Моделирование in vitro для неврологических заболеваний с использованием прямого преобразования из фибробластов в нейронные клетки-предшественники и дифференциация в астроциты

Резюме

Мы описываем протокол перепрограммирования фибробластов кожи человека в индуцированные нейронные клетки-предшественники (iNPCs) и их последующую дифференциацию в индуцированные астроциты (iAs). Этот метод приводит к быстрому и воспроизводимому поколению iNPCs и iAs в больших количествах.

Аннотация

Исследования неврологических расстройств сосредоточены в первую очередь на влиянии нейронов на механизмы заболевания. Ограниченная доступность моделей животных серьезно влияет на изучение специфических вкладов клеточного типа в болезни. Кроме того, модели животных обычно не отражают изменчивость мутаций и курсов заболеваний, которые можно увидеть у пациентов. Методы перепрограммирования для генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) произвели революцию в конкретных исследованиях пациентов и создали ценные инструменты для изучения механизмов заболевания. Тем не менее, технология iPSC имеет такие недостатки, как время, трудовые обязательства, клональная избирательность и потеря эпигенетических маркеров. Недавние модификации этих методов позволяют более прямое поколение клеточных линий или конкретных типов клеток, в обход клональной изоляции или плюрипотентного состояния стволовых клеток. Мы разработали метод быстрого прямого преобразования для генерации индуцированных нейронных клеток-предшественников (iNPCs) из фибробластов кожи с использованием ретровирусных векторов в сочетании с неврализирующими средствами массовой информации. INPCs можно продифференцировать в нейроны (iNs) oligodendrocytes (iOs) и астроциты (iAs). Производство iAs облегчает быстрое тестирование механизма лекарственных препаратов и болезней, так как дифференциация от INPCs занимает всего 5 дней. Кроме того, iAs легко работать и генерируются в чистом населения в больших количествах. Мы разработали высокоразвлечимый анализ совместной культуры с использованием нейронов мыши GFP и полученных пациентом iAs для оценки потенциальных терапевтических стратегий для многочисленных неврологических и нейродегенеративных расстройств. Важно отметить, что анализы iA масштабируемы до формата 384 хорошо, облегчая оценку нескольких малых молекул в одной пластине. Такой подход позволяет одновременно терапевтической оценки нескольких клеточных линий пациента с разнообразным генетическим фоном. Легкое производство и хранение iAs и емкость для проверки нескольких соединений в одном анализе делает эту методологию адаптируемой для персонализированной медицины.

Введение

Понимание основных механизмов заболевания имеет решающее значение для неврологических заболеваний, поскольку оно помогает в разработке потенциальных терапевтических стратегий. В то время как модели животных исторически были золотым стандартом для исследования заболеваний нервной системы, прямой перевод потенциальных методов лечения в клинических условиях^{часто показывает ограниченный успех 1,2,3}. Причинами отсутствия перевода являются отсутствие изменчивости генетического фона и мутаций у мышей, неполное отображение фенотипов заболеваний и изменение чувствительности к лекарственным препаратам или досирование у пациентов, которые не хорошо изображены в инбредных штаммах мыши. Кроме того, для многих редких неврологических расстройств, нет или несколько моделей животных доступны. Изучение механизмов заболевания непосредственно в соответствующих типах клеток человека может облегчить исследования и улучшить перевод в клинику. При расстройствах ЦНС первичные клетки человека трудно извлечь и представляют собой весьма ограниченный источник, поскольку биопсия является инвазивной или может быть извлечена только после смерти на конечной стадии заболевания. За последние 15 лет развитие технологии клеточного перепрограммирования быстро расширило возможности моделирования неврологических и нейродегенеративных заболеваний человека в пробирке.

Традиционные методы перепрограммирования клеток включают перепрограммирование фибробластов или других типов клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), способные дифференцироваться в типы клеток из всех трех слоев^{микробов 4.} Такахаси и Яманака были первыми, кто показала, что повторного выражения четырех факторов транскрипции стволовых клеток достаточно, чтобы перенаправить соматические клетки, чтобы стать iPSCs⁵. IPSCs можно более далее продифференцировать в специфически типы клетки. Тем не менее, недостаток этого процесса является то, что это трудоемкий и трудоемкий для создания и изоляции стабильных клонов стволовых клеток. Соматические мутации или специфические аберрансии материнской клетки также поддерживаются в клоне стволовых клеток и могут повлиять на результаты исследования⁶. Кроме того, все больше доказательств свидетельствует о^том,что процесс перепрограммирования стволовых клеток стирает ценные эпигенетические изменения, которые могут повлиять на^{механизмы клеточных заболеваний 4,7,8.} В последние годы исследователи сосредоточились на модифицированных методах перепрограммирования, позволяющих более прямое поколение различных типов клеток, минуя плюрипотентное^{состояние стволовых клеток 9,10,11,12} (рассмотрено ^{в 13,14).} Первоначальные прорывы показали в пробирке комбинаторной перепрограммирования фибробластов в^{кардиомиоциты 15},^{нейроны 16} и^{гепатоциты 17} по эктопической экспрессии нескольких линий конкретных факторов транскрипции или микроРНК¹⁸. За этим последовали исследования непосредственно перепрограммирования клеток для моделирования неврологических расстройств^19,20. Как уже упоминалось выше, такие протоколы прямого перепрограммирования или преобразования имеют потенциальные преимущества по сравнению с классическими протоколами iPSC, включая скорость и абляцию шага клональной изоляции. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что эти протоколы позволяют поддерживать большее количество эпигенетической информации, связанной с возрастом пациента и, вероятно, то же самое относится и к^{болезни соответствующих маркеров 7,8}.

