JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол выделения и трансфектии первичных пигментных эпителиальных клеток радужной оболочки и сетчатки от различных млекопитающих (мышей, крыс, кроликов, свиней, крупного рогатого готья). Метод идеально подходит для изучения подходов к генной терапии глаз в различных установках для анализа ex vivo и исследований in vivo, переносимых на людей.

Аннотация

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является наиболее частой причиной слепоты у пациентов >60 лет, затрагивая ~ 30 миллионов человек во всем мире. ВМД является многофакторным заболеванием, на которое влияют факторы окружающей среды и генетические факторы, которые приводят к функциональному нарушению сетчатки из-за дегенерации пигментных эпителиальных клеток сетчатки (RPE) с последующей деградацией фоторецепторов. Идеальное лечение будет включать трансплантацию здоровых клеток RPE, секретирующих нейропротекторные факторы для предотвращения гибели клеток RPE и дегенерации фоторецепторов. Из-за функционального и генетического сходства и возможности менее инвазивной биопсии в качестве замены дегенерированной РПЭ была предложена трансплантация пигментных эпителиальных клеток радужной оболочки глаза (IPE). Секреция нейропротекторных факторов малым количеством субретинально трансплантированных клеток может быть достигнута транспозонно-опосредованием трансфекции «Спящей красавицы» (SB100X)с генами, кодирующими фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF) и/ или гранулоцитарный макрофагально-колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Мы установили изоляцию, культуру и SB100X-опосредованнуютрансфекцию клеток RPE и IPE от различных видов, включая грызунов, свиней и крупный рогатый скот. Глобусы эксплантируются, а роговица и хрусталик удаляются для доступа к радужной оболочке и сетчатке. С помощью изготовленного на заказ шпателя клетки IPE удаляются из изолированной радужной оболочки. Для сбора клеток RPE может потребоваться инкубация трипсина, в зависимости от вида. Затем, используя шпатель, настроенный на RPE, клетки суспензируются в среде. После посева клетки контролируют два раза в неделю и, достигнув слияния, трансфектируют электропорацией. Интеграция генов, экспрессия, секреция белка и функция были подтверждены qPCR, WB, ELISA, иммунофлуоресценцией и функциональными анализами. В зависимости от вида, 30 000-5 миллионов (RPE) и 10 000-1,5 миллиона (IPE) клеток могут быть выделены на глаз. Генетически модифицированные клетки демонстрируют значительную сверхэкспрессию PEDF / GM-CSF со способностью уменьшать окислительный стресс и предлагают гибкую систему для анализа ex vivo и исследований in vivo, переносимых на людей для разработки подходов к окулярной генной терапии.

Введение

Наша группа фокусируется на разработке регенеративных подходов к лечению нейроретинальной дегенерации, то есть ВМД, с помощью невирусной генной терапии на основе RPE и IPE. Доклиническая разработка таких методов лечения требует моделей in vitro, переносимых на людей. Таким образом, целью исследования, представленного здесь, является предоставление протоколов для выделения, культивировать и генной инженерии первичных клеток RPE и IPE. Обоснованием установления выделения ПЭ-клеток из нескольких видов является надежное подтверждение безопасности и эффективности подхода и повышение его воспроизводимости и переносимости. Доступная человеческая линия клеток RPE-19 отличается от первичных клеток (например, они менее пигментированы) и, следовательно, имеет лишь ограниченное значение для доклинических анализов1. Кроме того, клетки млекопитающих, не являющиеся клетками человека, могут быть приобретены за меньшие деньги и в больших количествах; Донорскую ткань человека можно получить из различных глазных банков, но доступность ограничена и дорога. Наконец, новые лекарственные средства передовой терапии (ATMP, то есть клеточный, тканевый или лекарственный препарат генной терапии) должны быть применены по крайней мере у двух разных видов перед тестированием на пациентах, и эти исследования in vivo запрашивают подготовку аллогенных клеточных трансплантатов.

Нейродегенеративные заболевания сетчатки являются основной причиной слепоты в промышленно развитых странах, включая распространенные заболевания, такие как ВМД, а также редкие заболевания, такие как пигментный ретинит, при котором гибель клеток сетчатки в конечном итоге приводит к слепоте. Повреждение клеток RPE, фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки (RGC) в некоторых случаях может быть замедлено, но в настоящее время нет доступных лечебных методов лечения. ATMP предлагают потенциал для коррекции дефектов генов, интеграции терапевтических генов или замены дегенерированных клеток, тем самым позволяя разработать регенеративные и лечебные методы лечения таких заболеваний, как ВМД; 13 генных терапий уже получили одобрение маркетинга, включая терапию для лечения мутационно-ассоциированной дегенерации сетчатки RPE652,3. Среди пожилых людей (>60 лет) ~ 30 миллионов человек во всем мире страдают либо неоваскулярной (nvAMD), либо аваскулярной (aAMD) AMD4. Обе формы индуцируются возрастными триггерами, включая окислительное повреждение, нарушение функции и потерю клеток RPE с последующей деградацией фоторецепторов, среди прочего (например, аллели генетического риска, курение, гипертония)5,6. При nvAMD патогенез усугубляется дисбалансом ангиогенных и антиангиогенных факторов в пользу ангиогенного фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), индуцируемого хориоидальной неоваскуляризацией (CNV). На сегодняшний день только нвАМД поддается лечению ежемесячными интравитреальными инъекциями ингибиторов белка VEGF для подавления ЦНВ; эффективного лечения для aAMD6,7пока нет.

В нескольких исследованиях оценивали клеточную терапию для замены анти-VEGF терапии: исследования, проведенные Binder et al., в которых свежесобранные аутологичные клетки RPE были пересажены пациентам с nAMD8,9,10,показали умеренное улучшение зрения, но только небольшая группа пациентов достигла окончательной остроты зрения, достаточно высокой, чтобы позволить чтение. Недавно в клиническом исследовании фазы I использовался пластырь RPE, полученный из эмбриональных стволовых клеток, для лечения ВМД с многообещающими результатами; т.е. эффективность, стабильность и безопасность пластыря RPE в течение 12 месяцев у 2 из 10 пациентов, получавшихлечение 11. Кроме того, несколько групп опубликовали исследования, в которых аутологичные мембранно-сосудисто-хороидные пятна RPE-Bruch были собраны из периферической сетчатки и пересажены в макулу12,13,14; и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из RPE, были сгенерированы для трансплантации15. Для aAMD антитела, нацеленные на путь комплемента, были протестированы в клинических испытаниях6,16, а исследование фазы I с использованием одной интравитреальной инъекции аденоациированного вирусного (AAV) вектора, кодировающего ген фактора CD59 (AAVCAGsCD59) у пациентов с географической атрофией (GA), было завершено17; недавно начато исследование фазы II, целью которого является набор 132 пациентов с прогрессирующим aAMD и оценка результата через 2 года после вмешательства18. Наконец, исследовательская группа FocuS начала многоцентровое клиническое исследование фазы I / II, оценивающее безопасность, реакцию на дозу и эффективность рекомбинантного нереплицируемого вектора AAV, кодировающего фактор комплемента человека19.

В первую очередь, целью регенеративной терапии ВМД является трансплантация функциональных RPE-клеток, которые были повреждены или потеряны. Однако клетки IPE и RPE имеют много функциональных и генетических сходств (например, фагоцитоз и метаболизм ретинола), и поскольку клетки IPE более реально собираются, они были предложены в качестве заменителя RPE20. Несмотря на то, что ранее было продемонстрировано, что трансплантация клеток IPE задерживает дегенерацию фоторецепторов на животных моделях21,22 и стабилизирует зрительную функцию у пациентов с конечной стадией nvAMD, у этих пациентов23не наблюдалось значительного улучшения. Отсутствие эффективности может быть связано с низким количеством трансплантированных клеток и/или дисбалансом нейропротекторных факторов сетчатки. Альтернативным подходом будет трансплантация трансфектированных пигментных эпителиальных клеток, которые чрезмерно экспрессируют нейропротекторные факторы для восстановления гомеостаза сетчатки, поддержания оставшихся клеток RPE и защиты фоторецепторов и RGC от дегенерации. Следовательно, мы предлагаем новую терапию, которая включает в себя трансплантацию функциональных клеток RPE или IPE, которые подверглись генной инженерии для секреции нейропротекторных и антиангиогенных белков, таких как PEDF, GM-CSF или инсулиноподобные факторы роста (IGF). Преимуществом разработки и анализа данного подхода у нескольких видов вместо использования клеточной линии, только одного вида, или тканей человека, является: 1) повышенная воспроизводимость и переносимость результатов, как показали многочисленные исследования, проведенные в независимых лабораториях и различных видах1,24,25; 2) клетки свиней или крупного рогатого лова по возможности одноразовые без жертвоприношения дополнительных животных; 3) наличие особенно свиньи и бычных клеток позволяет большим сериям испытаний давать надежные результаты; 4) знания по выделению, культивированию и генетической модификации клеток из наиболее часто используемых моделей позволяют проводить анализ in vivo у нескольких видов24,25,26 и,таким образом, обеспечивают улучшенное соотношение риска и пользы для первых пролеченных пациентов; 5) гибкость представленного протокола позволяет использовать его в различных моделях и экспериментальных установках, а также для всех методов лечения на основе глазных клеток с генной инженерией и без нее. Напротив, альтернативные методы, такие как клеточные линии или ткани человека, имеют только ограниченную переносимость и / или ограниченную одноразовую способность. Клеточные линии, такие как ARPE-19, идеально подходят для предварительных экспериментов; однако низкая пигментация и высокая пролиферация значительно отличаются от первичных клеток1. Клетки RPE и IPE, выделенные из донорской ткани человека, являются ценным источником для переносимых экспериментов in vitro; тем не менее, мы получаем человеческую ткань из американо-американского банка глаз, что означает, что этой ткани не менее двух дней (после энуклеации) и требуется длительная и дорогостоящая транспортировка, но местная донорская ткань недоступна в достаточных количествах для продуктивного исследования. Преимущество использования первичных клеток подтверждается многочисленными исследованиями из других групп27,28.

Для разработки клеточной невирусной генной терапии с использованием транспозонной системы SB100X для трансфекции первичных RPE и IPE клеток с генами, кодирующими PEDF и/или GM-CSF для лечения nvAMD и aAMD, соответственно29,30,31,32,мы впервые установили трансфекцию клеток ARPE-191 . Затем протоколы выделения и трансфекции были установлены в легкодоступных первичных клетках крупного рогатого голова и свиней. Теперь установлена изоляция и трансфекция первичных клеток RPE и IPE от пяти различных видов, от мелких (как мыши) до крупных млекопитающих (как крупный рогатый скот). Это было подтверждено в первичных RPE и IPE клетках, полученных из донорских глаз человека30. Производство ATMP, соответствующее надлежащей производственной практике (GMP), было подтверждено с использованием донорской ткани человека, а также33. Наконец, как безопасность, так и эффективность подхода оценивались in vivo у трех различных видов, для которых протокол был адаптирован: мыши, крысы и кролика. В клинической установке биопсия радужной оболочки будет собрана у пациента, и клетки IPE будут изолированы и трансфекционированы в чистой комнате, прежде чем клетки будут пересажены субретинально обратно тому же пациенту. Весь процесс будет проходить в течение одного хирургического сеанса, который длится примерно 60 минут. Разработка подхода к лечению и оценка его эффективности потребовали отличных моделей in vitro и ex vivo для реализации надежных и эффективных методов доставки генов, анализа эффективности доставки генов, терапевтической продукции белка и нейропротекторных эффектов, а также для производства клеточных трансплантатов для тестирования подхода in vivo1,24,25,29,30 . Стоит отметить, что терапия имеет этическое одобрение для клинической фазы ib / IIa исследования от этической комиссии по исследованиям кантона Женева (No 2019-00250), и в настоящее время последние доклинические данные, запрошенные для разрешения швейцарскими регулирующими органами, собираются с использованием представленного протокола. В связи с этим доклинические данные in vivo продемонстрировали значительное снижение ХНВ и отличную безопасность24,25,31.

Здесь описано выделение и культивирование клеток RPE/IPE из крупного рогатого готья, свиньи, кролика, крысы и мыши, а также использование интегративной транспозонной системы SB100X в сочетании с электропорацией в качестве эффективного метода доставки генов. В частности, первичные ПЭ-клетки были трансфектрифицировались для сверхэкспрессии PEDF и GM-CSF. Сбор этих протоколов позволяет проводить исследования in vitro и in vivo на всех доклинических фазах развития АТМП. Кроме того, установка может быть адаптирована к другим генам, представляющим интерес, и заболеваниям.

протокол

Протоколы, в которых участвовали животные, были выполнены сертифицированным персоналом и после получения разрешения кантонального департамента по защите порядка, безопасности и здоровья (DSES), Домена экспериментации животных Женевы, Швейцария, и в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях (разрешение No. GE/94/17). Взрослые здоровые крысы коричневой норвегии, мыши C57BL/6 и новозеландские белые кролики были усыплены передозировкой пентобарбитала (150 мг/кг), разбавленного в 0,9% NaCl, введенного внутрибрюшинно, и глаза были энуклеированы сразу после жертвоприношения. Свиные и бычьи глаза были получены с местной бойни в течение 6 часов после жертвоприношения и были доставлены в лабораторию на льду.

1. Перед подготовкой

  1. Готовят полную среду (DMEM/Ham's F12 с добавлением 10% фетальной бычих сывороток (FBS), 80 ЕД/мл пенициллина/80 мкг/мл стрептомицина и 2,5 мкг/мл амфотерицина B). Нагрейте среду, 1x PBS и 0,25% трипсина (при необходимости) на водяной бане с температурой 37 °C.
  2. Положите стерильную драпировку в вытяжку, чтобы подготовить асептическое рабочее место. Введите все необходимые стерильные инструменты и материалы внутрь капота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только энуклеацией глаз и очисткой оставшейся мышечной ткани и кожи являются процедуры, проводимые вне капюшона, остальные шаги должны выполняться внутри капюшона.

2. Выделение ПЭ-клеток крысы/мыши

  1. Используйте изогнутые ножницы и щипцы Colibri для энуклеации глаз после эвтаназии животного. Очистите оставшуюся мышечную ткань и кожу от глаз с помощью ножниц и щипцов (нестерильных).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ножниц и щипцов, используемых для энуклеации и очистки глаз, зависит от вида (например, для крыс и мышей инструменты будут меньше, чем те, которые используются для свиней и крупного рогатого скота) (см. Рисунок S1).
    1. Соберите глаза в 50 мл пробирку, заполненную нестерильным PBS, и перенесите трубку в ламинарную вытяжку. Продезинфицируйте глаза, погрузив на 2 мин в раствор на основе йода, затем переложите их в чашку Петри, наполненную стерильным PBS.
  2. Открытие колбы
    1. После переноса глаз в стерильную чашку Петри держите одну плотно близко к зрительным нерва колибри или заостренными щипцами. Продуйте отверстие около предела радужной оболочки (между pars plana и ora serrata) иглой 18 Г. Вставьте небольшие ножницы в отверстие и вырежьте вокруг радужной оболочки. Удалите передний сегмент (роговицу, хрусталик и радужную оболочку) и поместите его в чашку Петри. Оставьте луковицу со стекловидным стекловидом до тех пор, пока клетки RPE не будут изолированы.
  3. Изоляция ЯПЭ клеток
    1. Снимите хрусталик и тонкими щипцами деликатно вытащите радужную оболочку, содержащую IPE-клетки. Поместите ирис в чашку Петри, вымойте стерильным PBS и оставьте в PBS до тех пор, пока не будет приготовлено больше ирисов.
    2. Повторите шаги 2.2.1-2.3.1, чтобы все глаза были готовы в этот день.
    3. Добавьте 50 мкл 0,25% трипсина на радужную оболочку и инкубировать в течение 10 мин при 37 °C. Удалите трипсин, добавьте 150 мкл полной среды на радужную оболочку и деликатно соскоблите IPE плоской огнеполированной пипеткой Пастера; использовать тонкие щипцы для обездвиживать ткани. Соберите клеточную суспензию и поместите в пробирку 1,5 мл. Используйте 10 мкл клеточной суспензии, разбавленной 1:3 с трипан-синим цветом, чтобы подсчитать клетки в камере Нойбауэра34,35.
    4. Если не трансфектировано немедленно, посейте 200 000 клеток/колодец в 24-скважинную пластину (100 000клеток/см2)в 1 мл полной среды (10% FBS) (для посева см. таблицу 1). Поместите пластину в инкубатор и культивированную при 37 °C, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется объединить несколько глаз вместе, чтобы иметь достаточное количество клеток для посева.
  4. Изоляция Ячеек RPE
    1. Удалить стекловидное тело и сетчатку с заднего сегмента тонкими щипцами. Избегайте повреждения пигментного эпителия сетчатки.
    2. Разрежьте сегмент пополам скальпелем No10, чтобы глобус был полностью открыт и промыт стерильным PBS.
    3. Добавьте 50 мкл 0,25% трипсина на глаз и инкубировать в течение 10 мин при 37 °C. Удалить трипсин и добавить 150 мкл полной среды на глобус и деликатно соскоблить клетки RPE круглым скальпелем; использовать тонкие щипцы для обездвиживать ткани. Соберите клеточную суспензию и поместите ее в пробирку 1,5 мл. Взять 10 мкл клеточной суспензии; разбавить 1:4 трипаном синим, чтобы подсчитать клетки в камере Нойбауэра.
    4. См. шаг 2.3.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется объединить несколько глаз вместе, чтобы иметь достаточное количество клеток для посева.

3. Выделение ПЭ-клеток кролика

  1. Выполните очистку и дезинфекцию, как описано на этапах 2.1-2.1.1.
  2. Положите один глаз на стерильный марлевый компресс и крепко держите его близко к зрительным нервам. Откройте глаз скальпелем No11 и ножницами около 2 мм под лимб. Удалите передний сегмент (роговицу, хрусталик и радужную оболочку) и поместите его в чашку Петри. Оставьте луковицу со стекловидным стекловидом до тех пор, пока клетки RPE не будут изолированы.
  3. Изоляция ЯПЭ клеток
    1. Выполните шаг 2.3.1. Удалить цилиарное тело из радужной оболочки, разрезав скальпелем No10.
    2. После приготовления 2 ирисов инкубируют с 1 мл 0,25 % трипсина при 37 °С в течение 10 мин; в течение этого времени ячейки RPE могут быть изолированы (см. шаг 3.4). Удалите трипсин и добавьте 1 мл полной среды в радужную оболочку и изолируйте клетки, тщательно поцарапав плоской огненаполированной пипеткой Пастера. Тщательно повторно суспендируете клетки путем пипетки и перенесите суспензию ячейки в трубку 1,5 мл. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и разбавьте 1:3 трипан-синим, чтобы подсчитать клетки в камере Нойбауэра.
    3. См. шаг 2.3.4.
  4. Изоляция Ячеек RPE
    1. Выполните шаг 2.4.1.
    2. Положите стерильную марлю в 12-колодезную пластину и положите луковицу поверх марли.
    3. Вымойте pBS и выполните шаг 2.4.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изогнутую огнеполированную пипетку Пастера.
    4. Центрифугировать клетки 10 мин при 120 х г.
    5. См. шаг 2.3.4.

4. Выделение ПЭ-клеток свиней

  1. Выполните очистку, как описано в шаге 2.1. Промыть ПБС и продезинфицировать глаза, погружая на 2 мин в раствор на основе йода, промыть ПБС. Перейдите к шагу 3.2.
  2. Изоляция ЯПЭ клеток
    1. Выполните шаг 3.3.1. После приготовления 2 радужных орошаемых пацать добавить 1 мл полной среды и изолировать клетки, тщательно поцарапав плоской огнеполированной пипеткой Пастера. Переложите клеточную суспензию в пробирку 1,5 мл. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и разбавьте 1:4 трипан-синим, чтобы подсчитать клетки в камере Нойбауэра.
    2. См. шаг 2.3.4.
  3. Изоляция Ячеек RPE
    1. Выполните шаг 2.4.1. Поместите луковицу в чашку Петри и вымойте PBS. Наполните луковицу 1 мл полной средой.
    2. Используя изогнутую огнеполированную пипетку Пастера, аккуратно удалите ячейки RPE. Обязательно соскоблите снизу вверх, чтобы избежать скольжения вниз мембранного комплекса сосудистой оболочки Бруха. Соберите клеточную суспензию внутри колбы с помощью пипетки 1000 мкл и переложите в трубку 1,5 мл для повторного суспензии. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и разбавьте 1:8 трипан-синим, чтобы подсчитать клетки в камере Нойбауэра.
    3. См. шаг 2.3.4.

5. Выделение бычих ПЭ-клеток

  1. Выполните очистку, как описано в шаге 2.1. Промыть ПБС и продезинфицировать глаза, погружая на 2 мин в раствор на основе йода, промыть ПБС. Перейдите к шагу 3.2.
  2. Изоляция ЯПЭ клеток
    1. Выполните шаг 3.3.1. После приготовления двух радужных орошающих вливать с 2 мл 0,25% трипсина при 37 °С в течение 10 мин. В течение этого времени ячейки RPE могут быть изолированы (см. шаг 5.3).
    2. Удалите трипсин и добавьте 2 мл полной среды в радужную оболочку и изолируйте клетки, тщательно поцарапав плоской огнеполированной пипеткой Пастера. Переложите клеточную суспензию в пробирку 15 мл. Центрифугировать клетки 10 мин при 120 х г. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и разбавьте 1:4 трипан-синим, чтобы подсчитать клетки в камере Нойбауэра.
    3. Если не трансфекетируется немедленно, посейте 320 000 клеток /колодец в 6-скважинную пластину в 3 мл полной среды (10% FBS) (для посева см. таблицу 1). Поместите пластину в инкубатор и культивированную при 37 °C, 5% CO2.
  3. Изоляция Ячеек RPE
    1. Выполните шаг 2.4.1. Поместите луковицу в чашку Петри и вымойте PBS. После приготовления 2 глазок наполните луковицу около 3/4 трипсином и инкубируют в течение 25 мин при 37 °C крышкой чашки Петри поверх бульби.
    2. Удалите трипсин и добавьте 1 мл полной среды. Выполните шаг 4.3.2. Центрифугировать клетки 10 мин при 120 х г.
    3. См. шаг 5.2.3.

6. Культивация - изменение среды

  1. Культивируем клетки в DMEM/Ham's F12, дополненный 10% FBS, 80 ЕД/мл пенициллина/80 мкг/мл стрептомицина и 2,5 мкг/мл амфотерицина B, при 37°C и 5% CO2 в увлажненном инкубаторе. Через 3-4 дня пипеткой вверх и вниз собрать неприлипанные клетки и положить половину объема в другой колодец. Заполните до 1 мл полной средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет иметь поверхность, достаточно большую для всех изолированных ячеек, чтобы присоединиться и максимизировать выход.
  2. Еще через 3-4 дня повторите сбор клеток, но на этот раз путем объединения неприлипаемых клеток из двух скважин в одну скважину (например, A1 + B1 в C1). Добавьте среду ко всем скважинам. Наблюдают за клетками и меняют среду 2 раза в неделю (для 6 и 24-х скважинных пластин используют 3 и 1 мл/скважину соответственно). Когда клетки достигнут слияния, переключитесь на полную среду с 1% FBS или используйте клетки для экспериментов (например, трансфекции).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки RPE и IPE сливаются через 3-4 и 4-5 недель после выделения соответственно. Чистота клеточной культуры была подтверждена проверкой морфологии клеток (пигментированных клеток) и специфических маркеров, как описано Джоненом и его коллегами36.

7. Электропорация первичных ПЭ-клеток

  1. Выполняют электропорацию, как описано выше1,37.
  2. В зависимости от количества трансфективных клеток используют 6-, 24- или 48-щечные пластины (см. табл. 2)для засева клеток в среду без антибиотиков или антимикотиков. В течение следующих 2 недель добавляют капли со средой, содержащей пенициллин (80 Ед/мл), стрептомицин (80 мкг/мл) и амфотерицин В (2,5 мкг/мл) два раза в неделю. Полностью обмениваете среду через 2 недели после трансфекции.
  3. Чтобы определить рост клеток, эффективность трансфекции и секрецию белка, еженедельно контролируйте клетки с помощью микроскопии и анализируйте супернатант клеточной культуры с помощью вестерн-блотта. Перед прекращением культуры возьмите супернатант клеточной культуры за 24 часа для количественной оценки секреции белка с помощью ИФА, подсчитайте клетки, измерьте флуоресценцию с помощью цитометрии на основе изображений (в случае венеро-трансфектированных клеток) следуя инструкциям производителей (см. Таблицу материалов),и соберите клеточную гранулу для анализа экспрессии генов на основе RT-qPCR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти методы не включены в настоящую статью, поскольку целью является не подробное объяснение анализа клеток, а их изоляция. Плотность посева клеток одинакова для всех видов (100 000 клеток /см2),но поскольку количество изолированных клеток варьируется, использовались разные пластины. Кроме того, для мышей, крыс и кроликов может потребоваться объединить 2-3 глаза, чтобы иметь достаточно клеток для посева.
ВидЛечение трипсиномN° IPE ячеекN° RPE ячеекТарелка для посева (100 000 клеток/см2 )
Мышь/крысаДа~50,000~150 000Плиты с 24 скважинами
КроликДа~350 000~2,500,000Плиты с 24 скважинами
СвиньяНет~1 000 000~3 000 000Плиты с 24 скважинами
БычийДа~1 700 000~5,000,000Плиты с 6 скважинами

Таблица 1: Количество первичных ПЭ-клеток, выделенных из глаз разных видов.

ИмяПлощадьОбъемный носительТрипсинОбъемная среда для остановки действия трипсинаПлотность высева
6-скважинная плита9,6 см²3.0 мл0,5 мл1,0 мл3х105
Плита из 24 скважин2.0 см²1,0 мл0.2 мл0.8 мл5х104
Плита из 48 скважин1,1 см²0,5 мл0.1 мл0,4 мл0,5-1х104

Таблица 2: Объемы клеточных культур и плотность посева.

Результаты

Выделение ПЭ из различных видов млекопитающих
Используя вышеупомянутые протоколы, клетки IPE и RPE были успешно выделены и культивированы из пяти различных видов. Количество клеток, получаемых в результате каждой процедуры, зависит от вида и размера глаза(табл. 1). Как ?...

Обсуждение

Наличие стандартизированных методов выделения и культивирования клеток ПЭ имеет основополагающее значение для разработки новых подходов к терапии дегенеративных заболеваний сетчатки. С помощью представленных здесь протоколов ПЭ-клетки можно успешно выделять из разных видов и куль?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Отдельного заслуживают грегг Сили и Ален Конти за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана Европейской комиссией в контексте Седьмой рамочной программы, Швейцарским национальным фондом наук и Фондом Шмидера-Бориша. Z.I. получил финансирование от Европейского исследовательского совета, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] и B.M.W. из исследовательского гранта Фулбрайта и стипендии правительства Швейцарии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well platesCorning353043
24-well platesCorning353047
48-well platesThermoFisher Scientific150687
6-well plateGreiner7657160
BetadineMundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity AssayPromegaG9291
DMEM/Ham`s F12Sigma-AldrichD8062
Drape (sterile)Mölnlycke Health Care800530
Electroporation buffer 3P.143P Pharmaceutical
FBSBrunschwigP40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compressPROMEDICAL AG25403
NaCl (0.9%)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Needle (18G) TerumoTER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µLThermoFisher ScientificMPK1096
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000S
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Pasteur pipette (fire-polish)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
Petri dishThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Pastor et al., 2018
scarpel no. 10Swann-Morton501
scarpel no. 11Swann-Morton503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based CytometerThermoFisher ScientificT10796
Trypsin 0.25% ThermoFisher Scientific25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%Sigma-AldrichT4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

Ссылки

  1. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  2. Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
  3. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  4. Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  5. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  6. Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
  7. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  8. Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
  9. Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  10. Binder, S. . The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , 7985-7987 (2004).
  11. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
  12. Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
  13. Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
  14. Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
  17. Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  18. , . Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , (2020).
  19. Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  20. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
  21. Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
  22. Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
  23. Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
  24. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  25. Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
  26. Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , (2020).
  27. Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
  28. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  29. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  30. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
  31. Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
  32. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  33. Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  37. Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
  38. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
  39. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
  40. Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
  41. Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
  42. Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
  43. Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
  44. Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
  45. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  46. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  47. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168RPEIPEPEDFGM CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены