Анализ молекулярной пружинной константы с помощью зондовой спектроскопии биомембранных сил

Резюме

Биомембранный силовой зонд (BFP) - это метод динамической силовой спектроскопии in situ (DFS). BFP может быть использован для измерения пружинной постоянной молекулярных взаимодействий на живых клетках. Этот протокол представляет весенний постоянный анализ молекулярных связей, обнаруженных BFP.

Аннотация

Биомембранный силовой зонд (BFP) недавно появился как наноинструмент для нативной клеточной поверхности или динамической силовой спектроскопии in situ (DFS), который может измерять кинетику одномолекулярного связывания, оценивать механические свойства взаимодействий лиганд-рецептор, визуализировать динамические конформационные изменения белка и более захватывающе разъяснять механизмы механозонирования клеток, опосредованные рецепторами. Совсем недавно BFP был использован для измерения пружинной постоянной молекулярных связей. Этот протокол описывает пошаговую процедуру выполнения анализа DFS с константой молекулярной пружины. В частности, обсуждаются два режима работы BFP, а именно режимы Bead-Cell и Bead-Bead. Этот протокол фокусируется на получении пружинных констант молекулярной связи и клетки из необработанных данных DFS.

Введение

В качестве метода DFS с живыми клетками BFP разрабатывает эритроцит человека (RBC; Рисунок 1) в сверхчувствительный и настраиваемый преобразователь силы с совместимым постоянным диапазоном пружин при 0,1-3 пН/нм^1,2,3. Для зондирования взаимодействия лиганд-рецептор BFP позволяет проводить измерения DFS при ~1 пН (10-12 Н), ~3 нм (10-9^м) и ~0,5 мс (10-3 с) в силе, пространственном и временном разрешении ^4,5. Его экспериментальная конфигурация состоит из двух противоположных микропипет, а именно зонда и мишени. Микропипетка Probe аспирирует эрицит, и шарик приклеивается на его вершине посредством взаимодействия биотин-стрептавидин. Шарик покрыт интересующих лигандами(рисунок 1А). Микропипетка-мишень аспирирует либо клетку, либо бусину, несущую интересующих рецептор, соответствующий режимам Бисероплетение(Рисунок 1В)и Бусина-Бусина(Рисунок 1С),соответственно^5.

Построение, сборка и экспериментальные протоколы DFS были подробно описаны^{ранее 1,6.} Вкратце, сенсорный цикл BFP состоит из 5 этапов: подход, ущемление, контакт, втягивание и диссоциат(рисунок 1D). Горизонтальная вершинная позиция RBC обозначается как Δx_RBC. В начале безударная (с нулевой силой) деформация RBC Δx_RBC равна 0(таблица 1). Затем мишень приводится в движение пьезотранслятором для впрызания и втягивания из шарика зонда(рисунок 1D). Зонд RBC сначала сжимается мишенью с отрицательной деформацией RBC Δx_RBC < 0. В событии Связи стадия втягивания переходит из сжимающей в растягиваемую фазу с положительной деформацией RBC Δx_RBC > 0(рис. 2C и D). Согласно закону Гука, несущая сила BFP может быть измерена как F = k_RBC × Δx_RBC, где k_RBC (Таблица 1)— константа пружины RBC BFP. При разрыве связи и завершении цикла одного касания шарик зонда возвращается в положение с нулевой силой при Δx_RBC = 0(рисунок 1D).

Чтобы определить k_RBC,мы измеряем и регистрим радиусы внутреннего отверстия микропипетки зонда(R_p),RBC(R₀₎и круговой области контакта(R_c)между RBC и шариком зонда(рисунок 1A). Затем k_RBC вычисляется по модели Эвана (Eq. 1) 7^,8 с использованием программы LabVIEW, которая действует как виртуальный инструмент (VI) для работы BFP(рисунок S1A)^8,9.

(Экв. 1)

Установив БФП и получив исходные данные DFS, мы представляем, как анализировать пружинную константу пары лиганд-рецептор или клеток. Исходные данные DFS о взаимодействии гликозилированного белка Thy-1 и клетки K562, несущей интегрин, α₅β₁ (Thy-1-α₅β_1; Фиг.3А и 3В)10и фибриноген и интегрин с шариковым покрытием α_IIbβ₃ (FGN-α_IIbβ_3; Рисунок 3C) ^11,12 были использованы для демонстрации режимов анализа Бисероплетняя клетка и Бисероплета, соответственно.

Экспериментальная подготовка BFP
Для получения подробной информации об экспериментальной подготовке и приборах BFP, пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованным протоколам^3. Короче говоря, человеческий эриртикат был биотинилирован с использованием Biotin-PEG3500-NHS в буфере углерода / бикарбоната. Интересуемые белки были ковалентно соединены с боросиликатными стеклянными шариками с использованием MAL-PEG3500-NHS в фосфатном буфере. Для прикрепления к биотинилированному эрициту шарик зонда также покрывают стрептавидином (SA) с использованием MAL-SA. Пожалуйста, ознакомьтесь с Таблицей материалов и Таблицей 2.

Для сборки BFP(рисунок 1, слева)третья микропипетка, названная «Помощник», будет использоваться для доставки шарика зонда и приклеивания его к вершине^{RBC 1,3.} Ковалентное взаимодействие между шариком зонда с покрытием SA и биотинилированным RBC намного сильнее, чем интересуящее связь лиганд-рецептор. Таким образом, диссоциатная стадия может быть интерпретирована как разрыв связи лиганд-рецептор, а не отделение шарика зонда от эрицита.

протокол

1. Получение анализируемых событий DFS

1. Запустите эксперимент в программном обеспечении (например, LabVIEW VI) для управления BFP и настройки параметров(рисунок S1A).
2. Наблюдайте за повторяющимися касаниями шариков/ячеек в программном обеспечении для монитора BFP(рисунок S1B).
3. Проверьте и достигните частоты сцепления ≤ 20% в течение первых 50 касаний, настроив силу столкновения и время контакта, с помощью которых он гарантирует, что ≥ 89% событий сцепления DFS опосредованы одиночными связями^12,13,14.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой пары Бисероплетения и Ячейки/Бусины мы выполняем 200 повторяющихся сенсорных циклов. Для получения качества публикуемых данных мы обычно выполняем n ≥ 3 пары Бисера-Бусина или Бисер-Ячейка.
   1. Сохраните данные в виде Force vs. Time в папку, направленную пользователем, к концу каждой пары, запрашиваемую программным обеспечением для управления BFP и настройки параметров.
4. Соберите необработанные данные Force vs. Time событий Bond, как показано на рисунке 2A,используя платформу сбора BFP(рисунок S1C).
   1. Откройте программное обеспечение для анализа данных BFP. Нажмите на желтый значок папки и выберите соответствующий файл необработанных данных, дважды щелкнув по ним.
5. Запустите программу, а затем нажмите кнопку вверх и вниз, чтобы переключаться между событиями. Используйте критерии исключения выбросов(рисунок S2),чтобы отсеять недопустимые события. Выберите экспортируемый тип данных в формате Force vs. Time и нажмите кнопку Экспорт данных графиков.

2. Преобразуйте кривую «Сила против времени» в кривую «сила против смещения»

1. Экспортируйте сегмент данных, соответствующий этапу Retract, в электронную таблицу(рисунок 2A, квадратная область),которая имеет отношение к анализу пружинной константы.
2. Построение кривой силы и времени с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами. Чтобы получить кривую «Сила против смещения», преобразуйте значениявремени (рисунок 2A, ось x)в значения полного смещения (Δx_tot)путем умножения значений времени на скорость пьезодвижения (т.е. 4000 нм/с по заданному значению).
3. Обнулите первую точку данных, вычитая наименьшее значение смещения из каждого приобретенного значения смещения. Это горизонтальное преобразование не влияет ни на восходящие склоны стадии втягивания, ни на последующее вычисление пружинной константы.
4. Примечательно, что BFP рассматривается как последовательная пружинная система, в которой Δx_tot (Таблица 1)суммируют деформации RBC, Δx_RBC (Таблица 1),молекулярную связь, Δx_mol (Таблица 1),и Целевую ячейку, Δx_ячейку (Таблица 1),как Экв. 2:
   (Экв. 2)
5. Построй кривую «Сила (F) против смещения (Δx_tot)», как показано на рисунке 2B.

3. Весенний cnstant анализ бисерно-клеточного режима

1. В кривой «Сила против смещения» можно идентифицировать два различных помоя, где каждый из них может представлять фазу сжатия и фазу растяжений. Подогнать линию регрессии к каждой группе данных(рисунок 2B),где больший линейный наклон соответствия представляет собой общую константу пружины на фазе сжатия(рисунок 2B, красный),обозначаемую как k₁ (таблица 1); и меньший линейный наклон соответствия представляет собой общую константу пружины на фазе растяжений(рисунок 2B, синий),обозначаемую как k₂ (таблица 1).
2. Для пружин, соединенных последовательно на этапе 2.2 описания, выражают обратную величину полной_{константы пружины,} ktot(таблица 1),как сумму пружинной константы, обратной РБК, k_RBC (Таблица 1),молекулярной связи, k_моль (Таблица 1),и Целевой ячейки, k_ячейки (Таблица 1). Во время сжимающей фазы режима «шарик-клетка» молекулярная связь не растягивается, поэтому k_моль не принимается во внимание. Обратная k _tot в этом сценарии (1/k₁₎выражается как
   (Экв. 3).
   В примере данных предварительно определено k RBC (по умолчанию 0,25 пН/нм). k_ячейка может быть получена из экв. 3 с приобретенными k₁ и k_RBC (рис. 3B).
3. Во время фазы растяживания образуется адгезия между парой лиганд-рецептор. Выражают обратнуюk_tot в этом сценарии (1/k₂₎как
   (Экв. 4)
   где k₂ (Таблица 1)представляет собой общую постоянную пружины во время фазы растязывки.
4. Получить k_моль из вычитания 1/k₁ из 1/k₂ (сравните Eq. 3 и Eq. 4).

4. Весенний постоянный анализ режима бисера-бисера

1. Подогнать линию регрессии к данным фазы сжатия для получения k₁ (аналогично рисунку 2B, красный). Следует отметить, что в режиме Бисера-Бусина ячейка Target заменяется стеклянной бусиной, покрытой интересующих рецептором(рисунок 1C). Поскольку деформация шарика незначительна, член_{1/k-клетки} может быть удален из Eq. 3 и Eq. 4 соответственно. Обратный _{k-тот фазы} сжатия (1/k₁₎может быть выражен как:
   (Экв. 5)
2. Подогнать линию регрессии к данным фазы растязания для получения k₂ (аналогично рисунку 2B, синий). Обратная _k-тота растягиваемой фазы (1/k₂₎может быть выражена как:
   (Экв. 6)
3. Получить k_моль из вычитания 1/k₁ из 1/k₂ (сравните Eq. 5 и Eq. 6).

Результаты

В этой работе мы продемонстрировали протокол анализа пружинных констант BFP. Для режима анализа «шарик-клетка» мы проанализировали k_моль молекулярной связи между гликозилированным белком Thy-1, покрытым на шарике зонда, и интегрином α₅β_1, экспрессируемым на клетке Tar...

Обсуждение

Таким образом, мы предоставили подробный протокол анализа данных для предварительной обработки необработанных данных DFS и получения констант молекулярной пружины в режимах анализа BFP Bead-Bead и Bead-Cell. Представлены биомеханические модели и уравнения, необходимые для определения молекуля?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)	Uct, Specialties, llc	4420-74-0	Glass bead functionalization
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Phosphate buffer preparation
BFP data acquisition VI	LabVIEW		BFP control and parameter setting
BFP data analysis VI	LabVIEW		BFP raw data analysis
Biotin-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	RBC biotinylation
Borosilicate Glass beads	Distrilab Particle Technology, Netherlands	9002	Glass bead functionalization
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand functionalization
Camera VI	LabVIEW		BFP monitoring
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021	Tyrode’s buffer preparation
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode’s buffer preparation
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Glass bead functionalization
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tyrode’s buffer preparation
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tyrode’s buffer preparation
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Phosphate buffer preparation
Streptavidin-Maleimide	Sigma-Aldrich	S9415	Glass bead functionalization