Моделирование влияния гемодинамического стресса на циркулирующие опухолевые клетки с помощью шприца и иглы

Резюме

Здесь мы демонстрируем метод применения напряжения сдвига жидкости к раковым клеткам в суспензии для моделирования воздействия гемодинамического стресса на циркулирующие опухолевые клетки.

Аннотация

Во время метастазирования раковые клетки из твердых тканей, включая эпителий, получают доступ к лимфатической и гематогенной циркуляции, где они подвергаются механическому воздействию из-за гемодинамического потока. Одним из таких стрессов, который испытывают циркулирующие опухолевые клетки (CTC), является напряжение сдвига жидкости (FSS). В то время как раковые клетки могут испытывать низкие уровни FSS в опухоли из-за интерстициального потока, CTC подвергаются, без прикрепления внеклеточного матрикса, гораздо более высоким уровням FSS. Физиологически FSS колеблется более 3-4 порядков величины, с низкими уровнями, присутствующими в лимфатических системах (<1 дин /^см2),а самые высокие уровни присутствуют кратковременно, когда клетки проходят через сердце и вокруг сердечных клапанов (>500 дин /^см2). Существует несколько моделей in vitro, предназначенных для моделирования различных диапазонов физиологического напряжения сдвига в течение различных временных интервалов. В данной работе описывается модель для исследования последствий коротких (миллисекундных) импульсов ФСС высокого уровня на биологию раковых клеток с использованием простой системы шприцев и игл.

Введение

Метастазирование, или распространение рака за пределы исходного участка опухоли, является основным фактором, лежащим в основе смертности от рака^1. Во время метастазирования раковые клетки используют кровеносную систему в качестве магистрали для распространения в отдаленные участки по всему телу^2,3. На пути к этим участкам циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) существуют в динамическом микроокружении жидкости, в отличие от их исходной первичной опухоли^3,4,5. Было высказано предположение, что эта микроокружение жидкости является одним из многих барьеров для метастазирования^4. Существует широкое согласие в концепции метастатической неэффективности, т. е. что большинство КТК, поступающих в циркуляцию, либо погибает, либо не образуют продуктивных метастатических колоний^6,7,8. Однако вопрос о том, почему метастазирование является неэффективным с точки зрения отдельного КТК, менее определенно и остается активной областью расследования. ЦОК отделяются от внеклеточного матрикса, лишены растворимых факторов роста и выживания, которые могут присутствовать в первичной опухоли, и подвергаются воздействию иммунной системы и гемодинамических сил совершенно иначе, чем в первичной опухоли^4. Каждый из этих факторов может способствовать плохому выживанию ЦОД, но их относительный вклад неясен. В данной статье рассматривается вопрос о том, как гемодинамические силы влияют на ЦОК.

Изучение влияния гемодинамических сил на ЦОК является довольно сложной задачей. В настоящее время не существует инженерных систем in vitro, которые могли бы воспроизвести всю пространственно-високоритную динамику (от сердца к капиллярам) и реологические свойства сосудистой системы человека. Более того, как ЦОК воспринимают кровеносную систему, не совсем ясно. Экспериментальные данные показывают, что большинство раковых клеток не циркулируют непрерывно, как клетки крови. Скорее, из-за их относительно большого размера (10-20 мкм в диаметре) большинство ЦОК застревают в капиллярных пластах (6-8 мкм в диаметре) в течение переменных промежутков времени (от дней до дней), где они могут умереть, экстравазироваться или быть смещены в следующее капиллярное^{русло 8,9,10,11.} Тем не менее, есть некоторые доказательства того, что размер CTC может быть более неоднородным in vivo, и что меньшие CTC обнаруживаются¹². Поэтому, исходя из расстояния и скорости кровотока, ЦОК могут свободно циркулировать только в течение нескольких секунд между этими периодами ловушки, хотя количественного описания этого поведения не хватает^13.

Кроме того, в зависимости от того, где ЦОК входят в кровообращение, они могут проходить через несколько капиллярных лож в легких и других периферических участках, а также через правое и левое сердце до достижения конечного пункта назначения. По пути CTC подвергаются различным гемодинамическим нагрузкам, включая напряжение сдвига жидкости (FSS), сжимающие силы во время их ловушки в микроциркуляции и, возможно, силы тяги в обстоятельствах, когда они могут проявлять лейкоцитарное катание вдоль стенок кровеносных сосудов^14. Таким образом, как способность моделировать циркуляцию, так и понимание моделируемого поведения КТК ограничены. Из-за этой неопределенности любые результаты из модельных систем in vitro должны быть проверены в экспериментальном организме позвоночных и, в конечном счете, у больных раком.

С вышеупомянутыми оговорками в этой статье демонстрируется относительно простая модель применения FSS к клеткам в суспензии для исследования влияния FSS на CTC, впервые описанную в 2012^{году 15.} FSS возникает в результате трения кровотока о стенку сосуда, что приводит к градиенту параболической скорости в условиях ламинарного потока в более крупных сосудах. Клетки испытывают более высокие уровни FSS вблизи стенок сосудов и более низкие уровни вблизи центра кровеносного сосуда. Вязкость жидкости, скорость потока и размеры трубопровода, через который происходит поток, влияют на FSS, как описано уравнением Хагена-Пуазёя. Это относится к потокам крови, которые ведут себя как ньютоновские жидкости, но не удерживают микроциркуляции. Физиологический FSS колеблется на несколько порядков величины с самыми низкими уровнями в лимфатических системах (<1 дин /^см2)и самыми высокими в областях вокруг сердечных клапанов и атеросклеротических бляшек (>500 дин /^см2)⁵. Среднее напряжение сдвига стенки в артериях составляет 10-70^дин/см2 и 1-6 дин/см2 в венах^16,17.

В сердце клетки могут подвергаться воздействию турбулентных потоков вокруг клапанных листочков, где очень высокий уровень, но очень кратковременный FSS может^{наблюдаться 18,19.} Хотя область биообработки уже давно изучает влияние FSS на клетки млекопитающих в суспензии, эта информация может быть ограниченной ценностью для понимания влияния FSS на CTC, поскольку она обычно фокусируется на гораздо более низких уровнях FSS, применяемых в течение длительного^{времени 20.} Как описано ниже, с помощью шприца и иглы^можноприменять относительно высокий (от десятков до тысяч дин/см2) FSS на относительно короткую (миллисекунды) продолжительность к клеточной суспензии. Начиная с первоначального описания этой модели^15,другие использовали ее для изучения влияния FSS на раковые клетки^21,22,23. Множественные «импульсы» FSS могут быть применены к клеточным суспензиям за короткий период времени для облегчения последующего экспериментального анализа. Например, эта модель может быть использована для измерения способности клеток противостоять механическому разрушению FSS путем измерения жизнеспособности клеток в функции от количества примененных импульсов. В качестве альтернативы, влияние воздействия FSS на биологию раковых клеток может быть изучено путем сбора клеток для различных последующих анализов. Важно отметить, что часть клеточной суспензии зарезервирована в качестве статического контроля для сравнения эффектов FSS с теми, которые могут быть связаны с отслойкой клетки и временем, проведенным в приостановке.

протокол

1. Клеточная подготовка

1. Высвобождайте клетки из чашки для посева тканей при слиянии 70-90%, следуя рекомендуемым рекомендациям для клеточной линии в использовании.
   1. Например, аспирировать питательную среду для клеток PC-3 и промыть 10-сантиметровую чашку клеток 5 мл безкальций- и магния фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
   2. Аспирировать PBS перед добавлением 1 мл 0,25% трипсина с использованием протокола производителя.
   3. После наблюдения за отслойками клеток под инвертным микроскопом добавьте 5 мл среды DMEM:F12, содержащей 10% фетальной бычий сыворотки, чтобы ингибировать трипсин.
2. Поместите клеточную суспензию в коническую трубку.
3. Определите концентрацию клеток и общее количество клеток.
4. Грануляционные клетки путем центрифугирования (300 × г в течение 3 мин), аспирируют супернатант и повторно суспендируют клетки в безсыворочной тканевой культурной среде до 5 × 10⁵ клеток/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы среда для анализа содержала не менее 1,17 мМ^Ca++, поскольку было продемонстрировано, что внеклеточный^Ca++ необходим для клеточной резистентности к FSS^15.

2. Воздействие напряжения сдвига жидкости

1. Перед тем, как подвергнуть ячейки воздействию FSS, вырежьте полистирольную трубку с круглым дном 14 мл на линии 7 мл. Смешайте клеточную суспензию, поместите 5 мл суспензии в разрезаемую трубку и соберите статические контрольные образцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, необходимый для сбора статического образца, зависит от используемого анализа жизнеспособности (см. шаг 3).
2. Втяните клеточную суспензию в шприц 5 мл и прикрепите иглу 30 Г 1/2 дюйма. Отстегните иглу, поместите шприц на шприцевой насос, закрепите шприц и установите скорость потока для достижения желаемого уровня FSS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 показано максимальное напряжение сдвига стенки для различных игл и скоростей потока, а также минимальный уровень FSS в зависимости от размера ячейки (10, 15 и 20 мкм). Осмотрите иглу перед использованием, чтобы убедиться, что она не согнута; если неуверенно, замените иглу новой. Целостность иглы может оказывать значительное влияние на уровень применяемого ФСС.
3. Запустите шприцевой насос и соберите срезанный образец в разрезанной трубке под углом 45°, чтобы уменьшить вспенивание. Соберите образец в зависимости от типа анализа жизнеспособности или потребностей в анализе ниже по течению.
   1. Осторожно извлеките шприц и иглу из шприцевого насоса и используйте плоскогубцы, чтобы удалить иглу из шприца, заботясь о том, чтобы не коснуться иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нескошенные иглы могут использоваться взаимозаменяемо со скошенными иглами в качестве дополнительной меры безопасности.
4. Втяните среженную суспензию обратно в шприц, аккуратно прикрепите иглу плоскогубцами и поместите ее обратно в шприцевой насос.
5. Повторяйте шаги 2.3 и 2.4 до тех пор, пока клеточная суспензия не подверглась воздействию требуемого количества импульсов ФСС.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки способности клеток противостоять механическому разрушению от воздействия FSS клеточная суспензия обычно подвергается 10 импульсам FSS. Однако было продемонстрировано, что клетки начинают подвергаться биологическим адаптациям в ответ на FSS после 2 импульсов^24.

3. Измерение жизнеспособности

ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность может быть оценена с помощью ферментативных анализов (люциферазы, ресазурина и WST-1), подсчета интактных клеток, проточной цитометрии или клоногенных анализов.

1. Для всех показателей жизнеспособности соберите образец перед воздействием FSS клеток.
   1. Для ферментативных анализов возьмите дубликаты 100 мкл аликвот и поместите их в 96-скважинную пластину.
   2. Для проточной цитометрии возьмите одну аликвоту 500 мкл и поместите ее в трубку 1,5 мл.
   3. Для клоногенного анализа собирают 100 мкл аликвоты.
2. Ферментативный анализ
   1. Соберите образцы 100 мкл после 1, 2, 4, 6, 8 и 10 импульсов воздействия FSS и поместите их в 96-скважинную пластину.
   2. Добавьте желаемый субстрат и следуйте протоколу для используемого анализа:
      1. Для ресазурина добавляют 20 мкл раствора 0,15 мг/мл в каждую скважину. Добавьте 20 мкл 0,15 мг/мл раствора ресазурина в скважины, содержащие 100 мкл только среды. Инкубировать в течение 2 ч в инкубаторе культуры тканей при 37 °C. Измерьте поглощение с помощью пластинчатого считывателя, способного считывать флуоресценцию (579 возбуждения / 584 излучения).
      2. Для люцифераз-экспрессивных клеток добавьте 100 мкл 15 мг/мл D-люциферина к 5 мл среды. Добавьте 100 мкл этого раствора к каждой скважине, содержащей клетки. Подождите 5 минут, а затем прочитайте пластину с помощью считывателя, совместимого с люминесценцией.
      3. Для WST-1 добавить 10 мкл WST-1 в каждую скважину, включая скважины, содержащие только среду. Инкубировать в течение 4 ч, а затем считывать поглощение между 420 и 480 нм с помощью пластинчатого считывателя.
   3. Сравните усредненный сигнал от каждого из образцов, подвергшихся воздействию FSS, со усредненным статическим контрольным образцом, чтобы получить процент жизнеспособных клеток.
3. Проточная цитометрия²⁴
   1. Соберите образцы 500 мкл и поместите их в центрифужные трубки по 1,5 мл после 1, 2, 5 и 10 импульсов FSS.
   2. Центрифуги пробы (500 × г в течение 3 мин) и выбрасывают супернатанты.
   3. Повторно суспендировать гранулы 1 мл ПБС без кальция и магния и центрифугировать образцы (300 × г в течение 3 мин).
   4. Присушать гранулы с 500 мкл буфера флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) (PBS с 0,5% бычим сывороточным альбумином и 0,1% азида натрия) с счетными шариками и мембранно-непроницаемыми или жизнеспособными красителями, такими как йодид пропидия (1,75 мкг/мл).
   5. Определить жизнеспособность путем сравнения соотношения жизнеспособных клеток, нормализованных к подсчету шариков, в сстриженных образцах с соотношением статических образцов.
4. Клоногенный анализ
   1. Возьмите 100 мкл статического образца и добавьте 900 мкл питательной среды, чтобы сделать разбавление 1:10.
   2. Возьмите 100 мкл разбавленного образца 1:10 и добавьте 900 мкл питательной среды, чтобы получить окончательное разведение 1:100.
   3. Добавьте 100 мкл образца разбавления 1:100 в каждую из 3 скважин 6-скважинной посуды, содержащей 2 мл питательной среды.
   4. Повторите шаги 3.4.1-3.4.3 с образцами, подвергаемыми воздействию 10 импульсов ФСС.
   5. Дайте клеткам расти в течение 7-10 дней без изменения среды и проверьте образование колоний. Как только колонии клеток ≥50 сформированы, аспирируйте питательную среду, промывайте каждую скважину 1 мл PBS, аспирируйте PBS и фиксируйте в течение 5 минут, используя 1 мл ледяного 70% этанола (EtOH). Важно отметить, что одновременно фиксируются как сеженные, так и статические образцы.
   6. После фиксации образцов аспирируют EtOH и добавляют от 1 до 2 мл кристаллического фиолетового раствора (0,1% кристаллической фиалки в 90%_H2O,10% EtOH) в течение 5 мин.
   7. Промойте избытком воды, и дайте тарелке высохнуть
   8. Подсчитайте колонии (кластеры ≥50 клеток) как для статических, так и для среженных образцов. Сравните отношение среднего числа колоний из сброшенного образца к среднему числу колоний из статического образца для определения жизнеспособности.

Результаты

Ранее было показано, что повышенная устойчивость к механическому разрушению, вызванному FSS, является сохраненным фенотипом через несколько линий раковых клеток и раковых клеток, недавно выделенных из опухолей по сравнению с непереобранными компараторами эпителиальных клеток

Обсуждение

В данной работе демонстрируется применение ФСС к раковым клеткам в суспензии с использованием шприца и иглы. Используя эту модель, было показано, что раковые клетки более устойчивы к коротким импульсам FSS высокого уровня относительно непереформированных эпителиальных клеток

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056
14 mL round bottom tubes	Falcon - Corning	352059
30 G 1/2" Needle	BD	305106
5 mL syringe	BD	309646
96-well black bottom plate	Costar - Corning	3915
Bioluminescence detector	AMI	AMI HTX
BSA, Fraction V	Sigma	10735086001
Cell Titer Blue	Promega	G8081
crystal violet	Sigma	C0775
D-luciferin	GoldBio	D-LUCK
DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Gibco	10010023
Plate Reader	BioTek	Synergy HT
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S2002
Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3005