JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Патофизиологические изменения в вегетативной нервной системе сердца, особенно в ее симпатической ветви, способствуют возникновению и поддержанию желудочковых аритмий. В настоящем протоколе мы показываем, как охарактеризовать мышиные звездчатые ганглии, чтобы улучшить понимание лежащих в основе молекулярных и клеточных процессов.

Аннотация

Вегетативная нервная система является существенным драйвером электрофизиологии сердца. Особенно роль его симпатической ветви является постоянным предметом исследований в патофизиологии желудочковых аритмий (ВА). Нейроны в звездчатых ганглиях (SG)   — двусторонних звездообразных структурах симпатической цепи —   являются важным компонентом симпатической инфраструктуры. SG являются признанной мишенью для лечения с помощью сердечной симпатической денервации у пациентов с терапевтически-рефрактерным ВА. В то время как ремоделирование нейронов и глиальная активация в SG были описаны у пациентов с ВА, основные клеточные и молекулярные процессы, которые потенциально предшествуют началу аритмии, только недостаточно изучены и должны быть выяснены для улучшения вегетативной модуляции. Мышиные модели позволяют изучать симпатическое ремоделирование нейронов, но идентификация мышиного SG является сложной задачей для неопытного исследователя. Таким образом, углубленные клеточные и молекулярно-биологические исследования мышиного SG отсутствуют для многих распространенных сердечных заболеваний. Здесь мы описываем базовый репертуар для рассечения и изучения SG у взрослых мышей для анализа на уровне РНК (выделение РНК для анализа экспрессии генов, гибридизация in situ), уровне белка (иммунофлуоресцентное окрашивание цельного крепления) и клеточном уровне (базовая морфология, измерение размера клеток). Мы представляем потенциальные решения для преодоления проблем в технике приготовления и способы улучшения окрашивания путем гашения автофлуоресценции. Это позволяет визуализировать нейроны, а также глиальные клетки с помощью установленных маркеров для определения состава клеток и процессов ремоделирования. Представленные здесь методы позволяют охарактеризовать СГ для получения дополнительной информации о вегетативной дисфункции у мышей, склонных к ВА, и могут быть дополнены дополнительными методиками, исследующими нейронные и глиальные компоненты вегетативной нервной системы в сердце.

Введение

Сердечная вегетативная нервная система представляет собой жестко регулируемое равновесие симпатических, парасимпатических и сенсорных компонентов, которое позволяет сердцу адаптироваться к изменениям окружающей среды с соответствующей физиологической реакцией1,2. Нарушения в этом равновесии, например, повышение симпатической активности, были установлены в качестве ключевого фактора возникновения, а также поддержания желудочковых аритмий (ВА)3,4. Поэтому вегетативная модуляция, достигаемая за счет фармакологического снижения симпатической активности бета-адреноблокаторами, была краеугольным камнем в лечении пациентов с ВА на протяжении десятилетий5,6. Но, несмотря на фармакологические и катетерные вмешательства, соответствующее число пациентов все еще страдает от рецидивирующего VA7.

Симпатический вход в сердце в основном опосредован через тела нейронных клеток в звездчатых ганглиях (SG), двусторонних звездообразных структурах симпатической цепи, которые передают информацию через многочисленные внутриторакальные нервы от ствола мозга к сердцу8,9,10. Прорастание нерва из СГ после травмы связано с ВА и внезапной сердечной смертью11,12,подчеркивая СГ как мишень для вегетативной модуляции13,14. Снижение симпатического поступления в сердце может быть достигнуто временно путем чрескожной инъекции местных анестетиков или постоянно путем частичного удаления SG с помощью видеоассистированной торакоскопии15,16. Сердечная симпатическая денервация представляет собой вариант для пациентов с терапией-рефрактерной ВА с многообещающими результатами14,16,17. Мы узнали из эксплантированного SG этих пациентов, что нейронное и нейрохимическое ремоделирование, нейровоспаление и глиальная активация являются отличительными признаками симпатического ремоделирования, которые могут способствовать или усугублять вегетативную дисфункцию18,19. Тем не менее, лежащие в основе клеточные и молекулярные процессы в этих нейронах остаются неясными на сегодняшний день, например, роль трансдифференциации нейронов в холинергический фенотип20,21. Экспериментальные исследования представляют новые подходы к лечению ВА, например, снижение активности симпатического нерва с помощью оптогенетики22,но углубленная характеристика SG все еще отсутствует во многих сердечных патологиях, которые идут рука об руку с VA. Мышиные модели, имитирующие эти патологии, позволяют изучать ремоделирование нейронов, которое потенциально предшествует возникновению аритмий12,23. Они могут быть дополнены дальнейшими морфологическими и функциональными анализами для вегетативной характеристики сердца и нервной системы. В настоящем протоколе мы предоставляем базовый репертуар методов, позволяющих препарировать и характеризовать мышиную СГ для улучшения понимания ВА.

протокол

Все процедуры, касающиеся животных, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию земли Гамбург (ORG870, 959) и Государственным агентством по охране природы, окружающей среды и защиты прав потребителей Земли Северный Рейн-Вестфалия (LANUV, 07/11) и соответствуют Руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (2011). Исследования проводились с использованием самцов и самок (в возрасте 10-24 недель) мышей C57BL/6 (инвентарный номер 000664, Jackson Laboratories) и мышей гомозиготных (db/db) или гетерозиготных (db/het; контроль) для спонтанной мутации диабета (Leprdb; БКС. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, биржевой номер 000642, Jackson Laboratories). Авторы использовали имеющиеся под рукой протоколы без вариаций для мышей в возрасте до 60 недель.

1. Расположение и рассечение мышиных звездчатых ганглиев

ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что описания и рисунки в основном доступны у более крупных видов, некоторые публикации ранее описывали местоположение SG у крыс24 и мышей25 с использованием анатомических методов и флуоресцентных репортерных линий соответственно.

  1. Готовят 50 мл ледяного (3-4 °C) гепаринизированного (20 ед/мл, см. Таблицу материалов)фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Выполняют рассечение СГ при комнатной температуре (РТ).
  2. Глубоко обезболивают мышь путем вдыхания 3%-5% изофлурана в соответствии с институциональными и местными рекомендациями. Проверьте адекватную анестезию путем потери рефлекса снятия педали. Обезглавливают мышей или выполняют вывих шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильный вывих шейки матки может привести к разрыву позвоночника и повреждению грудных сосудов, что приводит к кровотечению, которое препятствует подготовке или разрыву симпатической цепи, так что SG не находятся в правильном положении. Поэтому крайне важно, чтобы опытный персонал выполнял вывих шейки матки или обезглавливал животных в глубокой селении.
  3. Опрыскайте кожу этанолом и откройте грудную клетку двумя разрезами вдоль передних подмышечных линий с помощью ножниц Майо и узких щипцов. Разрежьте диафрагму и снимите переднюю часть грудной клетки.
  4. Удалите пакет сердце-легкое, захватив полую аорту и полую вену прямо над диафрагмой с помощью лондонских щипцов и разрезав все сосуды и соединительную ткань близко к позвоночнику внизу ножницами косоглазия.
  5. Тщательно промыть грудную клетку гепаринизированным PBS с помощью пластиковой одноразовой пипетки до тех пор, пока не будут удалены все следы крови.
  6. Поместите туловища под стереомикроскопический подготовительный бинокль и обеспечьте хорошее освещение в грудной клетке внешними источниками света.
  7. Найдите первое ребро и мышцы longus colli.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SG расположены двусторонне, параллельно позвоночнику на ветке между первым ребром и позвоночником, в бороздке, боковой к длинным коллиозным мышцам24. Плоская сторона SG расположена рядом с длинными колли мышцами. В зависимости от препарата, части симпатической цепи могут быть уже видны в виде белых, косых волокон, параллельных позвоночнику. Их можно проследить вдоль SG.
  8. Осторожно используйте кончик щипцов Дюмона #5/45, чтобы обнажить соединительную ткань с боковой стороны мышцы longus colli.
  9. Поверните щипцы на 180° и используйте плоскую сторону, чтобы захватить SG и вытащить его с минимальным давлением.
  10. Повторите со вторым SG.
  11. Поместите оба SG в тарелку (диаметром 6 см), наполненную холодным PBS, и осмотрите с соответствующим увеличением. При необходимости удаляют лишние сосуды, жировую ткань, более крупные нервы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вегетативные ганглии окружены соединительнотканевой капсулой, состоящей из коллагеновых волокон и фибробластов26,27. Проницаемость этих капсул, по-видимому, варьируется между видами, различными видами ганглиев26 ивозрастом 28. Удалите как можно больше соединительной ткани с помощью щипцов Dumont #5/45 и, при необходимости, пружинных ножниц.
  12. В зависимости от цели эксперимента переходите к разделу 2, 3 или 5 этого протокола.

2. Протокол иммуногистохимии всей горы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из сердечных целых окрасок4,29. Выполните этапы инкубации для каждого отдельного SG в одной скважине 96-скважинной пластины и используйте от 100 мкл (для растворов, содержащих антитела) до 200 мкл (для всех других растворов) раствора для обеспечения полного покрытия. Регулярно проверяйте покрытие и корректное погружение СГ в бинокль. Удалите жидкости вручную с помощью пипетки объемом 200 мкл с дополнительным наконечником объемом 10 мкл поверх наконечника объемом 200 мкл. Это предотвратит аспирацию СГ в наконечнике пипетки. Используйте свежеприготовленные растворы и стерильные жидкости для предотвращения роста бактерий.

  1. Фиксируйте SG для гистологии в течение 2 ч при RT в 4% параформальдегиде (PFA)/PBS без метанола.
  2. Обрабатывайте SG как можно быстрее, но их можно хранить в течение 2-4 недель при 4-6 °C в PBS с 0,02% (мас./об.) азида натрия на этом этапе.
  3. Готовят суданский черный раствор (1% суданский черный с в/в 100% этаноле) для снижения автофлуоресценции и улучшения отношения сигнал/фон30. Растворить в течение 2-3 ч на магнитной мешалке при РТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте запасной раствор максимум 6-8 недель, выбрасывайте раньше при появлении седиментации.
  4. Готовят суданский черный рабочий раствор путем центрифугирования запасного раствора в течение 30 мин на полной скорости (13 000 х г)для удаления мусора и разбавления запаса в 70% этаноле до конечной концентрации 0,25% суданского черного.
  5. Обработайте SG отбеливателем Дента для улучшения пермеабилизации антител31. Свежеприготовьте отбеливатель Dent' путем смешивания метанола (MeOH), раствора перекиси водорода 30% (мас./мас.) вH2Oи диметилсульфоксида (DMSO) в соотношении 4:1:1. Добавьте 200 мкл на SG и поместите пластину на орбитальный шейкер на 1 ч при RT.
  6. Выполните нисходящую серию MeOH для регидратации путем инкубации в течение 10 минут каждая на орбитальном шейкере: 100% MeOH, 75% MeOH / PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
  7. Выполняют пермеабилизацию путем инкубации SG дважды в течение 60 мин каждый в PBS/1% Triton-X-100 на RT.
  8. Удалите раствор для пермеабилизации из SG и добавьте суданский черный рабочий раствор. Инкубировать в течение 2 ч на RT на орбитальном шейкере.
  9. Тем временем приготовьте блокирующий раствор, добавив 5% рецепторный сывороточный альбумин (BSA) и 0,1% Тритон-Х-100 в PBS в сосуд емкостью 15 мл и дайте ему раствориться на валике в течение примерно 5-10 минут. Декантировать через предварительно плиссированный бумажный фильтр для удаления мусора.
  10. Удалите суданский черный очень осторожно, наклонив пластину и тщательно пипетировку с вертикальной стороны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможно увидеть SG в Судане черным. Используйте сильный источник света и работайте медленно. С этого шага SG окрашиваются в черный цвет, улучшая видимость. Если в этот момент вокруг SG видна какая-либо дополнительная соединительная ткань, удалите ее с помощью щипцов Dumont #5/45 и пружинных ножниц.
  11. Добавьте 200 мкл PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) и промывайте в течение 5 мин при RT на орбитальном шейкере.
  12. Удалите PBS-T, аспирируя его пипеткой и повторите 2 раза.
  13. Удалить PBS; добавить 200 мкл блокирующего раствора и инкубировать при 4 °C в течение ночи на орбитальном шейкере.
  14. На следующий день готовят растворы, добавляя в блокирующий раствор первичные антитела. Адаптировать концентрации антител из установленных протоколов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включить один SG в качестве контроля антител без первичного антитела (инкубированного с антиген-преабсорбированным антителом или IgG, если доступно, или блокирующего буфера).
  15. Проводят первичную инкубацию антител в течение 36-48 ч при 4 °C на орбитальном шейкере. Для измерения размера клеток и окрашивания симпатических нейронов используйте антитела против тирозингидроксилазы (см. Таблицу материалов для рекомендаций по антителам).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите 96-скважинную пластину во влажную камеру (например, пластиковую коробку, выстленную бумажными полотенцами ddH2O), чтобы предотвратить испарение в этот момент.
  16. Осторожно удалите раствор антител и добавьте 200 мкл PBS-T. Поместите пластину на орбитальный шейкер на 30 мин.
  17. Удалите PBS-T и повторите шаг стирки еще 5 раз.
  18. Готовят раствор вторичного антитела, работающего путем центрифугирования флуоресцентных вторичных антител, меченых Alexa, в течение 1 мин на полной скорости (13 000 х г)перед использованием. Развести соответствующие вторичные антитела согласно первичным антителам 1:500 в блокирующем растворе и добавить к SG. Добавить 1 мкг/мл бисбензимида H33342 тригидрохлорида (окрашивание Hoechst), если требуется ядерное окрашивание. Инкубировать в течение 12-24 ч при 4 °C на орбитальном шейкере.
  19. Осторожно удаляют раствор антител и добавляют 200 мкл PBS-T. Поместите пластину на орбитальный шейкер на 30 мин.
  20. Удалите PBS-T и повторите шаг стирки еще 5 раз. На последнем шаге используйте PBS без Triton.
  21. Для встраивания выкладывают 50-100 мкл флуоресцентной монтажной среды (см. Таблицу материалов)на стеклянную горку и ставят под подготовку бинокль. Используйте щипцы Dumont #5/45, чтобы поднять SG из 96-скважинной пластины и удалить лишнюю жидкость, окунув один конец на фильтровальную бумагу (например, сушилочную подушку Whatman) и поместите ее на каплю.
  22. Используйте щипцы Дюмона #5/45 для коррекции позиционирования с соответствующим увеличением.
  23. Аккуратно поместите стеклянную крышку (20 мм х 20 мм) рядом с SG и медленно опуститесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование слишком большого количества монтажной среды приведет к движению SG или запутывания нервов. Если это произойдет, быстро снимите крышку и повторите шаги 2.9-2.21.
  24. Дайте слайдам высохнуть в темноте на ночь при RT. Хранение окрашенного образца возможно в течение не менее 4-6 недель при 4 °C.

3. Гибридизация всего крепления in situ

ПРИМЕЧАНИЕ: Цельномонтная in situ-гибридизация SG адаптирована из органа корти32 и коммерческого протокола флуоресценции РНК in situ (см. Таблицу материалов). Получите зонды для интересующих генов, буферы и растворы от поставщика. Все этапы инкубации выполняются на RT, если не указано иное. Используйте стерильный PBS. Если вы заинтересованы в окрашивание нескольких SG в одной скважине, используйте не менее 150 мкл буферов и растворов.

  1. Выполните рассечение СГ, как описано в шагах 1.1-1.13.
  2. Фиксируйте SG в течение 1 ч в 200 мкл 4% MeOH-free PFA/PBS в одной лунке 96-луночной пластины, размещенной на орбитальном шейкере.
  3. Промывайте SG три раза в течение 30 мин каждый в 0,1% Tween-20/PBS на орбитальном шейкере.
  4. Обезвоживание SG в серии MeOH/PBS путем последующей инкубации в 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS и 100% MeOH в течение 10 мин каждый на орбитальном шейкере.
  5. Хранить SG при -20 °C в 100% MeOH на ночь.
  6. На следующий день предварительно прогреть инкубатор до 40 °C. Проверьте температуру с помощью термометра.
  7. Регидратировать SG в обратной серии MeOH/PBS (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) в течение 10 мин каждый.
  8. Промыть SG три раза по 5 мин каждый в PBS.
  9. Тем временем начните предварительный прогрев зондов путем инкубации при 40 °C в течение 10 мин с последующим охлаждением в течение 10 мин.
  10. Инкубировать SG в 200 мкл протеазы III в течение 15 мин.
  11. Факультативно: Проводить лечение суданским черным цветом для гашения автофлуоресценции в соответствии с разделами 2.3, 2.4 и 2.8 настоящего протокола, если планируется последующее иммунофлуоресцентное окрашивание.
  12. Промывайте SG в 200 мкл 0,1% Tween-20/PBS 3x в течение 5 мин каждый на орбитальном шейкере.
  13. Дополнительно: Если требуется совместное окрашивание с несколькими зондами, разбавьте зонд Channel-2 (50x) и Channel-3 (50x) в зонд Channel-1 (1x).
  14. Покрыть SG 100 мкл зонда для интересуемого гена и инкубировать в течение ночи при 40 °C с легким перемешиванием. Поместите 96-скважинную пластину во влажную камеру при 40 °C на всех этапах инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите один SG в качестве отрицательного контроля, используя зонд против бактериального гена (например, дигидро-дипиколинатредуктазы, Dapb)для проверки неспецифического связывания реагентов амплификации на более поздних этапах.
  15. Мойте SG в прилагаемом моющий буфер 3x в течение 15 мин каждый на орбитальном шейкере.
  16. Предварительно нагрейте Amp1-3, HRP-C1 и HRP-Blocker до RT. Если желательно совместное окрашивание с зондом Channel-2 и/или Channel-2, предварительно нагрейте HRP-C2 и HRP-C3.
  17. Повторное исправление SG в течение 10 мин на RT в 4% PFA/PBS на орбитальном шейкере.
  18. Промывайте SG в 200 мкл прилагаемого промывного буфера 3x в течение 5 мин каждый на орбитальном шейкере на RT.
  19. Для усиления инкубируют SG со 100 мкл Amp1 в течение 35 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  20. Осторожно удалите любую жидкость и промыть SG в 200 мкл прилагаемого промывного буфера 3x в течение 5 минут каждый на RT на орбитальном шейкере.
  21. Инкубировать SG со 100 мкл Amp2 в течение 35 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  22. Повторите шаг 3.18.
  23. Инкубировать SG со 100 мкл Amp3 в течение 20 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  24. Повторите шаг 3.18.
  25. Инкубировать SG со 100 мкл поставляемого мультиплекса FL v2 HRP-C1 в течение 20 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  26. Повторите шаг 3.18.
  27. Готовят опал-конъюгированное вторичное антитело 1:1000 в 200 мкл поставляемого TSA-буфера и инкубируют SG в течение 35 мин при 40 °C на орбитальном шейкере. Защищайте от света во время инкубации и от этого шага.
  28. Повторите шаг 3.18.
  29. Инкубировать SG в 100 мкл поставляемого Мультиплексного FL v2 HRP-блокатора в течение 15 мин при 40 °C на орбитальном шейкере.
  30. Повторите шаг 3.18.
  31. Дополнительно: Для совместного окрашивания с помощью зонда Channel-2 повторите шаги 3.25-3.30 с поставляемым в комплекте Мультиплексом FL v2 HRP-C2.
  32. Дополнительно: Для совместного окрашивания с помощью зонда Channel-3 повторите шаги 3.25-3.30 с поставляемым в комплекте Мультиплексом FL v2 HRP-C3.
  33. В случае последующего иммунофлуоресцентного окрашивания выполните шаги 2.13-2.25 настоящего протокола.
  34. Инкубировать в 1% BSA/PBS в течение 30 мин на орбитальном шейкере.
  35. Инкубировать SG в течение 30 мин в 1 мкг/мл бисбензимида H33342 тригидрохлорида (окрашивание Hoechst) в 1% BSA/PBS, если желательно ядерное окрашивание, и/или добавлять Алекса-связанный агглютинин зародышей пшеницы (WGA, 1:500) на орбитальный шейкер.
  36. Повторите шаг 3.18.
  37. Внедрить, как описано в шагах 2.19-2.22.

4. Визуализация и анализ мышиных звездчатых ганглиев

  1. Выполните конфокальную микроскопию встроенного SG в локальном средстве визуализации.
  2. Если требуется измерение размера ячейки, изображение SG окрашивают на тирозингиплексилазу (см. Таблицу материалов)с 200-кратным увеличением и получают 4-6 случайных изображений из каждого SG.
  3. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения ImageJ33 для оценки размера ячейки (например, с помощью таблицы перьев, см. Таблица материалов). Используйте свободный выбор рук,обведите каждую ячейку и нажмите «Анализировать | Измерьте, чтобы получить площадь ячейки. Будьте осторожны, чтобы включить только неповрежденные, полностью видимые клетки, которые расположены хорошо в пределах SG.
  4. Используя этот метод, выполняют измерение примерно 100 клеток на SG.
  5. Попрошайки ослепленного исследователя выполнить шаги 4.2-4.3, если вы хотите сравнить SG у разных мышей. Используйте частотное распределение в статистическом программном обеспечении для визуализации различий в размерах между группами34.

5. Молекулярный анализ мышиных звездчатых ганглиев

ПРИМЕЧАНИЕ: Включите элементы управления в зависимости от вашего экспериментального проекта. Это может быть SG с различными генотипами и фоном заболевания и / или другими вегетативными ганглиями, такими как симпатический верхний шейный ганглий (расположенный в области шеи, см. подробное описание в Ziegler et al.35)или парасимпатические ганглии (такие как внутрисердечные ганглии, см. Jungen et al.4).

  1. Приготовьте пробирку объемом 2 мл с 500 мкл раствора фенола/гуанидина тиоцианата (например, Qiazol) на каждое животное и подготовьте жидкий азот, готовый к ударной глазури, или рассмотрите коммерческие решения для защиты РНК (необязательно, см. Таблицу материалов)36. Работайте быстро для выделения РНК.
  2. Выполните рассечение СГ, как описано в шагах 1.1-1.13.
  3. Немедленно погрузить оба SG непосредственно в одну трубку с раствором фенола/гуанидина тиоцианата и ударно-морозную трубку в жидкий азот.
  4. Хранить при -80 °C до дальнейшей обработки.
  5. Для лизиса тканей дайте пробиркам с SG разморозиться до тех пор, пока раствор фенола/гуанидина тиоцианата не будет разжижен, и добавьте два шарика из нержавеющей стали диаметром 7 мм. Охладите металлические части тканевого гомогенизатора (шаровая или смесительная мельница, например, Tissue Lyser II) на сухом льду и центрифуге при 4 °C.
  6. Центрифужные трубки при 500 х г в течение 1 мин при 4 °C так, чтобы SG были в нижней части трубки.
  7. Поместите трубки в металлические части тканевого лизера и лизейте в течение 1 мин при 20 Гц.
  8. Повторяйте шаги 5.6 и 5.7 до 5 раз, пока не обнаружится неповрежденная ткань.
  9. Переложите жидкость в свежую пробирку объемом 1,5 мл.
  10. Выполните изоляцию РНК с помощью комплекта изоляции РНК на основе колонки (например, мини-комплект miRNeasy) в соответствии с инструкциями производителя.
  11. Элютивная РНК в 20 мкл воды без РНКазы и измерение концентрации с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы исключить загрязнение очищенной РНК геномной ДНК, мы предлагаем выполнить полимеразную цепную реакцию с геномными праймерами и 1 мкл РНК в качестве шаблона, вместо этого за вычетом контроля обратной транскриптазы. Это позволит сэкономить значительное количество РНК. Если РНК загрязнена, используйте граничные праймеры экзон-интрон или интронные фланк-праймеры для последующей количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.
  12. Используйте 250 нг SG РНК для выполнения синтеза кДНК и используйте установленные протоколы. Здесь был использован высокопроизводимый комплект обратной транскрипции кДНК в соответствии с инструкциями производителя.
  13. Разбавляют до конечной концентрации 2,5 нг/мкл кДНК и проводят количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени с соответствующими зондами в соответствии с установленными протоколами. Здесь анализ TaqMan (см. Таблицу материалов)проводили с использованием 10 нг кДНК на реакцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните контроль без шаблона для каждого гена, чтобы исключить ложноположительные результаты.
  14. Нормализуйте экспрессию гена, который представляет интерес для вашего гена на гене домохозяйки (например, Cdkn1b),чтобы сравнить относительную экспрессию генов между различными группами SG.

Результаты

На рисунке 1 визуализируется, как идентифицировать и препарировать SG. На рисунке 1A показан схематический рисунок местоположения, в то время как на рисунке 1B представлен вид на грудную клетку после удаления пакета сердце-легкое. Левая и пр...

Обсуждение

Понимание клеточных и молекулярных процессов в нейронах и глиальных клетках симпатической нервной системы, которые предшествуют началу ВА, представляет большой интерес, так как внезапная остановка сердца остается наиболее распространенной причиной смерти во всем мире5. ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Хартвига Вибольдта за его отличную техническую помощь и Центр микроскопической визуализации UKE (Umif) Университетского медицинского центра Гамбург-Эппендорф за предоставление микроскопов и поддержку. Это исследование финансировалось DZHK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований) [FKZ 81Z4710141].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateTPP92097RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.Serva11924.03Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Drying block 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Whole mount staining
Eosin YSigma AldrichE4009Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Whole mount staining
Eukitt mounting mediumAppliChem253681.0008Whole mount staining
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kitLife technologies 4368813RNA isolation
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Preparation SG
Mayer's hemalum solutionMerck1.09249.0500Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smallerMarienfeld0101040Whole mount staining
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA isolation
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CRNA isolation
Opal 570 Reagent PackAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar43368Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco18912-014Whole mount staining
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Preparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen 79306RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
RNAlaterMerckR0901-100MLRNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Stainless steel beads 7 mm Qiagen 69990RNA isolation
Sudan black BRoth0292.2Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan mastermixApplied biosystems4370074Gene Expression analysis 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA isolation
Triton X-100 10% solutionSigma-Aldrich93443-100mlWhole mount staining
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom bamboo penWacomCTL-460/KCell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 ConjugateThermo Fisher ScientificW21404RNAscope

Ссылки

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

166

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены