Подделка генов с помощью CRISPR/Cas9 и сортировка клеток в макрофагах и Т-клеточных линиях

Резюме

Этот протокол использует флуоресцентные репортеры и сортировку клеток для упрощения экспериментов с подделкой в макрофагах и Т-клеточных линиях. Для этих упрощенных экспериментов используются две плазмиды, а именно CRISPR/Cas9- и DsRed2-экспрессивная плазмида и гомологичная рекомбинационная донорская плазмида, экспрессирующая EBFP2, которая постоянно интегрируется в локус Rosa26 в иммунных клетках.

Аннотация

Исследования функциональной геномики иммунной системы требуют генетических манипуляций, которые включают как делецию генов-мишеней, так и добавление элементов к белкам, представляющим интерес. Идентификация функций генов в моделях клеточных линий важна для открытия генов и исследования клеточных механизмов. Тем не менее, генетические манипуляции с иммунными клетками, такими как Т-клетки и клеточные линии макрофагов, с использованием CRISPR / Cas9-опосредованного knock-in, затруднены из-за низкой эффективности трансфекции этих клеток, особенно в состоянии покоя. Для модификации генов в иммунных клетках отбор лекарственной устойчивости и вирусные векторы обычно используются для обогащения клеток, экспрессирующих систему CRIPSR / Cas9, что неизбежно приводит к нежелательному вмешательству клеток. В предыдущем исследовании мы разработали двойные флуоресцентные репортеры, соединенные с CRISPR / Cas9, которые были временно выражены после электропорации. Это техническое решение приводит к быстрой делеции генов в иммунных клетках; однако выбивание генов в иммунных клетках, таких как Т-клетки и макрофаги, без использования селекции лекарственной устойчивости или вирусных векторов является еще более сложной задачей. В этой статье мы показываем, что, используя сортировку клеток для облегчения отбора клеток, временно экспрессирующих конструкции CRISPR / Cas9, нацеленные на локус Rosa26 в сочетании с донорской плазмидой, выбивание гена может быть достигнуто как в Т-клетках, так и в макрофагах без обогащения лекарственной устойчивостью. В качестве примера мы показываем, как экспрессировать человеческий ACE2, рецептор SARS-Cov-2, который отвечает за текущую пандемию Covid-19, в макрофагах RAW264.7, проводя эксперименты. Такие генные клетки могут быть широко использованы для механистических исследований.

Введение

Иммунные клетки имеют решающее значение для защиты от патогенов. Как врожденный, так и адаптивный иммунитет необходимы для клиренса инфекционных веществ и поддержания тканевого гомеостаза^1,2. Модели клеточных линий являются важными инструментами для понимания молекулярных основ иммунной системы млекопитающих; они используются в функциональных анализах in vitro, таких как те, которые моделируют активацию Т-клеток человека, и в определении функции генетических факторов в активации или ослаблении иммунных реакций^3,4. Важно отметить, что иммунная ....

протокол

1. Проектирование и плазмидная конструкция sgRNAs, нацеленных на Локус Rosa26

1. Руководство по проектированию РНК вокруг желаемого места вставки
   1. Убедитесь, что место вставки для мыши Rosa26 (далее обозначается как mRosa26)для экспериментов с выбиванием расположено в первом интроне mRosa26; этот сайт был использован в предыдущих исследованиях^28,29. Для экспериментов с подделкой в клетках человека убедитесь, что место введения находится в локусе ROSA26 человека (далее именуемом hROSA26),который был идентифиц....

Результаты

Следуя описанному выше протоколу для проведения экспериментов в локусе mRosa26 с использованием мышиных макрофагов RAW264.7, мы разработали вектор нацеливания для экспрессии человеческого ACE2, рецептора для вируса SARS-Cov-2(рисунок 2A). Используя аналогичную конструкцию, мы с.......

Обсуждение

В наших экспериментах мы продемонстрировали, как выполнять редактирование в иммунных клетках от конструкции до скрининга и валидации клеток с использованием человеческих Т-клеток Jurkat и мышиных макрофагов RAW264.7 в качестве примеров. Как Т-клеточные, так и макрофаговы клеточные линии уст.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager 600	Ge Healthcare		imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt	MP Biomedicals	194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074	at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1	Merck	MABS146	1.0 μg/mL of working concentration
AscI	New England BioLabs	R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	8457	at 1/1000 dilution
BamHI-HF	New England BioLabs	R3136S
BbsI-HF	New England BioLabs	R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter	Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells	Takara	9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	MP Biomedicals	196055
DNeasy Blood & Tissue Kits	Qiagen	69506	cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose	HyClone	SH30022.01
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
FACSAria™ Fusion	BD Biosciences		equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube	BD Biosciences	352003
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
FlowJo version 10.7	BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	5174	at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	ThermoFisher Scientific	31430	at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane	Millipore	ISEQ00010
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate	MP Biomedicals	194531
LB agar powder	ThermoFisher Scientific	22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL)	Eppendorf, or similar
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix	New England BioLabs	(M0489)	for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	ThermoFisher Scientific	26616
Pipette tip 0.1-20µl	Eppendorf, or similar	0030 075.005
Pipette tip 2-200µl	Eppendorf, or similar	0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl	Eppendorf, or similar	0030 075.064
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
pX458-DsRed2	Addgene	112219
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England BioLabs	M0494S
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]	Abcam	ab108252	at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium	HyClone	SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads	IBA Lifesciences	2-1201-010
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	S34859
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202S
T4 Polynucleotide Kinase	New England BioLabs	M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean	Eppendorf, or similar	0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning	3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate	Corning	3799