На сегодняшний день большинство исследований in vitro по неврологическим расстройствам было сосредоточено в первую очередь на нейронах. Тем не менее, хорошо известно, что другие типы клеток, такие как астроциты, микроглии и олигодендроциты играют важную роль в патологии заболеваний и прогрессировании нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD), амиотрофический боковой склероз (ALS), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), рассеянный склероз (MS), и другие неврологические патологии, такие как синдром Ретта наркомания, эпилепсия, лизосомальные расстройства хранения, депрессия,^{мигрень и патологическая боль 21,22,23,24,25,26.} Астроциты являются наиболее распространенным типом клеток в центральной нервной системе (ЦНС) и до недавнего времени, они были широко пренебречь с патологической точки^{зрения 7}. В настоящее время известно, что они играют важную роль в поддержке почти всех гомеостатической функции здорового ЦНС. Кроме того, очевидно, что они имеют важное патологическое воздействие и очень ценны в понимании механизма заболевания и оценке терапевтических стратегий¹⁹.

В текущем описании мы подробно протокол для прямого преобразования человека пациента фибробластов в индуцированных нейрональных клеток прародителя (iNPCs) с использованием ретровирусных векторов, выражающие Яманака перепрограммирования факторов (Klf4, Oct3/4, Sox2 и c-Myc) и последующего воздействия неврализации средств массовой информации. Предыдущие исследования использовали различные комбинации транскрипционных факторов для прямого перепрограммирования нервных клеток ^{(рассмотрены в 14}), но факторы, используемые в описанном протоколе широко доступны либо в качестве плазмидов для в доме производства вирусных векторов, или как коммерчески доступны готовы пойти вирусной перепрограммирования комплектов. Полученные iNPCs могут быть дополнительно дифференцированы в индуцированных нейронов (iNs)²⁷, олигодендроцитов (iOs)²⁴ и астроцитов (iAS)^{19 для} изучения их роли в неврологических заболеваний. Наш протокол не предполагает трудоемкого поколения iPSCs, которые наиболее доступные протоколы используют для получения человеческих астроцитов²⁸. Приблизительно от 98% до 100% непосредственно перепрограммированных iNPCs может дифференцироваться в GFAP-положительные^{астроциты 29 по} сравнению с только 2% с помощью метода прямого преобразования из фибробластов в астроциты³⁰. Недавно сравнительное транскриптомическое исследование с использованием нашего описанного метода перепрограммирования показало, что iNPCs перепрограммированы из донорских фибробластов может сохранить функции старения на транскрипционные и функциональный уровень похож на возрастных посмертных астроцитов и первичных^{астроцитов 29}. Таким образом, этот протокол преобразования является мощным инструментом для изучения механизмов заболевания и оценки новых терапевтических подходов к возрастным нейродегенеративным и неврологическим расстройствам.

Здесь мы описываем протокол, используемый для генерации iNPCs и дальнейшей дифференциации в IAs, которые наиболее подходят для больших малых молекулярных анализов скрининга. Механизмы заболевания и тестирование на наркотики с помощью iAs могут быть сделаны с использованием различных методологий, таких как совместное использование культур с нейронами или метаболический и биохимический анализ. Преимуществом этой системы является скорость и простота обслуживания этих клеточных линий по сравнению с iPSCs. Кроме того, iNPCs могут быть заморожены небольшими порциями для дифференциации М.А., что облегчает тестирование на наркотики в постоянных условиях в течение длительных периодов времени. В целом, сравнение больших выборочных чисел становится возможным таким образом, что открывает двери для оценки терапевтического потенциала соединений в более широкой и более представительной популяции пациентов.

протокол

медиа	реагент	Сумма для смешивания	Окончательная концентрация (%)
Фибробластые СМИ	DMEM, высокое содержание глюкозы, GlutaMAX	500 мл	89
	Сыворотка из плода крупного рогатого скота	50 мл	10
	Антибиотико-антимикотический	5 мл	1
Базовые средства массовой информации	DMEM/F12 - Глутамакс	500 мл	97
	N-2	5 мл	1
	B-27	5 мл	1
	Антибиотико-антимикотический	5 мл	1
Конверсионной мультимедиа	Базовые средства массовой информации	50 мл	99.9
	FGF	1 йл	0,02 (20 нг/мл)
	EGF	1 йл	0,02 (20 нг/мл)
	Гепарин	50 йл	0,1 (5 мкг/мл)
Нейронная клетка прародителя (NPC) Медиа	DMEM/F12 - Глутамакс	500 мл	96.9
	N-2	5 мл	1
	B-27	5 мл	1
	Антибиотико-антимикотический	5 мл	1
	FGF	10 uL	0.002
Астроцит Медиа	DMEM, высокое содержание глюкозы, GlutaMAX	500 мл	89
	Сыворотка из плода крупного рогатого скота	50 мл	10
	Антибиотико-антимикотический	5 мл	1
	N-2	1 мл	0.2
Средства массовой информации должны быть отфильтрованы после смешивания всех компонентов. Конверсионной среды (с факторами) должны быть подготовлены свежими каждую неделю.

Таблица 1. Медиа рецепты для всех типов ячеев, включенных в протокол. Средства массовой информации должны быть отфильтрованы после смешивания всех компонентов либо стерильной системой вакуумной фильтрации для больших объемов, либо шприцем и фильтрами шприцев 0,2 мкм. Конверсионной среды (с факторами) должны быть подготовлены свежими каждую неделю.

1. Прямое преобразование взрослых фибробластов человека в нейронные клетки-предшественники

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическая шкала этого протокола может быть пересмотрена в Meyer (2014)¹⁹.

1. Используйте первичные фибробласты кожи человека, которые могут быть получены из клеточных банков или биопсии кожи³¹. Культурные клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры_{со-2 CO 2.} Проходные клетки, по крайней мере 1-2 прохода после оттаивания до использования в эксперименте. Как только клетки будут готовы, покрыть колодец 6-хорошо пластины с человека фибронектин (1:200 разбавленных в PBS) при комнатной температуре в течение 15-20 мин.
2. Когда клетки будут готовы к помыть, удалите фибронектин из блюда и сразу же добавьте клеточный раствор или 2 мл фибробластового мультимедиа(таблица 1)- не позволяйте блюду высохнуть до добавления мультимедиа. В зависимости от того, как быстро растут клетки, пластины 150000 (быстрый рост) - 200000 (медленно растущих) фибробластов в двух колодцах человека фибронектин покрытием 6-хорошо пластины каждый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть около 70% стечения для вирусной трансдукции, чтобы иметь возможность держать их в той же пластине в течение нескольких дней после трансдукции. Это может быть полезно для семян в двух различных плотностей для того, чтобы иметь выбор на следующий день для преобразования.
3. На следующий день после посева проверьте фибробласты под микроскопом и проверьте плотность клеток (между 70-85%) и даже посева по всему колодец для достижения оптимальных результатов.
4. Трансдуцация одного хорошо со всеми четырьмя ретровирусными векторами (Oct3/4, Klf4, Sox2 и c-Myc) - используйте множественность инфекции (MOI) 10 для быстрого роста или 15 для медленно растущих фибробластов (эффективность трансдукции должна превышать 70% или более положительных клеток для каждого вектора). Добавить регулярные фибробластов среды вирусной смеси в общей сложности 1 мл на колодец и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию в 5% CO_{2 ткани} культуры инкубатора. Оставьте второй хорошо необработанных и вернуть клетки в инкубатор культуры тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ретровирусные векторы могут быть приобретены поставщиком или сделаны в доме, протоколы доступны онлайн³².
5. На следующий день после трансдукции, мыть клетки 1x с PBS и добавить 1 мл свежей фибробластовой среды.
6. На следующий день измените средний к преобразованию среды. Вымойте клетки 1x с PBS, чтобы избавиться от остаточной фибробластовой среды, а затем добавить 1 мл среды преобразования. Измените средства массовой информации необработанных хорошо преобразования средств массовой информации, а также.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые морфологические изменения можно наблюдать даже путем изменения средств массовой информации на фибробласты, которые не получили ретровирусного лечения вектора, таким образом, с необработанных хорошо (необязательно) будет полезно при определении последствий вирусных векторов. Клетки должны начать менять морфологию через 2-4 дня после перехода на средства преобразования.
7. Наблюдайте за клетками под микроскопом и следите за изменениями в морфологии(рисунок 1). Сотовые средства массовой информации должны быть заменены ежедневно на протяжении всего процесса преобразования (1-2 мл средств преобразования, таблица 1) и для последующей культуры iNPC. Измените среду, тщательно удалив 70% среды из колодец, убедившись, что клетки остаются покрытыми в оставшихся 30% носителей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации с факторами роста в нем должны быть использованы в течение 1 недели после подготовки.
   1. Продолжайте ежедневно наблюдать за ячейками и изменять мультимедиа (1-2 мл конверсионного мультимедиа).
   2. Некоторые клеточные линии начинают формировать свободные повышенные круглые образования, растущие в шаре, как структуры или свободные нейронныесферы (Дополнительный рисунок ^{1 и 19,33}). Позаботьтесь, чтобы не отделить эти клетки. Если шары отсоединиться, они могут быть собраны и повторно покрыты в новый фибронектин покрытием хорошо 6-хорошо пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если они будут расширены сами по себе, клетки будут иметь уменьшенное разнообразие по сравнению с начальной пластиной и могут представлять собой совершенно другую линию клеток. Мы рекомендуем объединить эти клетки с остальными преобразованными клетками при следующем раунде расщепления.
8. Примерно через 5-6 дней в средствах преобразования (до 12 дней для сложных клеточных линий) или когда клетки становятся очень плотными, проход их 1:2 или максимум 1:3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно держать клетки в высокой плотности на протяжении всего процесса преобразования.

2. Процедура разделения конверсии и iNPC

1. Разогреть раствор отслоения клеток (например, Accutase) и покрыть соответствующее количество скважин 6-колодец с фибронектином (1:200 в PBS, 1 мл объема покрытия) в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Фибронектиновое покрытие может быть длиннее без негативного воздействия, но следует позаботиться о том, чтобы не сокращать время покрытия.
2. Тщательно промывите клетки с помощью PBS, не отсоединяя клетки (используйте стенку колодец, чтобы аккуратно применить PBS к клеткам). Аккуратно удалите PBS с пипетки или стремление.
3. Добавьте 0,5 мл раствора клеточного отслоения и инкубировать 2-3 мин при 37 градусах цельсия в инкубаторе культуры тканей. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток отделились. Если все клетки откололись, добавьте 2 мл свежих средств преобразования и аккуратно пипетки вверх и вниз 2-3 раза, чтобы разобщить сгустки (при необходимости).
4. Соберите ячейки в трубку 15 мл и добавьте дополнительные 3 мл мультимедиа для дальнейшего разбавления раствора отслоения клеток. Вымойте колодец с дополнительными средствами массовой информации в первую очередь, чтобы убедиться, что все клетки были собраны.
5. Центрифуга в течение 4 мин при температуре 200 x г при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразование ячеек или iNPC чрезвычайно чувствительны к наличию решения отслоения клеток в средствах массовой информации. Абсолютно необходимо удалить остаточный фермент путем центрифугации и вывода супернатанта.
6. Удалить супернатант из клеточных гранул и повторного перерасхода клеток в 1 мл свежей среды. Аккуратно пипетки вверх и вниз 2-3 раза, чтобы решить ячейки сгустки. Удалить фибронектин из покрытых 6-колодцев и добавить 1 мл свежих средств массовой информации в каждой скважине немедленно (не позволяйте фибронектин сухой). Для сплит-соотношения 1:2 добавьте 0,5 мл клеточной подвески в одну колодец, а другую 0,5 мл во второй колодец.
   1. Культурные клетки при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры тканей.
7. Распределите клетки, мягко встряхивая 6-колодец в северо-юго-восточном-западном направлении (не круговой) и положить в инкубатор культуры тканей.
8. Наблюдайте за клетками под микроскопом на следующий день и меняйте средства массовой информации (1-2 мл). Меняй мультимедиа каждый день, пока ячейки не будут готовы к разделению снова.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, пролиферации клеток должны начать ускоряться, и клетки должны быть готовы к второму расколу в течение 2-3 дней (4 дня для очень медленно растущих линий).
   1. При этом новом расколе, семена одной хорошо клеток в преобразовании средств массовой информации, а другой хорошо в NPC средств массовой информации, содержащие только FGF при повышенной концентрации без EGF / гепарин (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые линии сотовой связи достигают застойного состояния в средствах преобразования примерно через 10 дней, и переход на NPC media может помочь с ростом клеток. Кроме того, NPC имеют более конкретную, меньшую форму, когда выращивается в NPC Media¹⁹. На данный момент iNPC готовы к дифференциации и дальнейшему использованию.
9. Продолжайте менять средства массовой информации (1-2 мл) iNPCs ежедневно.
   1. Расширьте NPC на 10 см посуды, объединив две или три стеченных колодца 6-х скважин. Объем мультимедиа для блюд 10 см обычно составляет 12-15 мл.
   2. При следующем расколе, далее расширить эти клетки до трех или четырех 10 см блюда (12-15 мл средств массовой информации) для поколений большого количества клеток запасов. 10 см блюда, как правило, делятся на 1:3 или 1:4 каждые 3-4 дня в зависимости от скорости распространения.

3. Создание индуцированных астроцитов из NPC

1. Чтобы сделать астроциты из свежих iNPCs, семена iNPCs (в 10 см фибронектина покрытием пластин) непосредственно в 10 мл астроцитов среды (Таблица 1), так что они около 10% слияния на следующий день. Культурные клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры_{со-2 CO 2.}
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая плотность посева, как правило, 50 йл клеточного повторного незаменимия 10 см блюдо NPC, при условии, что они разбавлены до конечного объема на основе их сплит-коэффициента (например, 3 мл для 1:3 раскол, 4 мл для 1:4 раскол, и т.д.).
2. Изменение среды (10 мл астроцитов) iAs через три дня после покрытия. Держите клетки дифференциации в течение 5-7 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: iAs не терпят множественные проходы наилучшим образом, поэтому более лучше сделать свежие астроциты каждое время вы разделяете NPCs.
3. Чтобы семени для экспериментов, разделить астроцитов с помощью трипсина или клеточного отслоения решение, как описано в шагах 2.1-2.7. Рекомендуемая плотность посева включена в таблицу 2.

Тип плиты	Астроциты на колодец
384-ну	2500
96-ну	10000
24-ну	40000
6-ну	150000

Таблица 2. Рекомендуемая плотность посева iAs на площадь пластины. Типичное количество iAs посеяно для того чтобы произвести monolayer на самых общих плитах культуры ткани.

4. Подготовка и размораживает части для дифференциации астроцитов от замороженных запасов NPC (альтернатива шагу 3)

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы поддержанию iNPCs в культуре, астроциты также могут быть произведены непосредственно из замороженных запасов. Для этого iNPCs замораживаются небольшими порциями. Таблица 3 показывает, предложил замораживания и оттаивания томов для порций, которые будут разморожены в 10 см блюдо, содержащее 10 мл астроцитов средств массовой информации.

Размер порции	Подвеска клеток (ОЛ)	Замораживание средств массовой информации (ОЛ)	Общий объем (ОЛ)	Размораживается в
4x	400	400	800	Два 10-сантиметровых блюда
2x	200	200	400	Одно 10-сантиметровое блюдо

Таблица 3. Инструкции о том, как часть iNPC для создания iAs. Пропорция подвески iNPC и замораживания мультимедиа для генерации порций. Обратите внимание, что окончательная концентрация DMSO составляет 10%, когда подвеска клетки смешивается с замораживанием средств массовой информации.

1. Чтобы сделать астроциты из замороженных запасов iNPC, удалите часть бульона флакона из резервуара для хранения жидкого азота и быстро оттаивать при 37 градусов по Цельсию. Как только клетки размораживается, раствор пипетки в 15-мл трубки, содержащей 5 мл астроцитов.
2. Центрифуга в течение 4 мин при температуре 200 х и комнатной температуре. Удалите супернатант и повторное течение 1 мл свежей среды астроцитов.
3. Добавьте 9 мл свежей астроцитной среды в фибронектин с покрытием 10 см и добавьте 1 мл клеточного раствора. Аккуратное распределение ячеек в движении с севера на юго-восток-запад. Культурные клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры_{со-2 CO 2.}

Результаты

Этот протокол позволяет быстро и легко генерации iNPCs непосредственно из фибробластов кожи человека с использованием ретровирусов, содержащих факторы Яманака. Этот метод позволяет обойти состояние стволовых клеток и необходимость клонального отбора, тем самым избегая клональных вариаций. Важные шаги, чтобы иметь в виду, в то время как клетки проходят процесс преобразования являются плотность посева фибробластов, рН мультимедиа и поддержания клеток в оптимальном слиянии. Примеры оптимальных изменений слияния и морфологии в процессе преобразования можно найти на рисунке 1.

Рисунок 1. Репрезентативные изображения процесса преобразования после добавления ретровирусной смеси факторов Яманака. Фибробласты были посеяны и перенесены двадцать четыре часа спустя с факторами Яманака. Два дня после вируса (DPV), средства массовой информации был изменен на преобразование средств массовой информации. Клетки были культурны в средствах преобразования до тех пор пока они не быть готовы к проходу (13 DPV). Клетки были посеяны после прохождения достичь 80% слияния на следующий день (14 DPV). Последующие проходы поддерживали эту плотность до тех пор, пока нейронные клетки-предшественники не начали быстро делиться. Шкала бар составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

После завершения процесса преобразования NPC покажет сильно уменьшенное выражение или отсутствие выражения фибробластов и морфологии, а также выразит специфические маркеры клеток NPC(рисунок 2). Кроме того, они также могут быть использованы для генерации различных клеточных линий, таких как iNs, iOs и iAs.

Рисунок 2. Клетки, которые проходят процесс преобразования, выражают маркеры, специфичные для клеток. Пациент фибробласты (A), индуцированные нейронные клетки-предшественники (iNPCs (B) и индуцированные астроциты (iAs (C) клетки были посеяны на стеклянных обложках в 24 хорошо ткани культуры обработанной пластины. Клетки были иммуноминированы для: фибробластов специфических маркеров клеток (A), Vimentin (зеленый) и TE7 (красный), iNPC специфический маркер клетки (B), Nestin (красный), и маркер клетки iAs (C) GFAP (фиолетовый) и маркер iNPC Nestin (зеленый). Шкала бар составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

По нашему опыту, iAs, в частности, очень ценны для тестирования механизма наркотиков и болезней, поскольку они могут быть созданы в чистых популяциях (98% или более положительных клеток GFAP²⁹) в воспроизводимых больших количествах. iAs можно продифференцировать от iNPCs путем принимать малую aliquot клеток во время разделять или ранее замороженной части iNPC и сразу plating в средствах астроцита. Важными соображениями в ходе этого процесса являются поддержание начальной плотности посева iNPCs низкой(рисунок 3 и рисунок 4), так как высокая плотность, как было показано,препятствует процессу дифференциации (рисунок 4) и уделяя дополнительное внимание рН средств массовой информации, так как подкисление может активировать даже здоровые астроциты.

Рисунок 3. Репрезентативные изображения процесса генерации iAs от iNPCs. iNPCs посеяны в средствах массовой информации астроцитов (таблица 1) при низкой плотности посева. Хорошая плотность посева составляет около 10% в первый день после посева (DPS) (слева); однако, эта плотность может быть скорректирована в зависимости от темпов роста клеток. Типичная морфология iAs может наблюдаться после 5 DPS (средний). В некоторых случаях наблюдается аноматрантная морфология астроцитов с длинными колючими расширениями. Это изменение свидетельствует об активации астроцитов и может быть вторичным по отношению к состоянию заболевания или неправильным методам культивирования (справа). Шкала бар составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4. Плотность посева iNPC влияет на эффективность дифференциации iAs. Линии управления iNPC были посеяны при низкой (A) и высокой (B) плотности в средствах массовой информации астроцитов, чтобы продемонстрировать влияние плотности посева на дифференциацию. 5 DPS, линия низкой плотности выразила астроцит-специфические маркеры, в то время как линия высокой плотности показывает смесь маркеров iNPC и iAs с отмеченной морфологией, похожей на iNPC. Шкала бар составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 1. Дополнительные цифры процесса преобразования после добавления ретровирусной смеси факторов Яманака. Изображения процесса преобразования на 12 DPV (1 день до прохождения) и 19 DPV (6 дней после прохождения). Обратите внимание на разницу в морфологии между клетками до и после прохождения, в 12 DPV клетки имеют шар, как структура морфологии. После прохождения и несколько дней на преобразование средств массовой информации (таблица 1) клетки начинают отображать NPC-как морфология. Шкала бар составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Таким образом, прямое преобразование является быстрым и простым методом для создания индуцированных нейронных клеток-предшественников из фибробластов кожи пациента. Этот метод выгоден из-за его скорости, а также большого количества генерируемых ячеек, которые просты в обслуживании. Кроме того, все больше доказательств свидетельствует о том, что методы прямого перепрограммирования удаляют меньше эпигенетических знаков по сравнению с классической технологией перепрограммирования iPSC, в результате чего окружающая^{среда болезни остается более нетронутой 4,7,8.} Дифференциация iNPCs к астроцитам очень прямо вперед и высоки воспроизводима даже между множественными независимыми^{лабораториями 19,29,33.} iNPCs могут быть заморожены небольшими порциями и разморожены непосредственно для целей дифференциации, что помогает уменьшить различия между экспериментами, так как число проходов может быть аналогичным. Астроциты играют решающую роль в прогрессировании заболевания во многих неврологических заболеваний и, следовательно, интересный тип клеток для работы. Астроциты могут быть использованы для механистических исследований, метаболических исследований или анализа на наркотики и, как правило, выращиваются как монослойные. Кроме того, астроциты могут быть объединены в системах совместной культуры с мышью или нейронов человека для оценки влияния астроцитов на выживание нейронов и морфологии, оба из которых являются хорошими считывания для тестирования^{на наркотики 34}.

Для успешного использования этого протокола необходимо иметь в виду несколько моментов и потенциальных ограничений. Фибробласты кожи человека, например, сильно различаются по скорости деления клеток, а также ответ на вирусные векторы. Поскольку это не стандартизированные клеточные линии, они так же изменчивы, как и само человечество, каждая линия отличается. Что касается многих методов перепрограммирования, легче перепрограммировать фибробласты, которые имеют умеренную и быструю скорость деления клеток по сравнению с клетками, которые едва реплицируются. Скорость репликации может быть повлията на качество биопсии кожи и обработки себя, по проходу число фибробластов, а также обработки. При работе с первичными фибробластами кожи, важно, чтобы клетки не получить слишком плотной, чтобы избежать индукции сенесценции. Если фибробласты не растут хорошо, то лучше попробовать новый запас или нижний проход, хотя в некоторых случаях, само заболевание может также играть определенную роль. Деление клеток иногда может быть улучшено с помощью 15% или 20% FBS в фибробластных средствах массовой информации по сравнению со стандартными 10%.

Качество перепрограммирования вирусных векторов имеет большое значение для успеха. В наших руках ретровирусные векторы были более эффективными по сравнению с лентивирусными векторами или другими неинтегрировавными вирусами; однако это может зависеть от качества и чистоты вирусного вектора. Коммерческие ретровирусные наборы переносчиков обычно определяют концентрацию вирусного переносчика, а часто и множественность инфекции для определенной клеточной линии. Важно иметь в виду, что первичные фибробласты отличаются от клеточной линии, используемой компаниями для определения вирусного поглощения вектора. Кроме того, даже при заказе одного и того же коммерческого комплекта, различия между партиями является общим. Кроме того, поглощение вирусных векторов также варьируется между линиями фибробластовых клеток. Некоторые линии могут быть более чувствительными и, следовательно, транс индуцированные клетки могут умереть, в то время как другие клеточные линии могут быть более устойчивыми к вирусному поглощению. Таким образом, определение эффективности трансдукции для данной клеточной линии может быть важно, особенно если линия ячейки растет медленно или предыдущие попытки преобразования не увенчались успехом. В наших руках лучший способ оценить, сколько конкретного ретровирусного вектора необходимо для преобразования, это выполнить иммунофлуоресцентное окрашивание с несколькими разбавлениями вирусного вектора. Количество ячеек, выражающих трансген для каждого вектора, можно пересчитать с целью повышения эффективности трансдукции на 70% и выше. По нашему опыту, аналогичные MOIs могут быть использованы для большинства линий клеток однако МВД может быть скорректирована в случае необходимости.

Во время процесса преобразования крайне важно не разделить клетки слишком рано. Время, пока клетки не будут готовы к разделению, зависит от нескольких факторов, включая первичную линию клеток и ее характеристики, качество используемого вирусного вектора и качество мультимедиа. Важно отметить, что скорость успеха преобразования гораздо выше, когда клетки хранятся в высокой плотности. Даже если клетки начинают менять морфологию, лучше оставить клетки в первом хорошо дольше, чем расщепление их преждевременно. Если разделение происходит слишком рано преобразование может остановиться в своем прогрессе и привести клетки дифференцировать обратно в фибробластовой формы и поведения. Кроме того, разбавление их слишком рано может привести к более удлиненные тела клеток по сравнению с малых и компактных клеток органов NPC наблюдается ранее. Таким образом, первые расколы всегда должны быть консервативными; лучше держать клетки слишком плотными с 1:1 или 1:2 раскол по сравнению с разбавления их слишком много. Ожидается, что после первоначального раскола будет приведена в себя какая-то клеточная смерть. Следует отметить, что клетки всегда выглядят хуже (льстить) в первый день после расщепления, что нормально. Лучшие суждения о форме клеток должны быть сделаны через 2-3 дня. Важно отметить, что качество факторов роста и медиа-компонентов также имеет решающее значение. Важно подготовить небольшое количество средств массовой информации, содержащих факторы роста, с тем чтобы полностью подготовленные средства массовой информации использовались только в течение 5-7 дней максимум. Не держите средства массовой информации при комнатной температуре или 37 градусов по Цельсию в течение длительных периодов времени. Используйте быстро и хранить в холодильнике, как только средства массовой информации изменения выполняются. Кроме того, сохранение низкого объема мультимедиа на уровне 1 мл вместо 2 мл может помочь особенно для клеточных линий, которые более устойчивы к преобразованию. Если клетки потребляют средства массовой информации быстро, что можно наблюдать при изменении цвета мультимедиа от красного до желтого (скорость подкисления), отрегулируйте объем мультимедиа до 2 мл. Быстрое потребление средств массовой информации является позитивным признаком и часто наблюдается на более поздних стадиях преобразования наряду с увеличением распространения.

NPC также очень чувствительны к присутствию accutase в средствах массовой информации, и это очень важно, чтобы сохранить accutase инкубации времени короткий. Рекомендуем инкубационный период в 2-4 минуты, часто проверяйте клетки под микроскопом, чтобы увидеть, когда они отсоединились. Важно центрифугировать клетки после расщепления, чтобы удалить ферментную смесь из средств массовой информации. Важно также иметь в виду номер прохода, поскольку клеточные линии могут меняться при расширенном культивировании, что приводит к изменению профилей выражения. Таким образом, важно заморозить многие запасы клеток на ранних проходах. Клетки должны быть заморожены в 10% DMSO и 90% NPC сми и храниться в долгосрочной перспективе в жидком азоте. Из-за отсутствия сыворотки в этом средстве крайне важно обеспечить медленный замерзать с помощью замораживающих камер и после замораживания на ночь, немедленно перейти на жидкий азот. Хотя в этом протоколе не проводится клональный отбор, вполне возможно, что расширенное культивирование и пропуск приводит к естественному отбору исходной популяции клеток с благоприятным ростом и выживаемостью. Поэтому важно иметь в виду номер прохода и обработку при проведении экспериментов. Мы предпочитаем использовать нижние проходы для экспериментов, если это возможно, мы не превышаем проходные линии клеток более чем в 20 раз. Поскольку ННК быстро растут, большое количество запасов может быть заморожено на более низких проходах для экспериментов. Клеточные линии с особенно высокими темпами роста имеют более высокий риск подкисления средств массовой информации. Таким образом, по мере того, как клеточные линии растут с разной скоростью, количество средств массовой информации, возможно, потребуется корректировать в зависимости от распространения. Если клетки постоянно остаются в высококислых средствах массовой информации, это может повлиять на здоровье как контроля, так и линий клеток болезни. Это приводит к тому, что даже здоровые астроциты становятся реактивными, влияя на их использование в дальнейшей дифференциации и экспериментах.

Для дифференциации астроцитов, важно держать клетки на низкой плотности, как высокая плотность будет препятствовать клеткам от дифференциации, и они будут продолжать размножаться с более высокими темпами. Таким образом, плотность посева должна быть скорректирована для каждой клеточной линии в зависимости от скорости их распространения. Мы рекомендуем попробовать различные плотности посева и выполнять окрашивания / RT-PCR с астроцитов маркеров для обеспечения надлежащей дифференциации. Качество IAs можно оценить наряду со здоровым контролем с помощью совместного анализа культуры с нейронами. При условии, что патология заболевания не приводит к реактивному фенотипу, нейроны должны оставаться жизнеспособными при контакте с МИ в течение нескольких дней. Астроцитов морфология может сильно варьироваться между отдельными клеточными линиями и может быть влияние фенотипа болезни, а также. Кроме того, при заболеваниях, когда астроциты сильно поражены, они могут показать реактивный фенотип с большими, удлиненными расширениями.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic	Corning	430167	Tissue culture
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene	USA Scientific	1475-1611	Used for lifting and centrifuge cells
50mL Conical Centrifuge Tubes	USA Scientific	1500-1811	Media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062	Antibiotic with antifungal activity for media preparation
B-27  Supplement (50X), serum free	Invitrogen	17504044	For NPC and base media
Cryogenic vials  1.2ML	Corning	CLS430658-500EA	For freezing cell stocks
DMEM, high glucose, GlutaMAX  Supplement, pyruvate	Gibco	10569010	For fibroblast and Astrocyte media
DMEM/F-12, GlutaMAX  supplement	Gibco	10565042	For NPC and base media
DMSO	Sigma	D2438-50ML	For freezing cell stocks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190136	Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit	ALSTEM	RF101	Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house.
Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000-036	Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use	Fisher	14-955-461	Filter media (50mL)
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149-10KU	Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X
Human Plasma Fibronectin Purified Protein	Millipore Sigma	FC010-10MG	Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating.
Isopropanol (technical grade)	Fisher Scientific	S25372A	For freezing cell stocks
Mr. Frosty	Thermo Fisher	5100-0001	For freezing cell stocks
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	For Astrocyte, NPC and base media
Recombinant Human EGF	Preprotech	AF-100-15	Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots
Recombinant Human FGF-basic	Preprotech	100-18B	Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs.
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU05RE	Media filtration
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid	Fisher	08-772-1B	Tissue culture
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Invitrogen	25300062	Lifting of Fibroblasts and Astrocytes
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile	Millipore Sigma	80-2502	Filter media (50mL)