретут в среднем пять экзонических мутаций в каждом HSPC^2,но большинство из этих мутаций приведут к небольшим фенотипическим последствиям для человека или вообще не приведут к ним. Однако, если случайно одна из этих мутаций дает конкурентное преимущество HSPC, например, способствуя его распространению, самообновлению, выживанию или некот....

протокол

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Вирджинии.

1. Перед предварительным кондиционированием

1. Поместите мышей-реципиентов на воду, дополненную антибиотиками (5 мМ сульфаметоксазола, 0,86 мМ триметоприма) ~ 24 ч до облучения. Это необходимо для предотвращения инфекции, так как иммунная система будет подавлена после облучения и поддерживаться в течение 2 недель после облучения. На этом этапе дополняйте мышей питательным / гидратационным гелем, чтобы стимулировать кормление и предотвратить потерю веса и обезвоживание после облучен....

Результаты

Чтобы сравнить влияние трех методов ТКМ/предварительного кондиционирования на приживение донорских клеток, фракции донорских клеток в периферической крови и сердечной ткани были проанализированы методом проточной цитометрии через 1 месяц после ТКМ. Изолированные клетки окрашивали ?.......

Обсуждение

Для исследований клонального кроветворения мы описали три метода ТКМ: ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с облучением с частичным экранированием и менее часто используемый метод ТКМ, который не включает предварительное кондиционирование (адмтивное ТКМ). Эти методы были использованы для .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5ml microcentrifuge	Fisher Scientific	05-408-121	general supply
1.5ml microcentrifuge	Fisher Scientific	05-408-129	general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE	EXELINT	26028	general supply
Absolute Ethanol (200 prfof)	Fisher chemical	200559	general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle	Becton Dickinson	309626	general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)	Becton Dickinson	395195	general supply
Cesium-137 Irradiator	J. L. Shepherd	Mark IV	equipment
DietGel 76A	Clear H2O	70-01-5022	general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish	Life Sciences	353003	general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352098	general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm	Fisher Scientific	22363548	general supply
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10	general supply
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09	general supply
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein	29404	Solution
Ketamine	Zoetis	043-304	injection
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech Science	KCC34155	general supply
PBS pH7.4 (1X)	Gibco	10010023	Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk	Braintree Scientific	IRD-P M	general supply
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093	Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim	TEVA	0703-9526-01	injection
Xylazine	Akorn	139-236	injection
X-ray irradiator	Rad source	RS-2000	equipment