In vivo Измерение функции мышц-разгибательных мышц колена у мышей

Резюме

Количественная оценка максимальной силы разгибателя коленного сустава необходима для понимания функциональных адаптаций к старению, болезням, травмам и реабилитации. Представлен новый метод многократного измерения in vivo изометрического пикового тетанического крутящего момента.

Аннотация

Пластичность скелетных мышц в ответ на бесчисленные состояния и стимулы опосредует одновременную функциональную адаптацию, как отрицательную, так и положительную. В клинике и исследовательской лаборатории максимальная мышечная сила широко измеряется продольно у людей, причем мышца разгибателя колена является наиболее сообщаемым функциональным результатом. Патология коленного разгибательного мышечного комплекса хорошо документирована при старении, ортопедических травмах, заболеваниях и неиспользовании; прочность разгибателя колена тесно связана с функциональной способностью и риском травм, что подчеркивает важность надежного измерения прочности разгибателя колена. Повторяемая оценка in vivo силы разгибателя коленного сустава в доклинических исследованиях на грызунах предлагает ценные функциональные конечные точки для исследований, изучающих остеоартрит или травму колена. Мы сообщаем о in vivo и неинвазивном протоколе для многократного измерения изометрического пикового тетанического момента коленных разгибателей у мышей во времени. Мы демонстрируем согласованность, используя этот новый метод для измерения силы разгибателя колена с повторной оценкой у нескольких мышей, дающих аналогичные результаты.

Введение

Скелетные мышцы - это высоко адаптируемая ткань с компенсаторными изменениями массы и структуры в ответ на множество стимулов, таких как физические упражнения, питание, травмы, болезни, старение и неиспользование. Многие исследования, изучающие адаптацию скелетных мышц у людей, используют методы измерения как размера скелетных мышц, так и влияния на функцию, поскольку оценки силы золотого стандарта легко повторяются у людей.

В частности, прочность разгибателя коленного сустава и сгибателя наиболее оценивается в клинических исследованиях. Изменения в силе разгибателя колена широко сообщалось в исследованиях старения на людях, физических упражнений, ортопедических травм, остеоартрита коленного сустава, хронических заболеваний и неиспользование^{1,2,3,4,5,6,7.} Однако методы многократного и неинвазивного анализа силы мышц-разгибательных мышц колена (квадрицепсов) в механистических исследованиях грызунов были относительно ограничены. Метод определения сократимости мышц in vivo квадрицепсов у крыс был ранее разработан^8; однако требуется обширное строительство некоммерческого оборудования. Учитывая широту моделей грызунов, разработанных для изучения результатов опорно-двигательного аппарата после травмы колена / остеоартрита^{9,10,11,12,13,} существует необходимость в неинвазивной оценке силы квадрицепсов.

Кроме того, исследования на грызунах, изучающие молекулярные механизмы, лежащие в основе адаптации скелетных мышц, часто используют мышиные модели из-за простоты генетической модификации, как и многие фармакологические интервенционные исследования из-за снижения финансовых затрат, связанных с более низким дозированием препарата на основе веса у мышей по сравнению с крысами. Мы сообщаем о неинвазивном методе многократного измерения функции разгибателя коленного сустава in vivo у одной и той же мыши с течением времени с использованием коммерчески доступного оборудования с незначительными изменениями, облегчающим воспроизводимость среди различных лабораторий и обеспечивающим более прямое сравнение с результатами силы человека.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета Кентукки.

1. Настройка оборудования

1. Убедитесь, что компьютеры подключены в соответствии со спецификациями производителя.
2. Если вы еще не на месте, прикрепите двигатель 300D-305C-FP с устройством для удлинителя колена к платформе для животных 809C.
3. Включите водяной насос до 37 °C, чтобы начать нагрев платформы.
4. Если компьютер еще не включен, включите его, а затем двухфазный стимулятор высокой мощности и 2-канальная двухрежимная рычажная система.
5. Налейте изофлуран в испаритель до максимальной линии заполнения.

2. Настройка программного обеспечения

1. Откройте программное обеспечение (подробности приведены в Таблице материалов).
2. Чтобы использовать функцию мгновенной стимуляции в сочетании с Live Data Monitor для оптимизации размещения зонда (шаг 4), выберите Подготовить эксперимент, а затем Настроить Instant Stim (рисунок 1). Установите частоту импульсов (Гц) как 125, ширину импульса (мс) как 0,2, число импульсов как 1, частоту поезда (Гц) как 0,5 и время выполнения как 120.
3. Выберите Файл и откройте Монитор данных в реальном времени.
4. Для выполнения экспериментов с подергиванием (шаг 5) и частотой крутящего момента (шаг 6) выберите ранее запрограммированное исследование, которое включает в себя соответствующие эксперименты с частотой подергивания и разгибательного момента колена (подробно описанные ниже на шаге 5 и шаге 6).
   1. Выберите подходящую экспериментальную мышь или Добавить новое животное и введите соответствующую информацию о мыши, которая будет сохранена с данными о крутящем моменте.
   2. Выберите «Следующий эксперимент» или «Предыдущий эксперимент», чтобы перейти от протокола twitch к последовательности момент-частота.

3. Настройка мыши

1. Поместите отдельную мышь в анестезирующее камерное камеру.
2. Отпустите клапан кислородного баллон и установите скорость потока кислорода на уровне 1 л/мин с 2,5% изофлурана.
3. Убедитесь, что мышь остается в камере с надежно закрытой крышкой до полного сознания. Подтвердить полную потерю сознания при отсутствии рефлекса стопы с помощью защемления носа.
4. Поместите анестезированную мышь в лежачем положении с головой в носовом конусе на нагретой платформе со скоростью потока кислорода при 1 л/мин с 2,5% изофлураном.
5. Сбривайте волосы с правой задней конечности с помощью электрических клиперов. Удалите волосы с выбритой области спиртовой салфеткой и небольшим вакуумом. Очистите удаленные волосы вдали от задней конечности и платформы.
6. Надежно зажмите верхнюю заднюю конечность, заднюю к колену(рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что диапазон движения колена не затруднен.
7. Поместите нижнюю заднюю конечность в аппарат разгибателя колена, а передняя большеберцовая кость слегка соприкасается с регулируемым пластиковым куском (показания Force In канала должны считываться между 0 и -1,0 мН*м). В зависимости от размера нижней задней конечности мыши, хирургическая лента может быть обернута вокруг нижней части регулируемого пластикового куска, чтобы позволить ноге надежно упираться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные изображения и размеры изготовленного на заказ пластикового изделия показаны на дополнительном рисунке 1.
8. Отрегулируйте ручки на платформе, чтобы убедиться, что колено согнуто под 60°.
9. Слегка положите кусок ленты на туловище мыши на платформу, чтобы предотвратить компенсаторное движение с максимальным разгибательным коленом.

4. Размещение электродов

1. Поместите электроды подкожно 2-4 мм проксимально к колену непосредственно над квадрицепсами/мышцами разгибателя колена(рисунок 2). Электроды должны находиться на расстояние примерно 1-2 мм друг от друга.
2. Чтобы определить оптимальное расположение электродов, используйте функцию мгновенной стимуляции с Live Data Monitor. Установите усилие/ток на уровне 50 мА для повторных подергиваний, чтобы подтвердить разгибатель колена (разгибатели колена будут производить отрицательную кривую подергивания). Отрегулируйте зонды во время мгновенной стимуляции, чтобы достичь максимального крутящего момента подергивания колена, измеренного в окне Live Data Monitor.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показан репрезентативный выход мгновенной стимуляции, подтверждающий разгибание колена. Дополнительное Видео 1 и Дополнительное Видео 2 показывают подергивания коленного разгибателя колена в режиме реального времени и замедленного движения без моторной руки на месте, что позволяет визуально подтвердить разгибатель колена.
3. Во время повторных подергиваний с мгновенной стимуляцией,пальпировать мышцы-сгибательные мышцы колена указательным пальцем для подтверждения отсутствия активации мышц-антагонистов. Для максимальной стимуляции коленных разгибателей может потребоваться репозиционирование зонда в зависимости от состава тела мыши и незначительных анатомических различий в точном расположении двигательной точки бедренного нерва и мышц-разгибателей коленного сустава.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышечная двигательная точка - это место, где двигательная ветвь нерва входит в мышечный живот и является точкой с наименьшим сопротивлением электропроводности и, следовательно, наибольшей реакцией на электрическую стимуляцию^14,15. В клинических применениях с использованием электрической стимуляции эта точка идентифицируется путем сканирования с помощью пен-электрода, чтобы найти место над мышцей, в котором происходит подергивание мышцы с наименьшим введенным током^14,15. Идентификация мышечной двигательной точки необходима для облегчения оптимальной нервно-мышечной электрической стимуляции^15. В клинических испытаниях на людях мышечные двигательные точки для четырехглазых мышц были идентифицированы в дистальной половине мышцы^14. Для достижения оптимальной стимуляции разгибателя коленного сустава у мышей этот метод был рекапитулирован с использованием размещения электродов с мгновенной стимуляцией для наиболее близкого приближения к местам мышечных двигательных точек, обычно встречающихся в дистальной половине коленных разгибателей. Существует некоторая изменчивость в размещении электродов (от относительно поверхностного до глубокого), что приводит к максимальному крутящему моменту, а функция мгновенной стимуляции облегчает оптимальное размещение электродов.

5. Определение оптимального тока

1. После определения оптимального размещения зонда выполните серию прогрессивных подергиваний для определения оптимальной мощности/тока, который будет использоваться для эксперимента с частотой крутящего момента, с целью определения наименьшего тока для достижения максимального выходного крутящего момента. Начните с тока, установленного на уровне 50 мА, и выберите Запустить эксперимент, чтобы произвести одно подергивание. Выберите «Анализировать результаты», чтобы отобразить выходной момент крутящего момента. Запишите крутящий момент подергивания, отображаемый в разделе Max Force с вычитанием базовой линии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите опцию инвертирования силового канала для преобразования измерений из отрицательного крутящего момента в положительный.
2. Увеличьте ток до 60-70 мА и повторите эксперимент по подергиванию. Запишите крутящий момент подергивания, отображаемый в разделе Max Force с вычитанием базовой линии.
3. Продолжайте серию экспериментов по подергиванию таким образом (увеличивая примерно на 10-20 мА с каждой прогрессией) до тех пор, пока крутящий момент подергивания больше не увеличится (либо плато, либо начнет уменьшаться). Пример серии twitch приведен в таблице 1.
4. Запишите наименьший ток, при котором был достигнут самый высокий крутящий момент подергивания. Этот ток будет использоваться и оставаться постоянным во время предстоящего эксперимента с частотой силы. На рисунке 4 показан репрезентативный пик подергивания.

6. Эксперимент по частоте крутящего момента для определения пикового изометрического тетанического момента

1. В программном обеспечении (см. Таблицу материалов)выберите предварительно запрограммированный эксперимент с частотой крутящего момента для разгибания колена, обеспечивая последующую настройку. Длительность стимула: 0,35 с, Частотная последовательность: 10 Гц, 40 Гц, 120 Гц, 150 Гц, 180 Гц, 200 Гц, Период покоя между импульсами/сокращениями: 120 с
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дискретизации составляет 10 000 Гц (настройка по умолчанию).
2. Запустите эксперимент, проанализируйте результатыи вручную запишите крутящий момент, отображаемый в разделе Max Force с вычтенной базовой линией (убедитесь, что силовой канал перевернут, так как сокращение коленного разгибателя приведет к отрицательному крутящему моменту) на каждой частоте. Обратите внимание на самое высокое значение Max Force как пиковый изометрический тетаничный крутящий момент. Пример данных о частоте крутящего момента приведен в таблице 2, а на рисунке 5 показана репрезентативная кривая столбняка для пиковой изометрической тетановой выходной мощности крутящего момента, достигаемого при 120 Гц.

7. Прекращение эксперимента

1. По завершении эксперимента с частотой крутящего момента выполните последующее подергивание и сравните с начальным пиковым подергиванием при том же токе, чтобы оценить повреждение / усталость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых моделях травм и заболеваний ожидается повышенная утомляемость скелетных мышц и не представляет проблемы с экспериментальной установкой или мышью.
2. Когда все измерения крутящего момента будут завершены, аккуратно снимите электродные зонды и расстегивайте колено.
3. Выключите изофлуран и выньте мышь из носового конуса.
4. Поместите мышь обратно в соответствующую клетку, расположенную поверх согревающей подушки. Следите за тем, как мышь восстанавливается и приходит в сознание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна быть в сознании и двигаться в течение 2-3 минут.

8. Анализ данных

1. Извлечение данных после эксперимента из аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
   1. Открытое аналитическое программное обеспечение.
   2. Выберите Получить данные из программного обеспечения.
   3. Выберите Дата проведения эксперимента и соответствующий код мыши.
   4. Выберите интересующеую частоту (будут перечислены все эксперименты с twitch и каждая частота эксперимента с частотой крутящего момента).
   5. Выберите Анализ мышц.
   6. Убедитесь, что установлен флажок Использовать базовую коррекцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базовый крутящий момент рассчитывается программным обеспечением как среднее значение первых 100 пунктов выборки и вычитается из абсолютного максимального значения крутящего момента.
   7. Запишите значение крутящего момента, указанное в разделе Максимальный.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, представленные здесь, не фильтруются; однако при желании в программном обеспечении может быть выбран фильтр.
2. В качестве альтернативы, как описано выше на шаге 6.2, вручную запишите выходной крутящий момент, отображаемый в разделе Max Force, в режиме реального времени в каждой точке/сокращении частоты крутящего момента через окно Анализ результатов.
   1. Убедитесь, что базовая линия вычтена, а силовой канал инвертирован.
   2. Ввод данных в электронную таблицу для расчетов нормализации массы тела (крутящий момент/масса тела в граммах) и построения графиков и статистического анализа, представляющих интерес. Статистическое программное обеспечение использовалось для построения графиков кривой крутящего момента и расчета площади под кривой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные о крутящем моменте измеряются в мН.m (миллиНьютон.метров).
3. Чтобы генерировать кривые столбняка, экспортируйте полные данные с каждой частоты из аналитического программного обеспечения.
   1. Повторите шаги 8.1.1-8.1.4 выше.
   2. Выберите Экспорт данных.
   3. Выберите Необработанные отфильтрованные данные и сохраните в выбранном месте. MATLAB может быть использован для генерации кривых столбняка из экспортируемого текстового файла и/или для дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Код MATLAB для генерации кривой столбняка из текстового файла доступен по запросу.

9. Двухрежимная калибровка рычажной системы

1. Откалибруйте систему перед первоначальным использованием, чтобы обеспечить точные и надежные данные, и периодически повторяйте калибровку с использованием программного обеспечения для сбора данных и известных весов.
   1. Открытое программное обеспечение для сбора данных.
   2. Перейдите на вкладку Настройка и выберите Настройка канала.
   3. Выберите 305C-FP в разделе Мои инструменты.
   4. Нажмите кнопку Калибровать выбранные, чтобы открыть окно Редактора калибровки.
   5. Для калибровки длины введите ряд испытательных напряжений, включая как отрицательные, так и положительные напряжения (например, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 В).
      1. Нажмите кнопку Задать для первой строки.
      2. Нажмите кнопку Прочитать.
      3. Измерьте точную длину рычага в миллиметрах и введите в соответствующую коробку.
      4. Повторите для следующего напряжения.
      5. После записи всех напряжений нажмите рассчитать коэффициенты Cal (записанные в мм/вольт).
   6. Чтобы откалибровать силу, используйте набор известных весов, увеличивающихся в линейной прогрессии.
      1. Отрегулируйте двигатель так, чтобы он опирался на край скамьи или стола с рычагом, параллельным столу и висяшим над краем, чтобы вес висел.
      2. Повесьте первый груз на рычаг с помощью резинки. В разделе Приложенная силавведите известный вес в граммах с учетом массы резинки.
      3. Выберите Чтение.
      4. Повторите по крайней мере для 3 известных весов.
      5. Выберите Рассчитать коэффициент cal .
      6. Чтобы проверить расчет, покажите данные калибровки и соответствие кривой, выбрав Plot Cal.
   7. Для калибровки силы выхода введите калибровочные напряжения (до 10 вольт)
      1. Нажмите кнопку Установить непосредственно рядом с калибровочным напряжением.
      2. Повторите для каждой линии напряжения.
      3. Осторожно надавите на рычаг пальцем до тех пор, пока Force Out не перестанет меняться и рычаг двигателя не начнет двигаться.
      4. Сохраните эту позицию. Выберите Чтение.
      5. Повторите для каждой линии напряжения.
      6. Выберите Рассчитать коэффициент cal .

Результаты

Кривая крутящего момента использует более низкие частоты для получения нескольких изолированных изометрических подергиваний относительно низкого крутящего момента и прогрессирует через все более высокие частоты, что приводит к слиянию подергиваний для изометрического сокращения столбняка, при котором достигается пиковый тетанический крутящий момент. Представленный протокол для коленного удлинивания пикового тетаничного момента кривая сила-частота инициируется при 10 Гц, что вызывает 3 изолированных подергивания. Частичное слияние подергиваний происходит при 40 Гц, а пиковый тетанический крутящий момент достигается между 120-180 Гц(рисунок 5).

На рисунке 6 показаны репрезентативные кривые крутящего момента и частоты коленного сустава у самок мышей C57BL/6. Три отдельные мыши были протестированы на исходном уровне, и эксперимент был повторен на каждой мыши через 2 недели для сравнения для оценки воспроизводимости. Кривые крутящего момента показаны с необработанными значениями крутящего момента(рисунок 6A),а также необработанными значениями крутящего момента, нормированными для массы тела мыши(рисунок 6B). Повторные наблюдения демонстрируют сопоставимые результаты на всех 3 мышах с 2-недельным периодом отдыха между экспериментами. Данные о нормализованном крутящем моменте веса тела следует рассматривать в дополнение к необработанному крутящему моменту, поскольку незначительные колебания веса могут повлиять на функциональную мощность и не учитываются только с необработанным крутящим моментом. Кроме того, нормированные данные о крутящем моменте массы тела облегчают сравнение мышей разных размеров. Крутящий момент также может быть нормализован до мышечной массы во влажном весе или площади поперечного сечения миофибры, как мы ранее показали^16.

На рисунке 7A показана площадь под кривой с использованием нормализованных изометрических данных о крутящем моменте массы тела из полных экспериментов с частотой крутящего момента (10 Гц, 40 Гц, 120 Гц, 150 Гц, 180 Гц, 200 Гц) для 4 отдельных мышей C57BL/6, выделяя аналогичную общую мощность крутящего момента и коэффициенты изменения от 5,6% до 8,8% при повторных экспериментах на одних и тех же мышах. Данные наиболее просто сообщаются как пиковый тетанный крутящий момент(рисунок 7B),который представляет собой максимальное значение крутящего момента от повторяющихся изометрических сокращений столбняка от 120-200 Гц. Пиковый тетанный крутящий момент сопоставим у 6-8-месячных самок мышей C57BL/6(рисунок 7B)с коэффициентами вариации от 4,8% до 8,7% при продольной оценке у тех же мышей. Пиковый тетанический крутящий момент наиболее сопоставим с оценкой прочности золотого стандарта в исследованиях на людях: максимальный изометрический ток.

Кроме того, протокол пикового тетаничного крутящего момента коленного разгибателя коленного сустава является полезным инструментом для обнаружения различий в силе в нескольких моделях мышей. Рисунок 8 демонстрирует резкий контраст между силой разгибателя колена у не травмированной, здоровой 6-месячной мыши C57BL/6 (черная линия) и трансгенной мышиной моделью супрафизиологической гипертрофии, в которой миостатин / GDF8 выбит (синяя линия). Мы также показываем пиковую кривую столбняка у мыши C57BL/6 через 7 дней после хирургической трансекции передней крестообразной связки (ACL-T) (красная линия), демонстрируя почти 50% снижение пикового крутящего момента после травмы, что значительно выходит за пределы коэффициентов вариации, наблюдаемых при повторном тестировании неповредимых мышей. Одновременно с человеческими^{данными17,18,}сила заметно уменьшается при ACL-T. Все мыши являются самами и имеют одинаковый возраст (6-8 месяцев).

Эксперимент Twitch	Усилие/ток (мА)	Крутящий момент (мН•м)
1	50	1.279
2	70	1.341
3	90	1.36
4	110	1.362
5	*130	1.449
6	150	1.436
7	140	1.333

Таблица 1: Пример серии twitch. * обозначает оптимальную амперу/ток.

Частота (Гц)	Крутящий момент (мН•м)
10	1.385
40	1.869
120	*18.765
150	18.375
180	17.97
200	17.548

Таблица 2: Пример данных кривой крутящего момента и частоты. * обозначает пиковый тетанический крутящий момент.

Рисунок 1:Настройка программного обеспечения для сбора данных. Иллюстрация настройки программного обеспечения для сбора данных с помощью Live Data Monitor. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Установка мыши и размещение электродов. (A-B) Положение мыши, получающей анестезию на носовой конусе, на нагреваемой платформе. Верхняя задняя конечность надежно зажата, с задней стороны колена, чтобы обеспечить неограниченное движение в коленном суставе. Моторная рука регулируется таким образом, что колено сгибается примерно на 60°. Двигательная точка бедренного нерва стимулируется игольчатыми электродами для активации сокращения коленных разгибателей. Настройка мыши отображается с бокового вида(A)и вида сверху(B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Определение оптимального размещения электродов для достижения изометрического разгибания колена. Представление повторяющихся отрицательных подергиваний, стимулируемых 50 мА с помощью функции мгновенной стимуляции и просматриваемых в Мониторе живых данных. Красными стрелками обозначены первые три подергивания колена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Репрезентативный подергивание для определения оптимальной мощности. Наименьшая сила силы силы, чтобы вызвать самый высокий изометрический крутящий момент подергивания, должна быть определена для эксперимента с частотой силы и частоты путем повторных экспериментов с подергиванием с прогрессивно увеличиваемой силой силы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Репрезентативные тетанные кривые крутящего момента на протяжении всего эксперимента с частотой крутящего момента для одной и той же мыши. (A) Субмаксимальный изометрический тетанный крутящий момент, полученный при 10 Гц. (B) Субмаксимальный изометрический тетанный крутящий момент при 40 Гц. (C) Пиковый изометрический тетанный крутящий момент на выходе при 120 Гц. (D) Изометрический тетанический крутящий момент при 150 Гц. (E) Изометрический тетанный крутящий момент при 180 Гц. (F) Изометрический тетанный крутящий момент при 200 Гц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6:Репрезентативные данные кривой крутящего момента и частоты. (A-B). Кривая крутящего момента-частоты в 2 различных временных точках (неделя 1 и 3) у 3 отдельных мышей представлена в виде сырого пикового крутящего момента(А)и сырого пикового крутящего момента, нормализованного к массе тела(В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7:Репрезентативная площадь под кривой (AUC) и пиковые тетанические данные крутящего момента. (A)AUC для 4 отдельных мышей, представленные в виде сырого крутящего момента, нормализованного к массе тела. (B) Пиковый тетанный крутящий момент для тех же 4 мышей, представленный как сырой пиковый тетанный крутящий момент, нормализованный к массе тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8:Пиковый тетанический крутящий момент коленных разгибателей в нескольких моделях мышей. Репрезентативные кривые столбняка пикового крутящего момента для модели трансгенной мыши с гипертрофией (GDF8 KO), неповредимой здоровой мыши C57BL/6 (мышь 2) и мыши C57BL/6 через 7 дней после трансекции передней крестообразной связки (ACL-T). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1:Размеры изготовленного на заказ пластика. Вставка красным цветом показывает размер глубины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 1: Подергивание коленного разгибателя в режиме реального времени без моторной руки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. 

Дополнительное видео 2: Замедленное движение коленного разгибателя дергается без моторной руки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. 

Обсуждение

Измерение и анализ мышечной функции в моделях грызунов необходимы для выполнения трансляционных и значимых выводов относительно гистологических и молекулярных адаптаций скелетных мышц, наблюдаемых при физических упражнениях, травмах, заболеваниях и терапевтическом лечении. Мы демонстрируем метод оценки максимальной прочности разгибателя колена надежно и многократно у мышей с использованием коммерчески доступного оборудования, при этом регулируемый пластиковый кусок для удержания нижней задней конечности в передней голени является единственной изготовленной на заказ частью, которая может быть воспроизведена.

Общие инструменты функциональной оценки широко используются для многократной оценки физической работоспособности в пределах одной и той же мыши, такие как беговая дорожка до волевой усталости, тест на производительность ротарода, тест на перевернутое цепляние и тест на прочность захвата. Однако, хотя эти оценки информативны, они включают сердечно-легочный и поведенческий компонент (компоненты), который может запутать опрос нервно-мышечной функции, связанной с этими показателями физической работоспособности. Кроме того, элементы выносливости, координации и равновесия присутствуют во многих из этих функциональных оценок на различных уровнях, ограничивая четкую интерпретацию относительно мышечной силы. Силообразующая способность мышц (мышц) грызуна может быть измерена in vitro, in situ или in vivo. Каждый подход имеет относительные преимущества и ограничения. В частности, при оценке in vitro мышца полностью изолируется и удаляется из тела животного, чтобы не было влияния перфузии или иннервации^19. Это дает хорошо контролируемую среду для определения сократительной способности, но ограничивает размер изучаемой мышцы из-за зависимости от пассивной диффузии кислорода и питательных веществ во время тестирования. Тестирование in situ поддерживает иннервацию и кровоснабжение мышц, но ограничивается единственной терминальной оценкой, как при тестировании in vitro^20. Наконец, тестирование in vivo является наименее инвазивным, когда мышца остается в своей родной среде с чрескожными электродами, вставленными вблизи двигательного нерва для электрической стимуляции мышцы. Сильной стороной подхода in vivo является потенциал для продольных испытаний во^{времени 21,22,23.}

Оценка in vivo пиковой сократимости мышц оптимально измеряет максимальную силу, поскольку нормальная анатомия и физиология мыши остаются нетронутыми, и метод может быть повторен на одной и той же мыши до и после вмешательства или на протяжении всей жизни. В частности, измерение in vivo силы разгибателя колена у мышей является оценкой силы мыши с наибольшим трансляционным значением для исследований на людях, поскольку максимальный крутящий момент разгибателя колена обычно измеряется и считается золотым стандартом теста на прочность у людей с корреляцией с различными функциональными и медицинскими исходами^24,25,26,27 . Кроме того, патология разгибателя коленного сустава наблюдается со старением, а также множество травм и заболеваний^1,2,4,5,6,но оценка влияния этих состояний на силу разгибателя колена продольно у мышей не была легко достижима.

Хотя этот метод полезает для определения пикового крутящего момента коленного разгибателя продольным способом, следует учитывать некоторые ограничения протокола. Более низкие частоты от 40 Гц до 120 Гц были исключены из протокола крутящего момента, что может ограничить способность обнаруживать сдвиги влево или вправо на кривой крутящего момента и частоты с травмой или заболеванием. Однако, используя этот протокол крутящего момента и частоты, мы смогли обнаружить изменения пикового тетанического крутящего момента в модели травмы ACL и между мышами дикого типа C56BL/6 и трансгенной мышиной моделью супрафизиологической мышечной массы(рисунок 8). Отметим, что может быть полезно закрепить электроды руками помощи или аналогичным аппаратом, так как мышечные сокращения могут слегка сдвинуть электроды. Мы не отметили какого-либо явного смещения электродов с прогрессирующими сокращениями; однако нельзя исключать возможность незначительного движения электродов, что может повлиять на стимуляцию мышц. Кроме того, внутримышечная электромиография (ЭМГ) не проводилась совместно с протоколом стимулов; однако включение мер ЭМГ может быть осуществимым, если это желательно и целесообразно для экспериментальной модели, которая представляет интерес.

Оценка силы разгибателя коленного сустава в мышиных моделях ортопедических травм и заболеваний будет способствовать доклиническим исследованиям со значимой трансляционной значимой трансляционной значимой мерой силы. Наш протокол позволяет точно и многократно оценить максимальную прочность разгибателя колена у мышей с коммерчески доступным оборудованием, доступным для любой лаборатории.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse	Aurora Scientific Incorporated	300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus
6100 Dynamic Muscle Control LabBook software	Aurora Scientific Incorporated	DMC v6.000
611A Dynamic Muscle Analysis	Aurora Scientific Incorporated	DMA v5.501
BravMini hair clippers	Wahl Clipper Corporation	ASIN: B00IN24ILE
Eye Lube	Optixcare	Item Number: 142422
Isoflurane	Covetrus	NDC: 11695-6777-2
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems	Item Number: 901806
Prism 8	GraphPad Software, LLC	Version 8.3.0 (328)