В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В следующей работе мы описываем последовательные шаги, необходимые для создания большого биобанка колоректального и поджелудочного рака.

Аннотация

В свете растущих знаний о межиндийных свойствах и неоднородности раковых заболеваний, формирующаяся область персонализированной медицины требует платформы для доклиникологических исследований. За последние годы мы создали биобанк колорект колоректального и поджелудочного рака, состоящий из первичной опухолевой ткани, нормальной ткани, сыворотки, изолированных периферических лимфоцитов крови (PBL), ксенотрансплантатов пациентов (PDX), а также первичных и вторичных линий раковых клеток. Поскольку первоначальная опухолевая ткань ограничена, а скорость установления первичных линий раковых клеток по-прежнему относительно низка, PDX позволяет не только сохранить и продлить биобанк, но и генерацию вторичных линий раковых клеток. Кроме того, было доказано, что модели PDX являются идеальной моделью in vivo для доклинкического тестирования на наркотики. Тем не менее, биобанкинг требует тщательной подготовки, строгих руководящих принципов и хорошо настроенной инфраструктуры. Colectomy, duodenopancreatectomy или resected образцы метастазов собираются сразу после ресекции и передаются в отделение патологии. Уважая приоритет беспристрастного гистопатологического отчета, по усмотрению лечащий патологоанатом, который проводит вскрытия, собирают мелкие опухолевые кусочки и неохуморную ткань.

Некротические части отбрасываются, а оставшаяся опухолевая ткань разрезается на мелкие, идентичные кубики и криоконсервирована для более длительного использования. Кроме того, небольшая часть опухоли фарш и напряженной для первичной культуры раковых клеток. Кроме того, образцы крови, взятые у пациента до и послеоперационно, обрабатываются для получения сыворотки и ПБЛ. Для PDX engraftment криоконсервированные образцы размораживаются и имплантируются подкожно в фланги иммунодефицитных мышей. В результате PDX тесно повторить гистологии "донорских" опухолей и может быть использован для последующего ксенотрансплантации или криоконсервированных для последующего использования. В следующей работе мы описываем индивидуальные этапы создания, обслуживания и администрирования большого биобанка колоректального и поджелудочного рака. Кроме того, мы подчеркиваем важные детали и предостережения, связанные с биобанкингом.

Введение

В последние годы накопленные знания о морфологических, клинических и генетических свойствах рака привели к зачатию рака как неоднородного, индивидуального заболевания. Следовательно, мутационная характеристика неоплазм, помимо клинических и патологических особенностей, приобрела важное значение для принятия клинических решений, и многие целевые методы лечения были разработаны для различных молекулярных изменений. Например, эффективность cetuximab в лечении колоректального рака можно предсказать путем анализа KRAS и PIK3CA мутационного статуса1. Точность медицины направлена на индивидуальный подход, чтобы обеспечить самый высокий ответ лечения в каждом пациенте и избежать токсичности неэффективной терапии2. Биобанки содержат ткани, кровь и другие биологические материалы онкологических больных, которые связаны с клиническими данными, и, таким образом, являются отличным инструментом для трансляционных исследований рака. Из-за большого количества клинических образцов, биобанки позволяют обнаруживать редкие, но потенциально наркотические мутации, что предоставляет новые возможности лечения для отдельного пациента3.

Чтобы охватить как можно более широкий спектр онкологических исследований, мы не сдерживали нашу активность только по сбору образцов, а сосредоточились на создании линий раковых клеток, полученных пациентом, и ксенотрансплантатов (PDX). Традиционные 2D клеточные линии остаются угловым камнем исследований in vitro и являются главным выбором для крупномасштабныхскринингов наркотиков 4,5. Кроме того, анализ клеточной линии часто проще, дешевле и доступнее. Дополнительно, в виду того что пациент-производные периферические лимфоциты крови (PBL) имеющиеся, также иммунология тумора можно изучить in vitro6. Тем не менее, большинство недавно разработанных препаратов с перспективными доклинической эффективностью в клеточной основе in vitro или in vivo эксперименты, показали неутешительные результаты в клиническихиспытаниях 7. В отличие от этого, доклинические исследования, основанные на PDX in vivo исследования отражают клиническую активность антинеопластических агентов гораздо более точно8. Поскольку ткань PDX тесно отражает гистологические и молекулярные свойства донорской опухоли, модели PDX являются хорошим способом распространения часто очень ограниченного количества жизнеспособных опухолевых тканей для поддержания целостности биобанка и обеспечения обмена образцами между исследовательскими группами и учреждениями. Кроме того, линии раковых клеток, полученные из ткани PDX могут быть установлены значительно проще, чем первичные линии раковыхклеток 9. В последние годы наша рабочая группа создала всеобъемлющий комплексный биобанк колоректального и поджелудочного рака путем пошаговой стандартизации и оптимизации рабочего потока для всех биологических образцов, о которомидет речь (рисунок 1).

figure-introduction-3265
Рисунок 1: Рабочий процесс и организация биобанка Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

протокол

Следующее исследование было одобрено институциональным советом по обзору Университетского медицинского центра Росток (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 и A 2019-0222). Кроме того, все ветеринарные соответствующие процедуры были утверждены Landesamt f'р Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern под регистрационными номерами LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 и 7221.3-1-007/19.

