Простой и гибкий метод инокуляции для точной оценки фенотипов мучнистой росы и других растений

Резюме

Представлен протокол построения простой системы распределения спор, состоящей из прививочной коробки с сеткой ~50 мкм и прозрачной пластиковой камеры. Это может быть использовано для равномерной прививки растений спорами мучнистой росы, что позволяет точно и воспроизводимо оценивать фенотипы заболеваний исследуемых растений.

Аннотация

Снижение потерь урожая из-за грибковых заболеваний требует лучшего понимания механизмов, регулирующих иммунитет растений и грибковый патогенез, что, в свою очередь, требует точного определения фенотипов заболеваний растений при заражении конкретным грибковым патогеном. Тем не менее, точное фенотипирование заболевания некультурными биотрофными грибковыми патогенами, такими как мучнистая роса, нелегко достичь и может быть ограничивающим скорость шагом исследовательского проекта. Здесь мы разработали безопасную, эффективную и простую в эксплуатации систему фенотипирования заболеваний, используя в качестве примера взаимодействие арабидопсис-мучнистая роса. Эта система в основном состоит из трех компонентов: (i) деревянная прививочная коробка, оснащенная съемной крышкой, установленной с помощью нержавеющей стали или нейлоновой сетки длиной ~ 50 мкм пор для прививки плоской части растений грибковыми спорами, (ii) прозрачная пластиковая камера с небольшим передним отверстием для минимизации утечки спор при проведении инокуляции внутри, и iii) метод дифференциации и распределения спор для равномерной и эффективной прививки. Протоколы, описанные здесь, включают этапы и параметры для изготовления прививочной коробки и пластиковой камеры при низких затратах, а также видеодемонстрацию того, как использовать систему, чтобы обеспечить даже прививку спорами мучнистой росы, тем самым повышая точность и воспроизводимость фенотипирования заболевания.

Введение

Мучнистая роса является одним из самых распространенных и важных заболеваний многочисленных продовольственных культур и декоративных растений¹. Исследования болезней мучнистой росы были очень популярны, о чем свидетельствуют более 10 500 публикаций в качестве результата поиска с «мучнистой росой» в качестве ключевого слова в Web of Science (по состоянию на ноябрь 2020 года). Действительно, мучнистая роса (представленная Blumeria graminis) считается одним из 10 лучших грибковых патогенов журналом Molecular Plant Pathology². Количественная оценка восприимчивости к болезням является необходимым шагом в хар....

протокол

1. Изготовление стандартной коробки для прививки со съемной верхней крышкой, установленной с сеткой

1. Приобретите рулон из 50 мкм нейлоновой мембранной сетки или сетки из нержавеющей стали 48 мкм (рекомендуется) в магазинах. Убедитесь, что заказ достаточно для резки на несколько частей по 14 в х 26 дюймов для замены изношенной сетки.
2. Приобретите один 1/4 в х 2 фута х 4 фута средней плотности ДВП или фанеры и нарежьте два 24-1/2 в х 10 кусках и два 12 в х 10 в кусках для изготовления ящика для прививки. Используйте 8 угловых зажимов для поддержки четырех сторон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если кожух обращен к широкой стороне корпуса, то левая сторона 12 в x 10 пр....

Результаты

Здесь мы представляем новый метод прививки спор мучнистой росы, который прост в приготовлении, эксплуатации и регулировке. На рисунке 1 показана сборка стандартной прививочной коробки с акцентом на марку съемной крышки, установленной с мембранной сеткой 50 мкм.

Обсуждение

Наш метод инокуляции на основе сетчатой коробки имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами инокуляции. Во-первых, он может достичь равномерного распределения спор при правильной эксплуатации, как показано на рисунке 5. Во-вторых, использование сетки ~ 50 мкм, а .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48"	Amazon	NA	For making the lid of an inoculation box
#6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For making an inoculation chamber
#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack)	Home Depot	NA	For making an inoculation chamber
#6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For securing  magnet door catch plates
#8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts	Home Depot	NA	For securing corner braces and door hinge
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;  Size: 17 ½" X 20"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30"	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ "	Professional Plastics	SACR.250CEF	For making an inoculation chamber
1-5/8" cabinet door magnetic catch white	Home Depot	Model #P110-W	For making an inoculation chamber
2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack)	Home Depot	Model #13611	For making an inoculation box & chamber
3" Corner Clamp	Harbor Freight Tools	SKU 63653, 1852, 60589	For making inoculation chamber
3/4"  steel zinc plated corner brace (4-Pack)	Home Depot	Model #13542	For making an inoculation box & chamber
4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles	Home Depot	Model #15184	For making an inoculation box
Fine fan-blender brushes	Michaels Store	M10472846	For inoculation
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel	Home Depot	NA	For making the lid of an inoculation box
Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4');	Home Depot	Model# 1508104	For making an inoculation box
Round glass coverslips with a 500 µm grid	ibidi USA Inc.	10816	For determining  spore density