1. Экспериментальные предпосылки

  1. Выполнить несколько важных рамочных условий для создания и поддержания биобанка.
    1. Используйте клинику с хирургическим отделением и достаточным количеством онкологических ресекций вместе с хорошо оборудованной лабораторией и достаточным академическим персоналом. Хорошей инфраструктурой и твердой связью с сотрудничающим патологическим отделением являются дополнительные предпосылки.
    2. Для исследований in vivo используйте животное учреждение с жилищными условиями, подходящими для иммунодефицитных мышей.
    3. Получить разрешение на любое исследование материалов, полученных от пациентов, в комитете по этике здравоохранения. Получить одобрение на любые исследования in vivo от компетентного органа в соответствии с местными нормативными актами.

2. Сбор образцов

  1. За день до операции
    1. Оцените всех пациентов с ресектаблным колоректальным или поджелудочной раком и/или соответствующими метастазами для биобанкинга. Избегайте включения случаев с неоадъювантной предварительной обработки, очень маленькие опухоли, опухоли неопределенного достоинства или поражения, которые были частично resected эндоскопически раньше.
    2. Получить письменное одобрение участия пациента во время информированного обсуждения согласия о хирургической процедуре. Своевременно информируют всех задействованных хирургов, лабораторную команду, а также патологоанатома.
  2. Приобретение образцов
    1. Сообщите всем обслуживающему персоналу в отделении (OR) о сборе тканей для биобанка непосредственно перед началом хирургической процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы ткань не должна быть зафиксирована в формалине. Если ткань погружена в формалин, она становится непригодной для комплексного биобанкинга.
    2. Нарисуйте 40 мл гепаринизированной крови (2 х 20 мл шприца), а также стандартную трубку сыворотки 7,5 мл сразу после анестезии индукции и быстро перенесите в лабораторию для изоляции PBL и обработки сыворотки (см. шаг 3-4).
    3. Получить ресектированную образец непосредственно с операционного стола, поместить его в соответствующий контейнер и отвезти в патологическое отделение. Запишите временную точку отрыва от кровообращения, ресекции и прибытия при патологии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пригодность образца для био-банкинга должна быть оценена сотрудничающий патологоанатом, который вскрывает кусок опухоли и не злокачественных тканей. Не акцизных каких-либо частей образца самостоятельно, которые могут поставить под угрозу последующего патологического доклада.
    4. Поместите обе части ткани в отдельную полипропилевую трубку объемом от 15 до 50 мл с раствором для хранения тканей 10-30 мл (или DPBS) на льду. Запишите время получения и немедленно перенесите образцы в лабораторию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы протокола 3-6 должны проводиться в шкафу ламинарного потока в строгих стерильных условиях. Используйте все жидкости при комнатной температуре.

3. Обработка сыворотки

  1. Центрифуга 7,5 мл сывороточной трубки при 1128 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 15 мин в предварительно охлажденой центрифуге.
  2. Aliquot 1 мл сыворотки на трубку в предварительно помеченных криотрубок и заморозить в жидком азоте.

4. Изоляция PBL по плотности градиентной центрифугации

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа параллельно с каждым из двух шприцев 20 мл.

  1. Заполните 20 мл гепаринизированной крови в полипропиленую трубку 50 мл и добавьте 15 мл DPBS.
  2. Возьмите 15 мл Pancoll с серологическим пипеткой, вставьте пипетку тщательно всю дорогу до нижней части полипропилена трубки и отпустите Pancoll очень медленно, чтобы сформировать слой под кровью / DBPS колонке.
  3. Центрифуга при 375 x g в течение 15 мин без тормоза.
  4. Аспирировать и передавать непрозрачный межфазный слой между средней и верхней колонкой обоих образцов в свежую 50 мл полипропиленовой трубки и заполнить DPBS до 50 мл.
  5. Центрифуга при 270 x g в течение 15 мин с тормозом.
  6. Аспират и отбросить супернатант, повторно поместью клеточной гранулы в 4,5 мл морозильной камеры среды.
  7. Aliquot 1,5 мл подвески на криотруб, плотно закрыть трубки и поместить их в замораживающий контейнер подходит для медленного замораживания и хранить при -80 градусов по Цельсию.

5. Обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с генерации оснастки замороженных образцов опухоли и здоровой ткани для поддержания целостности нуклеиновых кислот.

  1. Образец опухолевой ткани
    1. Перенесите образец опухоли с помощью нескольких мл раствора хранения тканей из полипропилевой трубки в чашку Петри. При необходимости промыть DPBS. Избегайте прикосновения к образцу и используйте два стерильных скальпеля для обработки ткани. Избегайте высыхания в любое время.
    2. Взвесьте образец опухоли в удобном масштабе в отдельной тарелке и обратите внимание на вес ткани.
    3. Оцените размер, форму и качество тканей опухолевой ткани перед резки. Цель получить по крайней мере один кусок размером с булавочную головку для замораживания оснастки и четыре куба приблизительно 30 мм3 (длина края 3 х 3x 3 мм) каждый для жизненно важного криоконсервации. Создать как можно больше 30 мм3-кубов в четыре раза, как это возможно, и генерировать один кусок для оснастки замораживания на 5 четверных. Также примите во внимание, что некротические части должны быть отрезаны так, чтобы кубики состояли только из жизненно важных тканей.
    4. Создать ломтики толщиной 3 мм. Отрежьте некротические части, различимые как гелеобразная или жидкая масса, и нарежьте ломтики кубиками двух желаемых размеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не отбрасывайте ткани на данный момент.
    5. Snap замораживания
      1. Этикетка криотрубов соответственно (см. шаг 7.7).
      2. Поместите один маленький кусок ткани на предварительно помеченную криотрубу. Погрузив образцы сразу в жидкий азот в течение нескольких минут и хранить при -80 градусов по Цельсию впоследствии.
    6. Криоконсервация жизненно важных тканей
      1. Этикетка криотрубы соответственно (см. шаг 7.7) и заполнить каждый с 1,5 мл морозильной камеры среды. Поместите замораживающий контейнер рядом со скамейкой.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте следующим шагам как можно быстрее. Поскольку DMSO в морозильной камере имеет цитотоксические свойства, время погружения ткани в морозильную камеру среды без надлежащего охлаждения не должно превышать 2 минут.
      2. Упорядочить 30 мм3 куба в четыре раза. Бросьте некротические ткани и другие остатки к краю блюда, но не отбрасывайте их.
      3. Scoop кубов с лезвием скальпеля и передачи 4 кубиков на криотрубь. Убедитесь, что опухолевые части полностью погружены в морозильную камеру среды. Закройте трубки плотно и поместите их в морозильную камеру, подходящую для медленного замораживания, и храните в морозильной камере .80 градусов по Цельсию.
      4. Передача криотрубов в подходящую систему хранения для длительного хранения при -140 градусов по Цельсию или ниже. Документация в системе управления лабораторными запасами является обязательной.
  2. Здоровый образец ткани: Повторите шаги 5.1.1. до 5.1.6.4 для образца здоровых тканей.

6. Культура первичных клеток

  1. Распад остатков опухолевой ткани, в том числе некротического лома, в чашке Петри скальпелями на куски как можно меньше.
  2. Поместите стерильный клеточный ситечко (размер 100 мкм поры) поверх полипропиленной трубки 50 мл.
  3. Используйте серологическую пипету, чтобы добавить 5-10 мл DPBS в чашку Петри, плавать остатки ткани и пипетки вверх и вниз, чтобы генерировать подвеску.
  4. Перенесите подвеску с пипеткой на клеточный ситечко.
  5. Повторите шаги 6.3-6.4 до тех пор, пока все остатки ткани не будут решены из чашки Петри.
  6. Используйте поршень из 20 мл в одну сторону шприц, чтобы сжать клетки и ткани подвески через клетки ситечко.
  7. Промыть 5-10 мл свежего DPBS, отбросить клеточный ситечко и закрыть трубку должным образом.
  8. Центрифуга подвески на 180 х г в течение 5-10 минут.
  9. Подготовка коллагена-I precoated 6 хорошо пластины с 1,5 мл среднего на колодец.
  10. Аспирировать и отказаться от супернатанта. Переусердуйте гранулы в 3 мл DPBS или среднего и добавьте 500 мл подвески к каждой хорошо. Поместите пластину в инкубатор (100% влажность, 5% CO2, 37 градусов по Цельсию)
  11. Мониторинг пластины ежедневно для роста клеток и загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшее культивирование клеток до момента создания постоянной клеточной линии здесь не описано.

7. Поколение PDX

  1. Проводитьэксперименты i n vivo только соответствующими квалифицированными лицами, соответствующими требованиям компетентного органа вашей юрисдикции.
  2. Дом иммунодефицитных мышей в условиях, свободных от специфических патогенов (SPF), удовлетворяющих требованиям используемого штамма мыши. Гигиенические меры включают индивидуально проветриваемые клетки, автоклавную пищу, воду и вложенный материал, а также замок безопасности воздуха и ношение личного защитного оборудования.
  3. Автоклав все инструменты заранее и использовать только один набор инструментов для каждого случая опухоли, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Обработать опухолевые ткани как можно более асептические. Все пластиковые предметы, названные ниже, должны быть стерильными, одноразовыми и отбрасываются после каждой операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определяется методом замораживания четырех частей опухолевых тканей на криотрубку, поколение PDX требует всегда двух мышей на образец, в идеале в результате чего четыре опухоли PDX.
  4. Выбрать желаемую первичную опухоль для присытения через лабораторную систему управления запасами и перенести образец (жизненно сохранившуюся опухолевую ткань) из основного резервуара для хранения в переносной контейнер с жидким азотом (также удобно хранение при -80 градусов по Цельсию на сухом льду).
  5. Натейте средства индивидуальной защиты перед входом в SPF-секцию (скрабы, засорения, фартук, крышка для волос, хирургическая маска и оковы), дезинфицировать руки и все оборудование.
  6. Матригель замачивания
    1. Удалите криотрубки из контейнера с жидким азотом и ожидая оттаивания образца.
    2. Этикетка 50 мл полипропиленовой трубки и заполнить 35 мл DPBS.
    3. Наклоните криотруб вверх и вниз и немедленно перенесите содержимое в полипропиленовую трубку, как только ткань-средняя слякоть может быть сдвинута. Аккуратно промойте кусочки опухолевой ткани, выбросьте основной объем из трубки в отдельный сосуд, закройте крышку и положите трубку вверх-вниз, чтобы четыре части ткани собрались в крышке.
    4. Положите чашку Петри на охлаждающий аккумулятор и поместите 100 МКЛ Matrigel в качестве одной капли в середину. Используйте анатомические типсы для переноса опухолевых частей в Matrigel. Убедитесь, что каждая часть полностью покрыта Matrigel. Инкубировать в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
  7. Мышь анестезии (2 мышей на образец, работа параллельно)
    1. Приготовьте 3:1- запас кетамина (100 мг/мл) и ксилазина (20 мг/мл) обезболивающего раствора. Рекомендуемая доза составляет 90/6 мг/кг массы тела.
    2. Взвесить мышь и составить необходимый анестетический раствор в одноразовый инсулиновый шприц.
    3. Поместите мышь на сетку клетки, потяните хвост осторожно одной рукой, чтобы вызвать движение вперед и одновременно краба шею с щепоткой сцепление другой стороны. Поднимите мышь сетки и поверните держась за руку, так что спина животного лежит на ладони. Обездвижить одну из задних ног с мизинец и вводить наркотики intraperitoneally. Положите мышь обратно в клетку и ждать наркотической индукции.
    4. Поместите анестезированую мышь на нагревательной пластине и накройте глаза мази, чтобы избежать вреда роговицы. Оценивает глубину анестезии, аккуратно прищипая заднюю ногу мыши хирургическими щипсями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие движения указывает на глубокий наркоз. Любое движение либо требует больше времени для достижения желаемой наркотической глубины или дополнительной дозы анестезии.
  8. Хирургическая процедура
    1. Сформив складку кожи, ущипнув шею мыши и впрысните микрочип подкожно с аппликатором (см. шаг 9 для деталей программирования)
    2. При необходимости бритье флангов мыши (мышей NMRInu/nu не требуют бритья), нанесите пувидоне-йод ватным тампоном и используйте хирургическую драпировку для создания стерильного поля.
    3. Поднимите кожу фланга хирургическими типсами, сделайте небольшой разрез около 4 мм и сформив небольшой подкожный карман тупым препаратом ножницами.
    4. Положите один кусок опухоли в каждый карман и поместите его на задней части.
    5. Затмите конец наконечника пипетки на 100 йл и аспирировать оставшийся Матригель из чашки Петри и нанесите его поровну в каждый карман кожи.
    6. Закройте раны простыми прерванными швами и нанесите спрей-повязку.
  9. Сканирование микрочипа и проверка достоверности мыши и опухоли-ID.
  10. Приготовьте новую клетку со свежими постельными принадлежностями и вложенным материалом, а также грызут палку. Сложите «подушку» из бумажных полотенец и положите мышь с поднятой головой под инфракрасную тепловую лампу.
  11. Смешайте 0,25 мл триметоприма/сульфаметоксазола (400 мг/80 мг) со 100 мл питьевой воды и ввилите через питьевую бутылку. Учти, что одна мышь потребляет около 150 мл на кг массы тела в день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку подкожная PDX-модель не связана с послеоперационной болью, ни во время процесса заживления ран, ни во время роста опухоли послеоперационная анальгезия не требуется. Пожалуйста, обратите внимание, что руководящие принципы защиты животных вашего учреждения / органа могут отличаться.
  12. Мониторинг экспериментальных животных
    1. Мониторинг мышей ежедневно для признаков бедствия. Это может быть делегировано квалифицированным смотрителям животных.
    2. Следите за послеоперационным лечением антибиотиками с вышеупомянутой дозировкой в течение 4 недель. Замените смесь антибиотиков два раза в неделю.
    3. Измерьте размер опухоли по крайней мере один раз в неделю, в идеале ежедневно, с помощью калипера (объем опухоли 0,52 х длина х ширинах высота 3мм) и запись в базе данных.

8. Сбор и переработка PDX

  1. Урожай и процесс опухоли PDX, когда:
    Размер опухоли достигает целевого объема 1,500 мм3.
    Опухоль подшипник животных показывает признаки бедствия и / или болезни и лечение бесполезно.
    Опухоль становится язвенной или проникает в кожу мыши.
  2. Прочитайте микрочип, чтобы определить правильный PDX.
  3. Усыпляйте мышь законным методом (в зависимости от национальных руководящих принципов), как, например, CO2 -астиксацияили инъекция кетамина/ксилазина с последующим вывихом шейки матки.
  4. Поднимите кожу хирургическими типсами на флангах и наклоняй ножницами Метценбаума в нескольких миллиметрах от опухоли.
  5. Отсоедините кожу над опухолью тупым препаратом, затем аккуратно схватите опухоль анатомическими типсами и отсоедините опухоль от поверхностной фасции тела.
  6. Промыть опухоль DPBS, положить его в чашку Петри и удалить соседние соединительной ткани.
  7. На этом этапе выполните одно из следующих:
    1. Вырезать 30 мм3 кубов и создать новый PDX (Продолжить с протоколом в точке 7.7.4).
    2. Разрежьте опухоль на кусочки, которые затем передаются в гистологические кассеты и сохраняются в 4% формальдегиде для более поздней встраивания парафина.
    3. Сохранить опухоль в трубке с раствором хранения тканей, чтобы добавить его в биобанк (Продолжить с протоколом на этапе 3.) и / или создать PDX-производных клеточных линий (Продолжить с протоколом на этапе 4.)

9. Биобанк и управление данными

  1. Назначить внутренний идентификатор для каждого случая опухоли в соответствии с таблицей 1.
Расположение/название лабораториирак лицапоследовательное число случаевспецификацияпоследовательное число
Секоректальный_Met Метастазы
Пяреатико_Tu Опухоль
Пример: HROC389_Met2 Росток, колоректальный рак, случай 389, второй метастаз

Таблица 1: Определение идентификатора образца.

  1. Храните согласие пациента в электронной и бумажной форме вместе с опухолевым идентификатором.
  2. Соберите как можно больше клинических данных и храните их анонимно и отдельно.
  3. Используйте программное обеспечение для управления данными (например, Freezerworks) или другое и создайте интерфейс с программным обеспечением для печати этикеток для создания устойчивых к температуре, самоклеящихся меток штрих-кода.
  4. Добавьте новый образец, открыв программное обеспечение для управления данными, определите тип образца и заведите следующую информацию: идентификатор опухоли, тип ткани, метод замораживания, дата, ответственный сотрудник, номер прохода, идентификатор мыши и штамм мыши.
  5. Присвоить образцы определенным позициям в резервуаре для хранения.
  6. Отслеживание и мониторинг PDX (применяется к шагу 7-8)
    1. Используйте базу данных MS Access (или аналогичную систему) на портативном устройстве с поддержкой Bluetooth (ноутбук или планшет) для записи идентификатора опухоли, даты имплантации, даты эвтаназии, возраста мыши и деформации, а также роста опухоли с течением времени.
    2. Подключите считыватель микрочипов к устройству и зачитайте микрочип перед имплантацией.
    3. Назначьте определенный идентификатор каждой мыши; мы используем следующую схему: (см. таблицу 2 ниже)
    4. После имплантации замистив идентификатор вместе с характеристиками мыши в базе данных.
    5. Перечитайте микрочип и проверьте, соответствуют ли спецификации микрочипа, базы данных и этикетки криотруба.
    6. Создайте метку для каждой клетки мыши соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы создать физическое резервное время, придерживаться криотруб этикетки с соответствующими этикетками микрочипа в буклет и отметить дату и мыши деформации.
    7. Чтобы контролировать рост опухоли отдельных PDX, сканировать микрочип мыши с считывателем подключен к устройству базы данных для идентификации и записи размера опухоли измеряется калипером каждую неделю.
    8. Запланируйте идеальную точку времени сбора PDX, проанализировав кривую роста опухоли.
Опухоль-IDПредварительное хранение в N2 (Зф)Номер прохода (ЗТ)последовательный номер мыши (ЗМ)
Пример: HROP12 fT0 M1 - Росток, рак поджелудочной железы, случай 12, генерируемый из замороженных первичных тканей, первый проход, мышь 1.

Таблица 2: Определение идентификатора PDX.

Результаты

В наших руках, создание ставка первичных клеточных культур(рисунок 2A и B) составил 12,9% в большойсерии 9. Большинство попыток изолировать расширяемые опухолевые клетки от свежих хирургических ресектируемых образцов потерпели неудачу из-за отсутствия нарой или раннего загрязнения. Установка линии клетки была рассмотрена успешно после 3 проходов с устоичивым ростом под стандартными условиями культуры (DMEM, 10% FCS, стандартное сосуд культуры) и проверка эпителиальной дифференциации через FACS-анализ10. Клеточные линии, полученные из опухолей PDX (Рисунок 2C и D) показали более высокий уровень создания 23,6%, что также связано с возможностью повторяющихся попыток в отличие от первичных ресектных опухолей9. Тем не менее, некоторые смешанныекультуры (рисунок 2E) не могут быть освобождены от фибробластического роста или даже теряются из-за фибробластического разрастание (Рисунок 2F).

figure-results-1206
Рисунок 2: Культура клеток. Первичные линии раковых клеток, полученные из метастазов рака толстой кишки случае HROC313, проход 21 (A) и рак поджелудочной железы случае HROP88, проход 5 (B). PDX полученных раковых клеток линий толстой кишки PDX HROC285 T0 M2 (D) и поджелудочной железы PDX HROP10 T5 M2, проход 4 (E). Смешанная культура фибробластов и раковых клеток от рака поджелудочной железы HROP75, прохождение 8 (C) и фибробластический разрастание (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Учитывая изменения в протоколе генерации PDX, используемые штаммы мыши, а также экспериментаторы в течение нескольких лет, а также большие различия в количестве опухолевых тканей, доступных для присвещания, это не тривиально, чтобы дать общий показатель успеха pdX поколения. В недавней серии экспериментов поколения PDX, выполненных двумя исследователями (S.M. и F.B.), наблюдались первичные показатели роста 63% для колоректального PDX (образцовая гистология может быть изображена на рисунке 3A)и 48% для поджелудочной железы PDX (рисунок 3B). Нароение мурина или человеческих лимфом в месте имплантации является относительно редким, но может имитировать успешный результат PDX(рисунок 3C). Помимо гистопатологического обследования, согласие между моделями PDX и их пациентами-донорами регулярно подтверждалась коротким тандемным повторным (STR) анализом(рисунок 3D). По сей день биобанк включает в себя >50 первичных и >50 вторичных колоректальных, 3 первичных и 6 вторичных линий раковых клеток поджелудочной железы, а также >150 колоректальных и 19 моделей поджелудочной железы PDX.

figure-results-3242
Рисунок 3: Представитель гистологического сравнения колоректального (А) и поджелудочной железы PDX (B). Лимфома человека в месте имплантации имитирует нароение PDX (C). Генетическое тестирование личности модели PDX (HROC430 T1 M2) на исходную опухолевую ткань пациента (HROC430Tu) путем короткого тандемного повторного (STR) анализа. Сравнение девяти STR локусов, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (краситель FAM) и D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX краситель) с использованием мультиплекса PCR с флуоресцентными маркировкой грунтовки после капиллярного электрофореза подтвердил генетическое согласие PDX и донора (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Поколение живого биобанка предполагает, помимо соблюдения правовых норм конфиденциальности, медицинского права и благополучия животных, хорошую инфраструктуру и хорошо скоординированную команду. Оказалось выгодным непосредственно привлекать часть хирургического персонала к исследовательским процедурам, так как они вполне могут оценить пригодность отдельного пациента для донорства тканей. Кроме того, пациенты, как правило, соглашаются с биобанкингом чаще, когда их письменное одобрение получено в ходе обсуждения хирургического информированного согласия. Чтобы сэкономить время и ресурсы, случаи, которые, предположительно, принести недостаточное количество опухолевой ткани не должны быть выбраны для биобанкинга. Когда дело доходит до приобретения образцов, максима "коммуникация является ключевым" является простым, но часто упускается из виду правда. Требуется всего одна неосведомленная театральная медсестра или коллега-хирург, чтобы разрушить образец с самого начала, продолжая, как обычно, и добавляя формальдегид к образцу ресекции. Поэтому крайне важно, чтобы каждый сотрудник, участвовавший в этом, знакомился с SOP для биобанкинга. Хирурги должны быть замечены накануне и в начале процедуры о запланированном сборе тканей. Кроме того, случаи, отобранные для биобанкинга, должны быть выделены в электронном плане ОР. Сбор тканей из хирургического образца должен проводиться патологоанатомом. Во-первых, это гарантирует, что сбор тканей не мешает окончательному патологическому отчету. Во-вторых, это увеличивает вероятность получения тканей с достаточным количеством жизнеспособных раковых тканей. Особенно при раке поджелудочной железы с выраженной десмопластической реакцией и частыми некротическими областями, жизнеспособные части трудно определить макроскопически для неопытного глаза. В качестве исключения из этого правила, блоки тканей из крупных печеночным или легочных метастазов, иногда могут быть вырезаны "за столом" хирургом, если хирургические поля могут быть определены макроскопически. Ректальный рак, ресектированный общим мезоректальным иссечением (TME), может быть не подходит для биобанкинга, так как сбор тканей из ресектированного образца до встраивания парафина может помешать оценке качества TME. Кроме того, ткани для биобанкинга могут быть приобретены путем трансанальной биопсии рака прямой кишки.

Показатели установки для первичных клеточных культур, полученных из первоначальной опухоли, как правило, низки. КУЛЬТУРы вторичных клеток, полученные pdX, скорее всего, могут быть успешно установлены. Мы рекомендуем тестирование различных средств массовой информации для каждого случая и использование антибиотиков добавки для первых проходов, чтобы уменьшить загрязнение до минимума, так как собранные ткани редко стерильны. После успешного распространения, каждая индивидуальная линия клеток должна быть подтверждена в качестве линии раковых клеток путем анализа FACS и регулярно проверяется на загрязнение микоплазмы. Чтобы исключить перекрестное загрязнение, рекомендуется регулярный анализ STR. Следует отметить, что протокол создания первичных и вторичных клеточных линий постоянно подвергается оптимизации. Подробная информация о составе и успехах отдельных средств массовой информации явно выходит за рамки этой работы и будет опубликована отдельно.

Для PDX engraftment, опухолевая ткань может быть имплантирована непосредственно после ресекции или криоконсервирована в сыворотке матки плода с 10% DMSO или аналогичные средства замораживания для задержки имплантации. Имплантация сразу после сбора опухолевых тканей создает нагрузку на логистический и лабораторный персонал, а результаты ксенотрансплантации после криоконсервации совсем не уступают 10. Кроме того, инкубация тканей в Matrigel до имплантации опухоли, значительно увеличивает скорость резплантации12. Рекомендуем отложить присвечение после определенного патологического нахождения и немедленного удаления ошибочно собранных образцов тканей. Так как уровень успеха первичного engraftment увеличивается с иммунодефицитом мыши-реципиента, мы склонны использовать NSG мышей для самого первого прохода PDX. После первого успешного pdX engraftment, NMRInu/nu мыши могут и должны быть использованы для последующих проходов и расширения тканей. Этот штамм является более надежным, дешевле и легче размножаться по сравнению с NSG или аналогичных иммунодефицитных штаммов, но по-прежнему показывает разумные показатели резвятся. Кроме того, его обнажение облегчает имплантацию и мониторинг роста опухоли. Для увеличения скорости присвещания в последующих проходах, мы рекомендуем прямую передачу свежесобранных тканей PDX для размещения мышей, когда это возможно, особенно для медленно растущего PDX и случаев с низким уровнем успеха первичного engraftment. Коллинз и Ланг недавно рассмотрели 14 исследований колоректального PDX создания и сообщили, что уровень приразделения варьируются от 14 до 100% со средним показателем PDX создания 68%, последний в соответствии с нашимивыводами 13. В соответствии с литературой, мы наблюдали более низкие показатели создания поджелудочной железы по сравнению с колоректальным раком PDX14. Независимо от штамма мыши хозяина и опухоли лица, рост человека, Вирус Эпштейна-Барра (EBV)-ассоциированных В-клеточных лимфом и лимфомы мурина на стороне имплантации представляет собой важнуюловушку 15,16. Если непризнанные, такие опухоли могут "загрязнять" последующие проходы и тем самым путать последовательные результаты. Необычный быстрый рост PDX и отек шейки матки, аксиллара и паховой лимфатических узлов являются сильными показателями роста лимфомы мурина, но регулярное гистологическое обследование PDX, тем не менее, целесообразно. Кроме того, генетическое согласие между PDX и соответствующим донорским пациентом должно регулярно проходить тестирование с помощью STR-анализа. В идеале биобанк должен быть связан с клинической базой данных, включающей характеристики пациентов (общая информация, выживаемость, свободное от рецидивов выживание, терапия, вторичная неоплазия и т.д.). В связи с правовыми нормами защиты конфиденциальности и отсутствием такой анонимной базы данных, наш клинический набор данных регулярно управляется и обновляется вручную сотрудничающих врачей.

В то время как обычные биобанки ограничиваются исследованиями обсерватории, живой биобанк предоставляет возможность для вмешательства in vitro и in vivo. Клеточные линии, полученные пациентами, являются важным инструментом фундаментальных исследований, высокопроизводительных скринингов лекарственных средств и оценки новых фармацевтическихагентов 4. Соответствующие модели PDX, однако, имеют все большее значение, так как они тесно повторить гистологииоригинальной опухоли 17,18 и показать высокую генетическую стабильность в течениенескольких проходов 19,20. Наш биобанк PDX зарекомендовал себя как отличная платформа для доклинических и фундаментальныхисследований 6,21. Кроме того, поскольку большие коллекции PDX адекватно отражают межличностную неоднородность популяции пациентов, подход к клиническим испытаниям PDX (PCT) (одно животное на модель на лечение) приобрел важное значение для разработки лекарств, поскольку он позволяет точно прогнозировать клинические реакции на новые препараты и комбинаторныйрежим 8. В настоящее время мы также оцениваем новые экспериментальные препараты в небольших испытаниях РСТ.

Несмотря на эти многообещающие результаты, средняя продолжительность учреждения 12,2 месяца, препятствует клинической применимости моделей PDX как "аватар мышей" для тестирования противораковых вариантов лечения, по крайней мере для тех пациентов, нуждающихся в немедленном адъювантном или даже неоадъювантноголечения 22. Дополнительным недостатком стандартных моделей PDX является отсутствие возможности использования для иммунотерапевтических тестов из-за иммунодефицита мышей-хозяина. Для преодоления этих ограничений было разработано несколько «гуманизированных» штаммов мыши. Эти мыши в значительной степени ослаблены иммунитетом, но могут быть восстановлены с различными типами человеческих клеток костного мозга или CD34и гематопоэтических стволовых клеток после PDXвырастание 23, что позволяет оценки лимфоцитов опосредовано цитотоксичность и терапии ответ на иммунный контрольно-пропускнойпункт ингибитор лечения 24,25.

В последние годы органоиды, полученные пациентами (PDO), стали важными моделями рака, конкурирующими с PDX. Полученные из нетронутых опухолевых частей и обустроенные во внеклеточной матрице эшафот, эти трехмерные структуры тесно отражают гистологические и генетические свойства первоначальной опухоли. Возможность долгосрочного расширения и криоконсервации делает PDO идеальным дополнением живого биобанка26,27. В дополнение к относительно высокой скорости создания, надежный прогноз ответных мер на наркотики было сообщено для PDO нескольких опухолевыхобразований 28. Кроме того, PDOs даже были созданы из циркулирующих опухолевых клеток, а также одновременное создание органоидов из соответствующих здоровых тканей возможно, что позволяет оценки связанных с терапией токсичности на пациентаиндивидуальной основе 29,30. Однако, по сравнению с обычными 2D-клеточными культурами, органоидная культура является трудоемкой и ресурсосоемкими, а искусственные внеклеточные матричные соединения могут вмешиваться в определенныеаналитические процедуры 31. Кроме того, раковые органоиды подвержены разрастаться более быстрыми темпами роста, не злокачественные органоиды, полученные из здоровогоэпителия 30. Из-за отсутствия стромы, кровеносных сосудов и иммунных клеток, ППО в основном неприменимы для тестирования антиангиогенных иммунотерапевтических агентов. Тем не менее, новые методы культивирования позволяют моделирование микрооквидения опухоли в пробирке, что делает PDOs истинным претендентом на PDX модели32. В ближайшем будущем, пациент-индивидуальные модели опухоли, в сочетании с мощными генетическими инструментами, как следующего поколения секвенирования, мы надеемся проложить путь к истинной точной медицины и индивидуальные подходы к лечению.

Раскрытие информации

никакой.

Благодарности

Мы любезно признаем Дженни Burmeister, наш графический помощник, для записи и редактирования видео. Кроме того, мы благодарим наших коллег из хирургического и патологического отделения за многолетний сотрудничество. Мы также хотели бы поблагодарить Маркуса Мюллера, менеджера по производству ИТ-центра и медиа-центра Ростокского университета, за поставку оборудования для аудиозаписи и уточнение качества звука.

ФИНАНСИРОВАНИЕ: Немецкий фонд помощи раку (DKH e.V.), номер дара 108446, и номер дара TBI-V-1-241-VBW-084 от положения Mecklenburg-Vorpommern отчасти профинансировали это исследование.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacillol® AF; 1LBode, HartmannREF 973380desinfection
PP centrifuge tube, 15ml; sterileGreiner Bio OneGBO Cat. No.:188271centrifuge tube
PP centrifuge tube, 50ml, sterileSarstedtOrder number: 62.547.254centrifuge tube
BD DiscarditTM II Syringe 20mlBDREF 300296blood collection
Serum 7,5ml Sarstedt MonovetteSarstedtItem number: 01.1601blood collection
serological Pipette 10mlSarstedtREF 86.1254.001liquid transfer
Pipetboy ratiolab® accupettaRatiolabItem number: RL3200300liquid transfer
PIPETBOY acu 2Integra BiosciencesVWR Cat.No: 613-4438liquid transfer
DPBS; w/o Ca & MgPan BiotechCat. No.: P04-36500washing
Pancoll humanPan BiotechCat. No.: P04-60500density gradient centrifugation
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)PAN BiotechCat. No.: P04-41500cell cultivation
FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)PAN BiotechCat. No.: P40-47500cell cultivation
L-Glutamine 200mMPAN BiotechCat. No.: P04-80100cell cultivation
Trypsin / EDTAPAN BiotechCat. No.: P10-023100cell cultivation
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)PanReac AppliChemVWR Cat.No: A3672.0250cell freezing
Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)selfmade---cell freezing
cryotube- CryoPure 2mlSarstedt72380cell freezing
6-Well cell culture plate; steril; with lidGreiner bio-oneCat.-No.: 657 160cell cultivation
Petri dish 92 x 16 mm, PS, without camsSarstedtCat. No.: 82.1472.001tissue preparation
sterile surgical bladesB.Braun (Aesculap)REF BB510tissue preparation
BD DiscarditTM II Syringe 10mlBDREF 309110tissue preparation
cell strainer; yellow; 100µmFalconREF 352360tissue preparation
CoolCellbiocisionItem number: 210004cooling container with -1°C/min
Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mmKGWCat. No.: HT39.1transport system
Pipette tip 200µlSarstedtREF 70.760.002liquid transfer
Filter tip 1000µlSarstedtREF 70.762.411liquid transfer
Pipette 200µl, yellowEppendorfCat. No.: 3121 000.082liquid transfer
Pipette 1000µl, blueEppendorfCat. No.: 3121 000.120liquid transfer
incubator  BB 6220 CUHeraeusCat.-No.: 51012839cell cultivation
heating plate PRÄZITHERMHarry Gestigkeit GmbH---heating
Microscope Zeiss Primo VertCarl Zeiss MicroImaging GmbHSerial number. 3842000839imaging cell cultures
Sterile bench Safe flow 1.8 nuncnunc GmbH & Co. KG---sterile working bench
freezer -80°CKryotec-Kryosafe GmbH---sample storage
Electronic balance MP-300Chyo---Scale
BD Micro-fine, U100 insulin syringeBDREF 324826injection anesthetic
Rompun 2%; 25mlBayerapproval number: 6293841.00.00anesthesia
Ketamin 100 mg/ml, 25mlCP-Pharma GmbHapproval number: 401650.00.00anesthesia
GES3S ReaderDatamarsnot availableRFID reader
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)Peddymark---RFID chip
Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 mlRatiopharmPZN-03928197antibiotic drinking water
Heating plate #FM-20 42x28cmDragon---heating
Heating lampElectric Petra, Burgau---heating
Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) BepanthenBayerPZN-01578675Eye protection
anatomical tweezerB.Braun AesculapBD21 ORsurgical instruments
surgical tweezerB.Braun AesculapBD50 1 Rsurgical instruments
scissorsB.Braun AesculapBC05 6Rsurgical instruments
needle holderB.Braun AesculapBH1 1 ORsurgical instruments
Prolene 5-0EthiconXN8870.P32surgical suture material
Opsite moisture vapour permable spray dressingSmith&NephewREF 66004978, PZN- 02063507surgical suture material
Adhesive aperture drapeBarrierREF 904622sterile OP tissue
gauze swap Gazin®; steril; 10x10 cmLohmann&RauscherREF 18506sterile OP tissue
Raucotupf cotton tipped applicatorsLohmann&RauscherREF 11969applicator
Corning® Matrigel Basement Membrane MatrixCorningCat.-No.: 354234Basement Membrane Matrix
iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)B.Braun Melsungen AGItem number: 18839desinfection
MACS® Tissue Storage SolutionMiltenyi Biotec GmbHOrder No.:130-100-008storage solution
Formafix 4%Grimm med. Logistik GmbHItem number: F10010Gfixation solution
Software FreezerworksBasicDataworks Development, Inc---sample organization
Zebra TLP 2844 printerZebra---label printer

Ссылки

  1. Sartore-Bianchi, A., et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).
  2. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  3. Lipson, D., et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).
  4. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  5. Mouradov, D., et al. Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer. Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).
  6. Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept. Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).
  7. DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. Clinical approval success rates for investigational cancer drugs. Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).
  8. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
  9. Mullins, C. S., et al. Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research. Cancers. 11 (10), (2019).
  10. Kuehn, F., et al. Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft. Scientific reports. 6, 24671 (2016).
  11. Dangles-Marie, V., et al. Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features. Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).
  12. Gock, M., et al. Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models. BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).
  13. Collins, A. T., Lang, S. H. A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine. PeerJ. 6, 5981 (2018).
  14. Brown, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).
  15. Zhang, L., et al. The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice. Scientific reports. 5, (2015).
  16. Moyer, A. M., et al. Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall. Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).
  17. Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment. PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).
  18. Guenot, D., et al. Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability. The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).
  19. Mattie, M., et al. Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics. Neoplasia. 15 (10), 1138-1150 (2013).
  20. Cho, Y. B., et al. Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors. The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).
  21. Maletzki, C., et al. Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype. PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).
  22. Katsiampoura, A., et al. Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer. Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).
  23. Wege, A. K., et al. Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy. International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).
  24. Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).
  25. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).
  26. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  27. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  28. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  29. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  30. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  31. Abe, Y., et al. Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids. Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).
  32. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

170PDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены